Summary
Het protocol beschrijft een methode voor het introduceren van controleerbare genetische diversiteit in het genoom van het hepatitis C-virus door de synthese van mutant RNA over de volledige lengte te combineren met behulp van foutgevoelige PCR en omgekeerde genetica. De methode biedt een model voor fenotypeselectie en kan worden gebruikt voor 10 kb lange positive-sense RNA-virusgenomen.
Abstract
Het ontbreken van een handige methode voor het iteratief genereren van diverse virale varianten van volledige lengte heeft de studie van gerichte evolutie in RNA-virussen belemmerd. Door een volledig RNA-genoomfoutgevoelige PCR en omgekeerde genetica te integreren, kan willekeurige genoombrede substitutiemutagenese worden geïnduceerd. We hebben een methode ontwikkeld met behulp van deze techniek om verschillende bibliotheken te synthetiseren om virale mutanten met interessante fenotypes te identificeren. Deze methode, die mutante RNA-synthese van volledige lengte (FL-MRS) wordt genoemd, biedt de volgende voordelen: (i) de mogelijkheid om een grote bibliotheek te creëren via een zeer efficiënte foutgevoelige PCR in één stap; (ii) het vermogen om groepen bibliotheken met verschillende niveaus van genetische diversiteit te creëren door de getrouwheid van DNA-polymerase te manipuleren; (iii) de creatie van een PCR-product van volledige lengte dat rechtstreeks kan dienen als sjabloon voor de synthese van mutant RNA; en (iv) het vermogen om RNA te creëren dat in gastheercellen kan worden afgeleverd als een niet-geselecteerde invoerpool om te screenen op virale mutanten van het gewenste fenotype. We hebben ontdekt, met behulp van een omgekeerde genetische benadering, dat FL-MRS een betrouwbaar hulpmiddel is om viraal gerichte evolutie te bestuderen in alle stadia van de levenscyclus van het hepatitis C-virus, JFH1-isolaat. Deze techniek lijkt een hulpmiddel van onschatbare waarde te zijn om gerichte evolutie te gebruiken om aanpassing, replicatie en de rol van virale genen in pathogenese en antivirale resistentie in positief-sense RNA-virussen te begrijpen.
Introduction
Voorwaartse genetische screening begint met een viraal fenotype dat van belang is en probeert vervolgens, door het genoom te sequencen en te vergelijken met dat van de oorspronkelijke stam, de mutatie(s) te identificeren die dat fenotype veroorzaken. Bij omgekeerde genetische screenings daarentegen worden willekeurige mutaties geïntroduceerd in een doelgen, gevolgd door een onderzoek van het (de) resulterende fenotype(n)1. Voor de omgekeerde genetica-benadering is in-vitromutagenese de meest gebruikte techniek om een pool van varianten te creëren die vervolgens worden gescreend op interessante fenotypes. Er zijn verschillende genetische hulpmiddelen gerapporteerd voor het bereiken van genoombrede willekeurige mutagenese van RNA-virussen, waaronder foutgevoelige PCR (ep-PCR)2,3, circulaire polymerase-extensie4 en Mu-transposon-insertiemutagenese 5,6,7. De laatste twee methoden leveren bibliotheken op met een beperkte sequentiediversiteit en zijn vatbaar voor de introductie van grote inserties en deleties, die zeer dodelijk zijn voor virussen en het herstel van infectieuze virale varianten ernstig beperken.
ep-PCR is een bekende krachtige mutagenesetechniek die veel wordt gebruikt in eiwitengineering om mutante enzymen te genereren voor de selectie van fenotypes met gewenste eigenschappen, zoals verbeterde thermische stabiliteit, substraatspecificiteit en katalytische activiteit 8,9,10. Deze techniek is gemakkelijk uit te voeren omdat er eenvoudige apparatuur voor nodig is, er geen vervelende manipulaties bij betrokken zijn, in de handel verkrijgbare reagentia worden gebruikt en het snel is; Bovendien genereert het bibliotheken van hoge kwaliteit.
