Summary
O protocolo descreve um método para introduzir diversidade genética controlável no genoma do vírus da hepatite C combinando síntese completa de RNA mutante usando PCR propenso a erros e genética reversa. O método fornece um modelo para seleção de fenótipos e pode ser usado para genomas de vírus de RNA de sentido positivo de 10 kb longos.
Abstract
A falta de um método conveniente para a geração iterativa de diversas variantes virais de comprimento total tem impedido o estudo da evolução dirigida em vírus de RNA. Ao integrar uma PCR propensa a erros no genoma de RNA e genética reversa, a mutagênese de substituição aleatória do genoma pode ser induzida. Desenvolvemos um método usando esta técnica para sintetizar diversas bibliotecas para identificar mutantes virais com fenótipos de interesse. Esse método, chamado síntese completa de RNA mutante (FL-MRS), oferece as seguintes vantagens: (i) a capacidade de criar uma grande biblioteca por meio de uma PCR altamente eficiente e propensa a erros em uma etapa; (ii) a capacidade de criar grupos de bibliotecas com diferentes níveis de diversidade genética, manipulando a fidelidade da DNA polimerase; (iii) a criação de um produto de PCR completo que possa servir diretamente como um modelo para a síntese de RNA mutante; e (iv) a capacidade de criar RNA que pode ser entregue em células hospedeiras como um pool de entrada não selecionado para rastrear mutantes virais do fenótipo desejado. Descobrimos, usando uma abordagem de genética reversa, que a ERM-FL é uma ferramenta confiável para estudar a evolução dirigida por vírus em todos os estágios do ciclo de vida do vírus da hepatite C, isolado de JFH1. Esta técnica parece ser uma ferramenta inestimável para empregar a evolução dirigida para entender a adaptação, a replicação e o papel dos genes virais na patogênese e resistência antiviral em vírus de RNA de sentido positivo.
Introduction
O rastreamento genético antecipado começa com um fenótipo viral de interesse e, em seguida, por meio do sequenciamento de seu genoma e comparação com o da cepa original, tenta identificar a(s) mutação(ões) causadora(s) desse fenótipo. Em contraste, nos rastreamentos genéticos reversos, mutações aleatórias são introduzidas em um gene alvo, seguidas por um exame do(s) fenótipo(s) resultante(s)1. Para a abordagem da genética reversa, a mutagênese in vitro é a técnica mais amplamente utilizada para criar um pool de variantes que são posteriormente rastreadas para fenótipos de interesse. Várias ferramentas genéticas têm sido relatadas para a obtenção de mutagênese aleatória genômica de vírus de RNA, incluindo PCR propenso a erros (ep-PCR)2,3, extensão circular da polimerase4 e mutagênese de inserção Mu-transposon 5,6,7. Os dois últimos métodos produzem bibliotecas com diversidade limitada de sequências e são propensos à introdução de grandes inserções e deleções, que são altamente letais para vírus e limitam severamente a recuperação de variantes virais infecciosas.
A EP-PCR é uma conhecida e poderosa técnica de mutagênese amplamente utilizada na engenharia de proteínas para gerar enzimas mutantes para a seleção de fenótipos com propriedades desejadas, tais como maior estabilidade térmica, especificidade do substrato e atividade catalítica 8,9,10. Esta técnica é de fácil execução, pois requer equipamentos simples, não envolve manipulações tediosas, utiliza reagentes disponíveis comercialmente e é rápida; Além disso, gera bibliotecas de alta qualidade.
Aqui, desenvolvemos um novo método para síntese completa de RNA mutante (FL-MRS) para gerar genomas completos do vírus da hepatite C (HCV) através da integração de ep-PCR, que induz mutagênese de substituição aleatória do genoma e genética reversa. Mesmo uma inserção ou deleção de nucleotídeo único é altamente deletéria para vírus de RNA de sentido positivo ([+]ssRNA); portanto, a mutagênese de substituição baseada em PCR é o método preferido para a geração iterativa de grandes e diversas bibliotecas de genomas completos de RNA (+)ss com boa viabilidade.