Hier ontwikkelden we een nieuwe methode voor mutante RNA-synthese van volledige lengte (FL-MRS) om volledige genomen van het hepatitis C-virus (HCV) te genereren door ep-PCR te integreren, wat willekeurige genoombrede substitutiemutagenese en omgekeerde genetica induceert. Zelfs een enkele nucleotide-insertie of -deletie is zeer schadelijk voor positief-sense RNA-virussen ([+]ssRNA); daarom is op PCR gebaseerde substitutiemutagenese de voorkeursmethode voor het iteratief genereren van grote, diverse bibliotheken van volledige (+)ss RNA-virusgenomen met een goede levensvatbaarheid.
FL-MRS is een eenvoudige benadering die kan worden toegepast op elk positief-sense RNA-virus met een genoomlengte van ~10 kb door het nauwgezette ontwerp van een primerset die zich bindt aan de virale cDNA-kloon. pJFH1 is een infectieuze cDNA-kloon die codeert voor HCV-genotype 2a en alle stappen van de levenscyclus van het virus kan recapituleren. Door gebruik te maken van de FL-MRS-benadering hebben we de synthese aangetoond van willekeurig gemutageniseerde full-genome bibliotheken (mutant libraries [ML's]) om replicatie-competente JFH1-varianten te produceren waarvoor er geen voorkennis was van de eigenschappen geassocieerd met mutaties. Bij blootstelling aan een antiviraal middel overwonnen sommige van de virale varianten snel de medicijndruk met de gewenste fenotypische verandering. Met behulp van het hier beschreven protocol kan een overvloed aan virale varianten worden gegenereerd, waardoor mogelijkheden ontstaan om de evolutie van (+)ssRNA-virussen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De JFH1-stam (WT) die hier werd gebruikt, was een vriendelijk geschenk van Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. De menselijke hepatoomcellijn, Huh7.5, was een vriendelijk geschenk van Charles Rice, de Rockefeller University. Een schema van de methode is weergegeven in figuur 1.
1. Genoomwijde substitutiemutagenese van JFH1 met behulp van foutgevoelige PCR
- Om ep-PCR uit te voeren, bereidt u de mastermix voor vier sets experimenten voor met primers J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' en J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (Figuur 1A), samen met de reactiecomponenten beschreven in tabel 1 zonder de pJFH1-sjabloon (plasmide geïsoleerd uit JFH1-stam).
- Aliquot het hoofdmengsel in vier buisjes, voeg 100 ng, 50 ng, 25 ng en 10 ng sjabloon toe aan de afzonderlijke buisjes en pas het totale volume van de reactie aan tot 50 μl. Pas de cyclusomstandigheden toe die worden beschreven in tabel 2 om een 9736 basenpaar (bp)-fragment te amplificeren dat bestaat uit de T7-promotor en het HCV-genoom van volledige lengte (Figuur 2).
OPMERKING: Het ep-PCR-product moet de T7-promotorsequentie bevatten om in vitro transcriptie van het virale genoom te vergemakkelijken. Daarom moet de voorste primer stroomopwaarts van de T7-promotor van de virale cDNA-kloon worden geplaatst en moet de omgekeerde primersequentie eindigen aan het 3'-uiteinde van het virusgenoom om transcriptie-run-off te vergemakkelijken. Optimaliseer elk onderdeel van de ep-PCR-reactie binnen het bereik dat wordt aanbevolen door de fabrikant van Taq-DNA-polymerase om amplificatie met een hoog rendement te bereiken. Naast gevarieerde sjabloonhoeveelheden kunnen onevenwichtige dNTP's (met name lage dATP- en/of dGTP-concentratie) ook worden gebruikt om de diversiteit in de lengte van virale genomen te vergroten van 6-8 kb lang3. - Maak een schatting van het ep-PCR-product dat is geamplificeerd door gelijke volumes van de PCR-producten (5 μL) te laden en te vergelijken met bekende hoeveelheden DNA-ladder van 1 kilobase (kb) door een op 0,8% trisacetaat-EDTA (TAE) gebaseerde agarosegelelektroforese uit te voeren11. Reinig het product met behulp van een kolomzuiveringsset zoals aangegeven door de fabrikant.
- Schat de concentratie van het gezuiverde product door de extinctie bij 260 nm te meten met behulp van een microvolumespectrofotometer12. Concentraat het ep-PCR-product indien nodig vacuüm om een productconcentratie ≥100 ng/μl te verkrijgen.
OPMERKING: Een nauwkeurigere schatting kan worden gemaakt door tweevoudige seriële verdunningen van het ep-PCR-product te laden en hun intensiteiten te vergelijken met de bekende hoeveelheden van 1 kb DNA-ladder.
2. Virale RNA-synthese
- Stel een reactie van 40 μl in om 5 μg klonaal-pJFH1 te verteren met 4 U XbaI-enzym bij 37 °C gedurende 2 uur, gevolgd door kolomzuivering en meting van de extinctie bij 260 nm in een microvolumespectrofotometer12. Zet een 20 μL in-vitrotranscriptiereactie op van het kolomgezuiverde ep-PCR-product of klonaal-pJFH1 (WT) met behulp van een in de handel verkrijgbaar grootschalig RNA-productiesysteem volgens de instructies van de fabrikant.
- Meng in een microcentrifugebuisje van 200 μl ongeveer 1 μg van het gezuiverde ep-PCR-product (mutantbibliotheken) of XbaI verteerd klonaal-pJFH1, 10 μL 2x buffer met ribonucleotiden en 2 μL T7-enzymmix. Meng alle componenten en draai de componenten kort af. Incubeer het reactiemengsel bij 37 °C gedurende 45 minuten, gevolgd door de toevoeging van 1 U RNasevrij DNase-enzym en incubatie bij 37 °C gedurende 30 minuten (figuur 1C).
- Zuiver in vitro gesynthetiseerd RNA met behulp van een RNA-opruimkit volgens de instructies van de fabrikant, elute in 40 μL RNase- en DNasevrij water en schat de concentratie van het gezuiverde RNA door de absorptie bij 260 nm te meten met behulp van een microvolumespectrofotometer12. Maak naar behoefte aliquots (5 μg of 2 μg) om vries- en dooi te voorkomen en bewaar ze bij −80 °C. Controleer de integriteit en grootte van de virale transcripten door 2 μg RNA te gebruiken voor een MOPS-formaldehyde 0,8% agarosegelelektroforese13 (Figuur 3).
3. Schatting van het aandeel mutaties in ep-PCR-producten (mutantbibliotheken)
OPMERKING: In deze stap wordt het aandeel nucleotiden dat is gemuteerd door subklonen van het product dat in stap 2 is verkregen, gemuteerd. werd geschat om het voordeel aan te tonen van het gebruik van ep-PCR om genetische heterogeniteit te creëren met behulp van twee volledige genoommutantenbibliotheken (ML50 en ML25) en klonale pJFH1-afgeleide virale RNA's. Het aandeel mutaties werd geschat in het HCV NS5A-gen, dat in deze studie ook het fenotypische uitleesgen (resistentie tegen geneesmiddelen) was.
- Zet een cDNA-synthesereactie van 20 μL op door ongeveer 1 μg van het virale RNA toe te voegen dat in stap 2 is gesynthetiseerd, 5 μM reverse primer 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3' en 200 U reverse transcriptase volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Amplificeer met behulp van het cDNA een fragment van 2571 bp dat het volledige NS5A-gen omvat. Bereid hiervoor een reactiemengsel met 0,5 μM voor 5272F- en 7848R-primers (eindconcentratie; Tabel 3), 1,5 mM MgCl2, 1x PCR-buffer en 1 U high-fidelity Taq-polymerase in een totaal volume van 50 μL en voeren een amplificatiecyclus uit met behulp van de omstandigheden beschreven in tabel 4.
- Laat het product draaien op een agarosegel op basis van 0,8% TAE om de productgrootte van 2571 bp te bevestigen en zuiver het product vervolgens met behulp van een kolomzuiveringsset zoals aangegeven door de fabrikant. Elute het kolomgezuiverde product in 40 μL steriel water.
- Om een overhang van 3' A aan het product toe te voegen, voegt u 0,5 μM dATP en 1 U low-fidelity Taq-DNA-polymerase toe en incubeert u het volledige PCR-product bij 70 °C gedurende 30 minuten, samen met 1x PCR-buffer en 1,5 mM MgCl2 (eindconcentratie). Zuiver het mengsel met behulp van een kolomzuiveringsset zoals aangegeven door de fabrikant
OPMERKING: U kunt ook het ~9.7 kb lange product uit de gel uit stap 1.4 verwijderen. en klonen uit te voeren met behulp van een in de handel verkrijgbare kit voor het klonen van een lang-PCR-product volgens de instructies van de fabrikant of NGS van het ep-PCR-product uit te voeren met behulp van een Illumina-platform2. - Breng een ligatiereactie op gang door 5 μL 2x ligatiebuffer, 50 ng van het T-vector-DNA, ongeveer 3-voudige molaire overmaat van het in stap 3.4 gesynthetiseerde insert-DNA-DNA, 3 Weiss-eenheden T4-DNA-ligase en nucleasevrij water toe te voegen tot een totaal volume van 10 μL. Incubeer deze reactie gedurende 3 uur bij kamertemperatuur en voeg vervolgens 100 μL Escherichia coli DH5α toe aan het geligeerde DNA; hitteschok de cellen bij 42 °C gedurende 35 s (figuur 1B).