FL-MRS é uma abordagem direta que pode ser aplicada a qualquer vírus de RNA de sentido positivo com um comprimento de genoma de ~10 kb através do design meticuloso de um conjunto de primers que se liga ao clone de cDNA viral. pJFH1 é um clone de cDNA infeccioso que codifica o genótipo 2a do HCV e pode recapitular todas as etapas do ciclo de vida do vírus. Usando a abordagem da FL-MRS, demonstramos a síntese de bibliotecas do genoma completo mutagenizadas aleatoriamente (bibliotecas mutantes [MLs]) para produzir variantes JFH1 competentes em replicação para as quais não havia conhecimento prévio das propriedades associadas às mutações. Após a exposição a um antiviral, algumas das variantes virais rapidamente superaram a pressão medicamentosa com a mudança fenotípica desejada. Usando o protocolo descrito aqui, uma infinidade de variantes virais pode ser gerada, criando oportunidades para estudar a evolução dos vírus (+)ssRNA.
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Protocol
NOTA: A cepa JFH1 (WT) usada aqui foi um presente gentil de Takaji Wakita, Instituto Nacional de Doenças Infecciosas. A linhagem celular de hepatoma humano, Huh7.5, foi um presente gentil de Charles Rice, da Universidade Rockefeller. Um esquema do método é mostrado na Figura 1.
1. Mutagênese de substituição genômica ampla de JFH1 usando PCR propenso a erros
- Para a realização da ep-PCR, preparar a mistura mestre para quatro conjuntos de experimentos com os primers J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' e J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (Figura 1A), juntamente com os componentes da reação descritos na Tabela 1 sem o molde pJFH1 (plasmídeo isolado da cepa JFH1).
- Aliquot a mistura mestre em quatro tubos, adicione 100 ng, 50 ng, 25 ng e 10 ng de molde nos tubos individuais e ajuste o volume total da reação para 50 μL. Aplicar as condições de ciclagem descritas na Tabela 2 para amplificar um fragmento de 9736 pares de bases (pb) que compreende o promotor T7 e o genoma completo do HCV (Figura 2).
NOTA: O produto ep-PCR deve conter a sequência promotora T7 para facilitar a transcrição in vitro do genoma viral. Portanto, o primer anterior deve estar localizado a montante do promotor T7 do clone de cDNA viral, e a sequência de primers reversos deve terminar na extremidade 3' do genoma do vírus para facilitar o escoamento da transcrição. Otimizar cada componente da reação ep-PCR dentro da faixa recomendada pelo fabricante da Taq DNA polimerase para obter amplificação de alto rendimento. Além de quantidades variadas de moldes, dNTPs desbalanceados (especialmente baixa concentração de dATP e/ou dGTP) também podem ser usados para aumentar a diversidade no comprimento de genomas virais de 6-8 kb de comprimento3. - Estimar o produto da ep-PCR amplificado carregando volumes iguais dos produtos da PCR (5 μL) e comparando com quantidades conhecidas de escada de DNA de 1 quilobase (kb) executando uma eletroforese em gel de agarose à base de Tris-acetato de 0,8% (TAE)11. Purificar o produto usando um kit de purificação de coluna conforme indicado pelo fabricante.
- Estimar a concentração do produto purificado medindo a absorbância a 260 nm utilizando um espectrofotômetro de microvolume12. Concentrar a vácuo o produto ep-PCR, se necessário, para obter uma concentração do produto ≥100 ng/μL.
NOTA: Uma estimativa mais precisa pode ser feita carregando diluições seriadas de duas vezes do produto ep-PCR e comparando suas intensidades com as quantidades conhecidas de 1 kb de escada de DNA.
2. Síntese de RNA viral
- Estabelecer uma reação de 40 μL para digerir 5 μg de pJFH1 clonal com 4 U da enzima XbaI a 37 °C por 2 h, seguida de purificação em coluna e medição da absorbância a 260 nm em espectrofotômetro de microvolume12. Estabelecer uma reação de transcrição in vitro de 20 μL do produto ep-PCR purificado em coluna ou clonal-pJFH1 (WT) usando um sistema de produção de RNA em larga escala disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
- Em um tubo de microcentrífuga de 200 μL, misturar aproximadamente 1 μg do produto purificado da ep-PCR (bibliotecas mutantes) ou XbaI digerido clonal-pJFH1, 10 μL de tampão 2x contendo ribonucleotídeos e 2 μL da mistura enzimática T7. Misture todos os componentes e gire brevemente os componentes. Incubar a mistura reacional a 37 °C por 45 min, seguida da adição da enzima DNase 1 U livre de RNase e incubação a 37 °C por 30 min (Figura 1C).