- Voeg 1 ml Luria-Bertani (LB) medium (zonder antibioticum) toe en incubeer gedurende 1 uur zachtjes schudden bij 37 °C voor herstel. Centrifugeer de celsuspensie bij 13.800 x g, gooi het supernatant weg en resuspendeer in 200 μL vers LB-medium.
- Plaat 100 μl van de getransformeerde E. coli DH5α-cellen op een LB-plaat met 50 μg/ml ampicilline en incubeer gedurende 16 uur bij 37 °C. Zet minipreps van 25-30 kolonies op in 5 ml LB-medium + 50 μg/ml ampicilline en laat ze 's nachts groeien bij 37 °C.
- De volgende dag de plasmiden extraheren met een plasmidezuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant en voer restrictie-enzymvertering uit in een volume van 10 μL met 200 ng van de geïsoleerde plasmiden, 2 U EcoR1 en 1x restrictiebuffer voor alle kolonies.
- Na het incuberen van de digestiemengsels bij 37 °C gedurende 3 uur, lossen de producten op met agarosegel op basis van 0,8% TAE om de invoeging van plasmide-DNA te bevestigen.
- Voer Sanger-sequencing uit van de plasmiden van 25 positieve klonen met behulp van M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF en 6748-SPF primers (Tabel 3) om het aandeel mutaties te bepalen (uitgedrukt als het aandeel gemuteerde nucleotiden) in de virale RNA's afgeleid van de bibliotheken en klonale pJFH1 (Figuur 1B en Figuur 4).
4. Virale RNA-transfectie van de Huh7.5-cellijn
OPMERKING: Gebruik RNase/DNase-vrije weefselkweekmaterialen en werk in een steriele klasse II bioveiligheidskast. Werk in de aanbevolen insluitingsfaciliteit volgens de bioveiligheidsrichtlijnen van de organisatie.
- Onderhoud Huh7.5-cellen door incubatie in een 5% CO 2 -incubator bij 37 °C in een weefselkweekkolf van T75 cm2 met 15 ml volledige Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% (vol/vol) foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (100 μg/ml; Figuur 1D).
- Splits de cellen in een verhouding van 1:3 wanneer de samenvloeiing 90% bereikt. Was de cellen met 1x voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4). Voeg 5 ml 1x trypsine-EDTA-oplossing toe om de cellaag volledig te bedekken, draai de kolf voorzichtig rond en incubeer de kolf vervolgens gedurende 5 minuten bij 37 °C.
OPMERKING: De incubatietijd kan variëren; Incubeer de cellen totdat de cellaag volledig is losgemaakt van het oppervlak van de celkweekkolf. - Voeg 10 ml 1x voorverwarmde complete DMEM toe, dispergeer de cellen door herhaaldelijk pipetteren en vang de celsuspensie op in een steriele centrifugebuis van 15 ml of 50 ml. Centrifugeer de celsuspensie bij 252 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de celpellet in 6 ml volledige DMEM en incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Herhaal stap 4.2 voor continu onderhoud van naïeve, getransfecteerde of met virus geïnfecteerde Huh7.5-cellen. en stap 4.3.
- Splits de cellen 1 dag vóór de transfectie zoals beschreven in de stappen 4.1.-4.3., tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer, zaai de Huh7.5-cellen met een dichtheid van 0,6 x 106 in schalen van 35 mm in 2 ml volledige DMEM en incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Bereid de volgende dag het transcript-lipidencomplex voor. Om dit te doen, verdunt u 10 μL transfectiereagens in 50 μL minimaal essentieel medium en verdunt u afzonderlijk 5 μg virale transcripten in 50 μL minimaal essentieel medium.
- Incubeer beide mengsels gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en meng ze vervolgens in een enkele steriele microcentrifugebuis en incubeer het mengsel vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om het transcript-lipidecomplex te vormen.
- Verwijder na 16 uur celincubatie het kweekmedium uit de kweekschaal, was de cellen 2x met voorverwarmd 1x PBS en voeg 1,5 ml minimaal essentieel medium toe. Voeg langzaam het transcript-lipidencomplex toe aan de schaal en draai voorzichtig met de handen om een gelijkmatige verdeling van de complexen te garanderen.
- Incubeer de cellen in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 10 uur. Verwijder vervolgens het medium, was de getransfecteerde cellen 2x met 1 ml voorverwarmde 1x PBS en voeg 2 ml volledige DMEM toe.
5. Virusproductie
- Splits de getransfecteerde Huh7.5-cellen elke 2 dagen of 3 dagen wanneer ze 90% confluentie bereiken. Verzamel virussupernatanten bij elke splitsing en bewaar ze bij -80 °C voor verdere analyse.
- Controleer bij elke splitsing de verspreiding van het virus met behulp van een focusvormende test (FFA) zoals beschreven in stap 6.2. Oogst het virus totdat de virusverspreiding >80% van de getransfecteerde cellen bereikt (Figuur 1D).
OPMERKING: Splits de getransfecteerde cellen in een verhouding van 1:1 voor de eerste paar passages om het maximale aantal virale varianten te redden. De verspreiding van het virus vertraagt en de levensvatbaarheid neemt af met een toenemend aantal mutaties in de ML's met het volledige genoom2.
6. Kwantificering van virustiters
- Kwantificering van viraal RNA
- Isoleer viraal RNA uit 140 μL kweeksupernatanten met behulp van een virale RNA-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant.
- Stel een qRT-PCR-reactie van 10 μl in met behulp van een in de handel verkrijgbare qRT-PCR-kit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik de voorwaartse primer R6-130-S17, de omgekeerde primer R6-290-R19 (eindconcentratie elk 0,2 μM) en de sonde R9-148-S21FT (eindconcentratie 0,3 μM) voor HCV-RNA-kwantificering (tabel 3). Stel de bedrijfsomstandigheden in op 48 °C gedurende 20 min, 95 °C gedurende 10 min, vervolgens 45 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 min.
NOTITIE: De sonde moet de fluorescerende reporterkleurstof 6-carboxyfluoresceïne (FAM) en de quencherkleurstof 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA) bevatten aan respectievelijk de 5' en 3' uiteinden. - Voer reacties uit in een real-time PCR-machine. Stel negatieve controles in, d.w.z. RNA dat tegelijkertijd wordt geëxtraheerd uit de supernatanten van nep-geïnfecteerde cellen en nucleasevrij water om de afwezigheid van kruisbesmetting te garanderen.
- Genereer tegelijkertijd een standaardcurve met behulp van een 10-voudig serieel verdund bekend kopienummer van HCV-transcripten (1 x 108 tot 0) voor de kwantificering van viraal RNA. Voer de kwantificering in drievoud uit (Figuur 1D).
- Kwantificering van infectieuze virustiter met behulp van 50% infectieuze dosis weefselkweek (TCID50)
- Ongeveer 16 uur voor de toevoeging van het virus 6,5 x 103 Huh7,5-cellen/putje in een plaat met 96 putjes plaatsen en de cellen bij 37 °C incuberen in een 5% CO2 -incubator.
- Voer in een kast met bioveiligheidsklasse II 10-voudige seriële verdunningen (elk 1 ml) uit met 1 x 10−1 tot 1 x 10−6 verdunningen (acht verdunningen) van het geoogste virus (verkregen wanneer de virusverspreiding >80% van de cellen bereikt, zoals beschreven in stap 5.). Voeg 100 μL/putje (met acht replicaten) van het verdunde virus toe om de Huh7.5-cellen te infecteren en bewaar de plaat gedurende 3 dagen in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 .