- Purificar o RNA sintetizado in vitro usando um kit de limpeza de RNA de acordo com as instruções do fabricante, eluir em 40 μL de água livre de RNase e DNase e estimar a concentração do RNA purificado medindo a absorbância a 260 nm usando um espectrofotômetro de microvolume12. Faça alíquotas conforme necessário (5 μg ou 2 μg) para evitar o congelamento-descongelamento e armazene-as a -80 °C. Verificar a integridade e o tamanho dos transcritos virais usando 2 μg de RNA para uma eletroforese em gel de agarose MOPSformaldeído 0,8% 13 (Figura 3).
3. Estimativa da proporção de mutações em produtos de ep-PCR (bibliotecas mutantes)
NOTA: Nesta etapa, a proporção de nucleotídeos sofreu mutação por subclonagem do produto obtido na etapa 2. foi estimada para demonstrar a vantagem de empregar ep-PCR para criar heterogeneidade genética usando duas bibliotecas mutantes do genoma completo (ML50 e ML25) e RNAs virais clonais derivados de pJFH1. A proporção de mutações foi estimada no gene NS5A do HCV, que também foi o gene de leitura fenotípica (resistência a drogas) neste estudo.
- Estabelecer uma reação de síntese de cDNA de 20 μL adicionando aproximadamente 1 μg do RNA viral sintetizado na etapa 2., 5 μM do primer reverso 5'-GTGTACCTAGTGTGTGTGCCGCTCTA-3', e 200 U transcriptase reversa de acordo com as recomendações do fabricante.
- Usando o cDNA, amplificar um fragmento de 2571 pb que compreende o gene NS5A completo. Para isso, prepare uma mistura reacional contendo 0,5 μM para os primers 5272F e 7848R (concentração final; Tabela 3), 1,5 mM MgCl2, 1x tampão de PCR e 1 U de alta fidelidade Taq polimerase em um volume total de 50 μL e executar um ciclo de amplificação usando as condições descritas na Tabela 4.
- Execute o produto em um gel de agarose à base de TAE 0,8% para confirmar o tamanho do produto de 2571 pb e, em seguida, purifice o produto usando um kit de purificação de coluna conforme indicado pelo fabricante. Eluir o produto purificado em coluna em 40 μL de água estéril.
- Para adicionar uma saliência de 3' A ao produto, adicione 0,5 μM de dATP e 1 U de Taq DNA polimerase de baixa fidelidade e incube todo o produto de PCR a 70 °C por 30 min, juntamente com 1x tampão de PCR e 1,5 mM MgCl2 (concentração final). Purificar a mistura usando um kit de purificação de coluna conforme indicado pelo fabricante
NOTA: Alternativamente, excise o produto de ~9,7 kb de comprimento do gel da etapa 1.4. e realizar clonagem utilizando um kit disponível comercialmente para clonagem de produto de PCR longo de acordo com as instruções do fabricante ou realizar NGS do produto ep-PCR usando uma plataforma Illumina2. - Estabelecer uma reação de ligadura adicionando 5 μL de tampão de ligadura 2x, 50 ng do DNA vetorial T, aproximadamente 3 vezes o excesso molar do DNA de inserção sintetizado na etapa 3.4., 3 unidades Weiss de DNA ligase T4 e água livre de nucleases a um volume total de 10 μL. Incubar esta reação à temperatura ambiente durante 3 h e, em seguida, adicionar 100 μL de Escherichia coli DH5α com o ADN ligado; choque térmico das células a 42 °C por 35 s (Figura 1B).
- Adicionar 1 ml de meio Luria-Bertani (LB) (sem antibiótico) e incubar com agitação suave durante 1 h a 37 °C para recuperação. Centrifugar a suspensão celular a 13.800 x g, descartar o sobrenadante e ressuspender em 200 μL de meio LB fresco.
- Placa 100 μL das células DH5α de E. coli transformadas em uma placa LB contendo 50 μg/mL de ampicilina e incubar a 37 °C por 16 h. Montar minipreps de 25-30 colônias em 5 mL de meio LB + 50 μg/mL de ampicilina e crescer durante a noite a 37 °C.
- No dia seguinte, extrair os plasmídeos com um kit de purificação de plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante e realizar a digestão da enzima de restrição em volume de 10 μL com 200 ng dos plasmídeos isolados, 2 U de EcoR1 e 1x tampão de restrição para todas as colônias.
- Após incubar as misturas de digestão a 37 °C por 3 h, resolver os produtos em gel de agarose à base de TAE 0,8% para confirmar a inserção de DNA plasmidial.
- Realizar o sequenciamento de Sanger dos plasmídeos de 25 clones positivos utilizando os primers M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF e 6748-SPF (Tabela 3) para determinar a proporção de mutações (expressa como a proporção de nucleotídeos mutados) nos RNAs virais derivados das bibliotecas e pJFH1 clonal (Figura 1B e Figura 4).
4. Transfecção de RNA viral da linhagem celular Huh7.5
OBS: Utilizar materiais de cultura de tecidos livres de RNase/DNase e trabalhar em gabinete de biossegurança estéril classe II. Trabalhar na instalação de contenção recomendada de acordo com as diretrizes de biossegurança da organização.
- Manter as células Huh7.5 incubando em estufa a 5% CO2 a 37 °C num frasco de cultura de tecidos T75cm2 contendo 15 ml de meio de Dulbecco modificado completo (DMEM) suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml; Figura 1D).
- Divida as células em uma proporção de 1:3 quando a confluência atingir 90%. Lavar as células com 1x solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS; pH 7,4). Adicionar 5 ml de solução de tripsina-EDTA a 1x para cobrir completamente a camada celular, agitar suavemente o balão e, em seguida, incubar o balão a 37 °C durante 5 minutos.
NOTA: O tempo de incubação pode variar; incubar as células até que a camada celular se desprenda completamente da superfície do frasco de cultura celular. - Adicionar 10 mL de DMEM completo pré-aquecido 1x, dispersar as células por pipetagem repetida e coletar a suspensão celular em um tubo centrífugo estéril de 15 mL ou 50 mL. Centrifugar a suspensão celular a 252 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Eliminar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 6 mL de DMEM completo e incubar as células a 37 °C em estufa umidificada com CO2 a 5%.
- Para manutenção contínua de células Huh7.5 virgens, transfectadas ou infectadas por vírus, repita a etapa 4.2. e passo 4.3.
- 1 dia antes da transfecção, dividir as células conforme descrito nas etapas 4.1.-4.3., contar o número de células viáveis usando um hemocitômetro, semear as células Huh7.5 a uma densidade de 0,6 x 106 em placas de 35 mm em 2 mL de DMEM completo e incubar as células a 37 °C em uma estufa umidificada com 5% de CO2.
- No dia seguinte, prepare o complexo transcrito-lipídico. Para fazer isso, diluir 10 μL de reagente de transfecção em 50 μL de meio essencial mínimo e, separadamente, diluir 5 μg de transcritos virais em 50 μL de meio essencial mínimo.
- Incubar ambas as misturas à temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, misturá-las num único tubo de microcentrífuga estéril e incubar ainda mais a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos para formar o complexo transcrito-lipídico.
- Após 16 h de incubação celular, retirar o meio de cultura da placa de cultura, lavar as células 2x com PBS 1x pré-aquecido e adicionar 1,5 mL de meio essencial mínimo. Adicione lentamente o complexo transcrito-lipídico ao prato e gire suavemente com as mãos para garantir uma distribuição uniforme dos complexos.
- Incubar as células em estufa de CO2 a 5% a 37 °C durante 10 horas. Em seguida, remova o meio, lave as células transfectadas 2x com 1 mL de PBS 1x pré-aquecido e adicione 2 mL de DMEM completo.
5. Produção de vírus
- Dividir as células Huh7.5 transfectadas a cada 2 dias ou 3 dias quando atingirem 90% de confluência. Colete sobrenadantes de vírus a cada divisão e armazene-os a -80 °C para análise adicional.
- A cada divisão, monitore a propagação do vírus usando um ensaio de formação de foco (FFA), conforme descrito na etapa 6.2. Colher o vírus até que a disseminação do vírus atinja >80% das células transfectadas (Figura 1D).
NOTA: Divida as células transfectadas na proporção de 1:1 para as primeiras passagens para resgatar o número máximo de variantes virais. A disseminação do vírus diminui e a viabilidade diminui com o aumento das proporções de mutações nos MLs do genoma completo2.
6. Quantificação dos títulos virais
- Quantificação do RNA viral
- Isolar o RNA viral de 140 μL de sobrenadantes de cultura usando um kit de isolamento de RNA viral de acordo com as instruções do fabricante.