- Was de geïnfecteerde cellen na 3 dagen 3x met 0,1 ml PBS per keer, en fixeer en permeabiliseer de cellen met 0,1 ml ijskoude methanol bij -20 °C gedurende 20 minuten. Was de putjes met 1x PBS 3x en daarna 1x met PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
- Blokkeer na het verwijderen van de PBS-T de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 0,1 ml 1% runderserumalbumine (BSA) met 0,2% magere melk in PBST. Verwijder de blokkerende oplossing en behandel de cellen gedurende 5 minuten met 0,1 ml 3% H 2 O2bereid in 1x PBS.
- Nogmaals, was de cellen 2x met 1x PBS en 1x met PBS-T, voeg dan 50 μL/putje anti-NS5A 9E10 mAb toe (1:10000, voorraad 1 mg/ml; een vriendelijk geschenk van Charles Rice, The Rockefeller University), en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de putjes nog een keer 3x met 1x PBS en 1x met PBS-T.
- Voeg 50 μL/putje HRP-geconjugeerd geit anti-muis secundair IgG (1:4000) toe, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens het ongebonden antilichaam door de putjes te wassen met 0,1 ml 1x PBS.
- Voeg 30 μL DAB (diaminobenzidine tetrahydrochloride) kleursubstraat toe en incubeer de plaat met zacht schommelen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Het substraat ontwikkelt een bruin neerslag op het putoppervlak dat wijst op HCV NS5A-antigeen. Verwijder de DAB-oplossing en was de putjes 2x met 1x PBS en 1x met gedestilleerd water. Voeg 100 μL PBS toe met 0,03% natriumazide.
- Onderzoek elk putje onder een omgekeerde lichtmicroscoop met behulp van een 10x objectief. Tel het aantal positieve putjes. Als het putje een of meer NS5A-positieve cellen bevat, dan is het positief; als de put een afwezigheid van NS5A-positieve cellen vertoont, dan is deze negatief. Gebruik een riet- en münchcalculator om de eindpuntverdunning te schatten die 50% van de putten infecteert (TCID50)14,15. Een reciproke verdunning die nodig is om de TCID50 te verkrijgen, is de virusinfectiviteitstiter (focivormende eenheden) per volume-eenheid.
OPMERKING: Virusinfectiviteittiters variëren voor verschillende mutantbibliotheken.
7. Selectie van resistente virale varianten
- Los pibrentasvir (PIB), een NS5A-remmer, op in 100% DMSO tot een concentratie van 1 mM en verdun het verder in volledige DMEM tot een concentratie van 10 nM.
- Om de effectieve PIB-concentratie van 50% te bepalen, zaait u Huh7.5-cellen met een dichtheid van 0,6 x 10 6/putje in een plaat met6 putjes en incubeert u de cellen bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator. Voeg na 16 uur celincubatie een virusdosis van ML50 of klonaal JFH1-virus toe om 50% van de cellen te infecteren, en behandel de cellen vervolgens, 12 uur na infectie (h.p.i.), met een tweevoudige verdunningsreeks van PIB variërend van 0,5-100 pM. Meet de FFA en kwantificeer FFU zoals in stap 6.2. na 3 dagen incubatie.
- Plot de dosis-responscurven met behulp van FFU-reductietestwaarden in statistische analysesoftware. Verkrijg uit de sigmoïdale curve de effectieve concentratie van 50% (EC50; Figuur 5).
OPMERKING: Het effectieve concentratiebereik kan variëren afhankelijk van de klasse, tussen HCV-antivirale middelen van dezelfde klasse en afhankelijk van de mutantenbibliotheek. - Infecteer voor het experiment naïeve Huh7.5-cellen bij 70% samenvloeiing met een dosis ML50-virus (varianten afgeleid van ML50-RNA) om 50% van de cellen gedurende 12 uur te infecteren, en breng vervolgens de geïnfecteerde cellen 24 uur na infectie over op platen met 6 putjes.
- Voeg 1x EC50 PIB (47,3 pM) toe aan de geïnfecteerde cellen na 16 uur celsplitsing. Doe dit na elke celsplitsing gedurende zes opeenvolgende passages (18 dagen), gevolgd door drie medicijnvrije passagecycli, en bewaak de virusverspreiding met behulp van FFA's zoals beschreven in stap 6.2. Opschaling van FFA-reagentia volgens het groeigebied. Oogst virale supernatanten bij elke passage en bewaar ze bij -80 °C tot gebruik.