- Configure uma reação qRT-PCR de 10 μL usando um kit comercial de qRT-PCR de acordo com as instruções do fabricante. Utilizar o primer forward R6-130-S17, o primer reverso R6-290-R19 (concentração final 0,2 μM cada) e a sonda R9-148-S21FT (concentração final 0,3 μM) para quantificação do RNA do HCV (Tabela 3). Defina as condições de execução como 48 °C por 20 min, 95 °C por 10 min e, em seguida, 45 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min.
NOTA: A sonda deve conter o corante repórter fluorescente 6-carboxifluoresceína (FAM) e o corante quencher 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA) nas extremidades 5' e 3', respectivamente. - Execute reações em uma máquina de PCR em tempo real. Configure controles negativos, ou seja, RNA extraído dos sobrenadantes de células infectadas e água livre de nucleases simultaneamente para garantir a ausência de contaminação cruzada.
- Em paralelo, gerar uma curva padrão usando um número de cópias conhecidas diluído em série de 10 vezes de transcritos do HCV (1 x 10,8 a 0) para a quantificação do RNA viral. Realizar a quantificação em triplicata (Figura 1D).
- Quantificação de títulos de vírus infecciosos usando dose infecciosa de cultura de tecido a 50% (TCID50)
- Aproximadamente 16 h antes da adição do vírus, placa 6,5 x 103 células Huh7,5 poço em uma placa de 96 poços e incubar as células a 37 °C em uma incubadora de 5% CO2 .
- Em um gabinete classe II de biossegurança, realizar diluições seriadas de 10 vezes (1 mL cada) cobrindo diluições de 1 x 10−1 a 1 x 10−6 (oito diluições) do vírus colhido (obtidas quando a disseminação do vírus atinge >80% das células, conforme descrito na etapa 5). Adicionar 100 μL/poço (com oito repetições) do vírus diluído para infectar as células Huh7.5 e manter a placa em estufa a 37 °C com 5% de CO2 por 3 dias.
- Após 3 dias, lavar as células infectadas 3x com 0,1 mL de PBS cada vez e fixar e permeabilizar as células com 0,1 mL de metanol gelado a −20 °C por 20 min. Lave os poços com 1x PBS 3x e depois 1x com PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
- Após a remoção do PBS-T, bloquear as células por 30 min à temperatura ambiente com 0,1 mL de albumina de soro bovino (BSA) a 1% contendo 0,2% de leite desnatado em PBST. Remover a solução de bloqueio e tratar as células durante 5 minutos com 0,1 ml de 3% H 2 O2preparado em PBS 1x.
- Novamente, lave as células 2x com 1x PBS e 1x com PBS-T, em seguida, adicione 50 μL/poço de anti-NS5A 9E10 mAb (1:10000, estoque 1 mg/mL; um presente gentil de Charles Rice, The Rockefeller University), e incube à temperatura ambiente por 1 h. Lave os poços novamente 3x com 1x PBS e 1x com PBS-T.
- Adicionar 50 μL/poço de IgG secundária anti-camundongo conjugada com HRP de cabra (1:4000), incubar por 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, remover o anticorpo não ligado lavando os poços com 0,1 mL de 1x PBS.
- Adicionar 30 μL de substrato de cor DAB (tetracloridrato de diaminobenzidina) e incubar a placa com balanço suave por 10 min à temperatura ambiente. O substrato desenvolve um precipitado marrom na superfície do poço que indica o antígeno NS5A do HCV. Retire a solução DAB e lave os poços 2x com 1x PBS e 1x com água destilada. Adicionar 100 μL de PBS contendo azida sódica a 0,03%.
- Examine cada poço sob um microscópio de luz invertida usando uma objetiva de 10x. Conte o número de poços positivos. Se o poço contiver uma ou mais células NS5A-positivas, então é positivo; se o poço mostrar ausência de células NS5A positivas, então é negativo. Utilizar uma calculadora de Reed e Muench para estimar a diluição do desfecho que infecta 50% dos poços (TCID50)14,15. Uma recíproca da diluição necessária para produzir o TCID50 é o título de infectividade do vírus (unidades formadoras de focos) por unidade de volume.
NOTA: Os títulos de infectividade do vírus variam para diferentes bibliotecas mutantes.
7. Seleção de variantes virais resistentes a medicamentos
- Dissolver o pibrentasvir (PIB), um inibidor da NS5A, em DMSO a 100% até uma concentração de 1 mM e diluí-lo em DMEM completo até uma concentração de 10 nM.
- Para determinar a concentração efetiva de 50% de PIB, semeie células Huh7.5 a uma densidade de 0,6 x 10 6/poço em uma placa de6 poços e incube as células a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 . Após 16 h de incubação celular, adicionar uma dose viral de ML50 ou vírus JFH1 clonal para infectar 50% das células e, em seguida, 12 h pós-infecção (h p.i.), tratar as células com uma série de diluição de duas vezes de PIB variando de 0,5-100 pM. Medir os AGL e quantificar os AGL como no passo 6.2. após 3 dias de incubação.
- Plotar as curvas dose-resposta utilizando os valores do ensaio de redução de FFU em software de análise estatística. A partir da curva sigmoidal, obtém-se a concentração efetiva de 50% (EC50; Gráfico 5).
NOTA: O intervalo de concentração eficaz pode variar dependendo da classe, entre antivirais HCV da mesma classe, e dependendo da biblioteca mutante. - Para o experimento, infectar células Huh7.5 virgens em 70% de confluência com uma dose do vírus ML50 (variantes derivadas do RNA ML50) para infectar 50% das células por 12 h e, em seguida, transferir as células infectadas para placas de 6 poços 24 h após a infecção.
- Adicionar 1x EC50 PIB (47,3 pM) às células infectadas após 16 h de divisão celular. Faça isso depois que cada célula se dividir por seis passagens consecutivas (18 dias), seguidas por três ciclos de passagem sem drogas, e monitorar a disseminação do vírus usando FFAs, conforme descrito na etapa 6.2. Ampliação de reagentes FFA de acordo com a área de crescimento. Colha sobrenadantes virais em cada passagem e armazene-os a -80 °C até o uso.
NOTA: A disseminação viral para mais de 50% das células durante o acompanhamento do tratamento pode ser definida como um avanço, e a disseminação viral durante o período de abstinência da droga pode ser definida como recidiva viral16. - Extrair o ARN viral do sobrenadante no dia 18, conforme descrito no passo 6.1.1., e depois sintetizar o cADN, como mostrado no passo 3.1. Amplificar o gene NS5A usando 5 μL de cDNA diluído 1:5 e os componentes de PCR descritos na etapa 3.2. Em seguida, siga as etapas 3.3.-3.5. determinar mutações de resistência à NS5A em plasmídeos bacterianos 6-8 positivos usando os primers de sequenciamento NS5A 6186F, 6862F e 6460R (Tabela 3 e Tabela 4).
NOTA: Aqui neste estudo, relatamos substituições na NS5A de variantes selecionadas durante o tratamento com PIB em 1x EC50. Isso excluirá a contribuição de substituições diferentes da NS5A na redução da suscetibilidade ao PIB.
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Representative Results
Uma infinidade de variantes completas do HCV pode ser gerada e rastreada para fenótipos resistentes de interesse seguindo os procedimentos descritos na Figura 1. Bibliotecas completas de mutantes do genoma foram sintetizadas usando clonal-pJFH1 em quantidades decrescentes (100-10 ng), como mostrado na Figura 2. Os rendimentos médios dos produtos de ep-PCR (bibliotecas mutantes) variaram de 3,8-12,5 ng/μL. A Figura 3 mostra os transcritos virais sintetizados a partir do clonal-pJFH1 e da biblioteca mutante representativa (ML50 sintetizado usando 50 ng de clonal-pJFH1). O clonal-pJFH1 foi linearizado via digestão XbaI , enquanto o ML50 foi usado diretamente na reação de transcrição in vitro . A proporção de mutações em bibliotecas mutantes (RNAs virais mutantes) aumentou com a diminuição da entrada pJFH1 na reação de ep-PCR, como mostrado na Figura 4. ML50 sintetizado usando 50 ng do molde (clonal-pJFH1) teve 4 substituições por 10.000 pb copiados, enquanto ML25 sintetizado usando 25 ng do molde abrigou 9 substituições. Não foram encontradas substituições dentro do número de nucleotídeos sequenciados no clonal-pJFH1. As variantes virais ML50 foram menos suscetíveis (12,7 vezes) ao pibrentasvir, um inibidor da NS5A, em comparação com o vírus clonal-JFH1, como mostrado na Figura 5. A Tabela 5 mostra as substituições NS5A identificadas nas variantes virais ML50 selecionadas contra 1x EC50 do tratamento com pibrentasvir. Dos oito clones NS5A, quatro apresentaram combinação de D7V+F28C, enquanto V8A+F28C e F36L ocorreram em um clone cada. Essas mutações ocorreram na região N-terminal da NS5A, que é conhecida por abrigar mutações clinicamente relevantes na resistência à NS5A17.
Figura 1: Esquema da estratégia da ERM-FL e seleção do fenótipo resistente aos fármacos. (A) O clone de cDNA pJFH1 (selvagem) carrega um genoma completo do vírus genótipo 2a e promotor T7. O primer J-For está a montante do promotor T7, e o primer J-Rev está localizado na extremidade 3' do genoma do HCV. (B) Clonal-pJFH1 é mutagenizado aleatoriamente usando PCR propenso a erros para projetar variações genéticas e criar bibliotecas mutantes completas do genoma. Clonal-pJFH1 é linearizado pela digestão XbaI . (C) Produtos de ep-PCR do genoma completo e clonal-pJFH1 linearizado são os modelos para transcrição in vitro . A proporção de mutações nos RNAs virais de MLs e JFH1 clonal foi determinada pela subclonagem de AT de NS5A e sequenciamento de Sanger de clones positivos de AT. (D) Variantes competentes em replicação geradas após a transfecção de RNA viral mutante de células Huh7.5 foram tratadas com pibrentasvir (um inibidor da NS5A) para a seleção de fenótipos resistentes à NS5A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de ep-PCR. Os produtos de ep-PCR do genoma completo do HCV sintetizados usando quantidades variadas de molde (100 ng, 50 ng, 25 ng e 10 ng de pJFH1) foram separados usando eletroforese em gel de agarose TAE 0,8%. O tamanho esperado do produto ep-PCR é de 9,7 kb. Os produtos separados foram visualizados pela coloração com brometo de etídio. A faixa 1 é uma escada de DNA de 1 kb; A faixa 6 é um controle sem modelo (rotulado como H2O). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: MOPS formaldeído agarose gel eletroforese de transcritos virais. O pJFH1 linearizado (Lane 2) e a biblioteca mutante obtida com 50 ng (ML50) de pJFH1 contendo ep-PCR (Lane 3) foram utilizados como templates para a reação de transcrição in vitro . A integridade dos transcritos foi analisada utilizando-se um gel de agarose 0,8% MOPS formaldeído corado com brometo de etídio. A faixa 1 é uma escada de RNA de 1 kb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Proporção de substituições em bibliotecas mutantes. Os genes NS5A dos RNAs clonais-pJFH1, ML50 e ML25 foram amplificados em PCRs de alta fidelidade, seguidos pela adição de saliência 3' A, ligadura do produto com vetor T e transformação de E. coli DH5α com o produto ligado. Cerca de 40.000 nucleotídeos/biblioteca ou clonal-pJFH1 foram sequenciados por Sanger. Uma proporção média de mutações por 10.000 pb copiados é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Estimativa da EC50 de pibrentasvir contra as variantes ML50. As células Huh7.5 foram infectadas com o vírus clonal-JFH1 ou variantes ML50 e tratadas com diluições seriadas de duas vezes a partir de 100 pM de pibrentasvir, seguidas por AGL após 3 dias. Curvas de dose-resposta sigmoidais usando os valores do ensaio de redução de FFU foram construídas em software de análise estatística para estimar a concentração efetiva de 50%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componentes para 50 μL | Valor necessário das ações | Concentração/reação final |
| 10x buffer PCR | 5,0 μL | 1x |
| MgCl2 (50 mM) | 1,5 μL | 1,5 mM |
| Extensor KB | 2,0 μL | - |
| dNTPs (10 mM) | 1,0 μL | 0,2 mM |
| Primer para frente (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Primer reverso (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Taq DNA Polimerase (10 U/μL) | 0,5 μL (1:4 diluído) | 1 U |
| Gabarito (pJFH1, 20 ng/μL) | 0,5 a 5,0 μL | 10 a 100 ng |
| Água | 32,5 a 37,5 μL | Ajuste para volume final de 50 μL |
Tabela 1. Componentes da Ep-PCR para amplificação do genoma completo do HCV.
| Temperatura | Hora | Ciclo(s) |
| 95 °C | 3 minutos | 1 |
| 95 °C | 30 Seg | 30 |
| 60 °C | 25 Seg | |
| 72 °C | 8 minutos | |
| 72 °C | 10 minutos | 1 |
| 4 °C | Segurar |
Tabela 2. Condições de ciclagem para a ep-PCR do genoma completo do HCV.
| Análise | Cartilha | Sequência (5'-3') |
| Amplificação da NS4B-NS5A parcial NS5B parcial | 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| síntese de cDNA | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR | R9-148-S21FT (sonda TaqMan) | CTGCGGAACCGGTGAGTGAGTACAC |
| R6-130-S17 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| R6-290-R19 | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| Sequenciamento de primers para determinar proporções de mutações em produtos de ep-PCR | 6208-SPF | CCCAACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-SPF | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| Sequenciamento do gene NS5A (e para determinar proporções de mutações em produtos de ep-PCR) | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
Tabela 3. Primers e sequências utilizados nos ensaios.
| Temperatura | Hora | Ciclo(s) |
| 95 °C | 4 minutos | 1 |
| 95 °C | 30 Seg | 5 |
| 68 °C | 30 Seg | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 95 °C | 30 Seg | 5 |
| 66 °C | 30 Seg | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 95 °C | 30 Seg | 5 |
| 64 °C | 30 Seg | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 95 °C | 30 Seg | 5 |
| 62 °C | 30 Seg | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 95 °C | 30 Seg | 10 |
| 60 °C | 30 Seg | |
| 72 °C | 2 minutos | |
| 72 °C | 10 minutos | 1 |
| 4 °C | Segurar |
Tabela 4. Condições de ciclagem para amplificação de NS5A.
| Substituição(ões) | Não. dos clones (n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36L | 1 |
Tabela 5. Substituições de NS5A resistentes ao Pibrentasvir.
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Discussion
Neste estudo, detalhamos um procedimento simples e rápido de FL-MRS que integra ep-PCR18 e genética reversa para sintetizar bibliotecas do genoma completo do HCV, que pode então ser usado em um sistema de cultura celular para gerar variantes competentes em replicação para a triagem de fenótipos resistentes a drogas. O uso de Taq DNA polimerase de baixa fidelidade é um pré-requisito da ep-PCR que permite a incorporação de substituições durante a amplificação por PCR de um genoma viral completo. Testamos várias polimerases de DNA Taq de baixa fidelidade e descobrimos que a polimerase de DNA Taq de platina produziu um produto de ep-PCR de ~10 kb com alto rendimento (dados não mostrados). Recomendamos usar um número fixo de ciclos térmicos e variar a quantidade do modelo de entrada para controlar a proporção de mutações nas bibliotecas do genoma completo. Uma vez que a FL-MRS utiliza genomas completos errôneos como modelos para RNAs virais completos, um projeto cuidadoso do conjunto de primers é crítico para garantir que a reação de síntese de RNA produza transcritos virais de comprimento definido: (i) o primer forward deve estar localizado a montante (~50 nucleotídeos) do promotor T7 do clone de cDNA para facilitar a ligação da polimerase T7 ao produto ep-PCR; e (ii) a sequência reversa de primers deve terminar na extremidade 3' do genoma do vírus para facilitar o escoamento da transcrição durante a síntese de RNA in vitro .
No entanto, o método é relativamente bruto, e não há controle sobre a incorporação do número necessário e tipo de substituições em regiões de interesse no genoma. Uma grande vantagem da FL-MRS é que os transcritos completos sintetizados podem ser usados diretamente para transfectar células, o que torna a abordagem simples e eficiente para gerar um grande pool de variantes virais. Em contraste, os métodos de extensão circular da polimerase e mutagênese de inserção Mu-transposon requerem clonagem do produto de PCR e triagem de transformantes antes da seleção do fenótipo desejado, o que limita severamente a diversidade do pool de mutantes. Embora nosso método aumente muito a chance de produzir vários fenótipos desejados, a avaliação de variantes virais individuais é normalmente necessária no rastreamento.
A integração da ep-PCR com a genética reversa do vírus nos permitiu gerar rapidamente mutantes do HCV. Este método tem o potencial de gerar centenas de vírus geneticamente modificados, um feito aparentemente não possível com as técnicas de mutagênese in vitro atualmente disponíveis. O método detalhado aqui é facilmente adaptável a clones de cDNA que carregam quaisquer vírus (+)ssRNA contendo genomas de até ~10 kb de comprimento.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O apoio financeiro (número de processo BT/PR10906/MED/29/860/2014) para este estudo foi fornecido pelo Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
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