OPMERKING: Virale verspreiding naar meer dan 50% van de cellen tijdens de follow-up van de behandeling kan worden gedefinieerd als een doorbraak, en virale verspreiding tijdens de ontwenningsperiode van het geneesmiddel kan worden gedefinieerd als virale terugval16. - Extraheer viraal RNA uit het supernatans op dag 18, zoals beschreven in stap 6.1.1., en synthetiseer vervolgens cDNA, zoals getoond in stap 3.1. Amplificeer het NS5A-gen met behulp van 5 μL 1:5 verdund cDNA en de PCR-componenten beschreven in stap 3.2. Volg daarna de stappen 3.3.-3.5. om NS5A-geneesmiddelresistentiemutaties in 6-8 positieve bacteriële plasmiden te bepalen met behulp van de NS5A-sequencingprimers 6186F, 6862F en 6460R (tabel 3 en tabel 4).
OPMERKING: Hier in deze studie rapporteerden we substituties in NS5A van varianten die tijdens PIB-behandeling waren geselecteerd bij 1x EC50. Dit sluit de bijdrage van andere substituties dan NS5A aan verminderde gevoeligheid voor PIB uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overvloed aan HCV-varianten van volledige lengte kan worden gegenereerd en gescreend op geneesmiddelresistente fenotypes die van belang zijn volgens de procedures beschreven in figuur 1. Volledige genoommutantbibliotheken werden gesynthetiseerd met behulp van klonaal-pJFH1 in afnemende hoeveelheden (100-10 ng), zoals weergegeven in figuur 2. De gemiddelde opbrengst van ep-PCR-producten (mutantbibliotheken) varieerde van 3,8-12,5 ng/μL. Figuur 3 toont de virale transcripten die zijn gesynthetiseerd uit de klonale-pJFH1 en de representatieve mutantenbibliotheek (ML50 gesynthetiseerd met behulp van 50 ng klonaal-pJFH1). Het klonale-pJFH1 werd gelineariseerd via XbaI-digestie , terwijl ML50 direct werd gebruikt in de in vitro transcriptiereactie. Het aandeel mutaties in mutantbibliotheken (mutante virale RNA's) nam toe met afnemende input pJFH1 in de ep-PCR-reactie, zoals weergegeven in figuur 4. ML50 gesynthetiseerd met 50 ng van de template (klonaal-pJFH1) had 4 substituties per 10.000 bp gekopieerd, terwijl ML25 gesynthetiseerd met 25 ng template 9 substituties bevatte. Er werden geen substituties gevonden binnen het aantal nucleotiden waarvan de sequentie was bepaald in klonaal-pJFH1. ML50-virale varianten waren minder gevoelig (12,7-voudig) voor pibrentasvir, een NS5A-remmer, in vergelijking met klonaal JFH1-virus, zoals weergegeven in figuur 5. Tabel 5 toont NS5A-substituties geïdentificeerd in ML50-virale varianten geselecteerd tegen 1x EC50 van behandeling met pibrentasvir. Van de acht NS5A-klonen hadden er vier een combinatie van D7V+F28C, terwijl V8A+F28C en F36L elk in één kloon voorkwamen. Deze mutaties bevonden zich in het N-terminusgebied van NS5A, waarvan bekend is dat het klinisch relevante NS5A-resistentiemutatiesherbergt17.
Figuur 1: Schema van de FL-MRS-strategie en selectie van resistente fenotypes. (A) De pJFH1 cDNA (wild-type) kloon draagt een genotype 2a-virusgenoom van volledige lengte en een T7-promotor. De primer J-For bevindt zich stroomopwaarts van de T7-promotor en de primer J-Rev bevindt zich aan het 3'-uiteinde van het HCV-genoom. (B) Clonal-pJFH1 wordt willekeurig gemutageniseerd met behulp van foutgevoelige PCR om genetische variaties te manipuleren en volledige genoommutantbibliotheken te creëren. Clonal-pJFH1 wordt gelineariseerd door XbaI-vertering . (C) Full-genome ep-PCR-producten en gelineariseerde klonale-pJFH1 zijn de sjablonen voor in-vitrotranscriptie . Het aandeel mutaties in de virale RNA's van ML's en klonaal-JFH1 werd bepaald door TA-subklonering van NS5A en Sanger-sequencing van positieve TA-klonen. (D) Replicatiecompetente varianten gegenereerd na mutante virale RNA-transfectie van Huh7.5-cellen werden behandeld met pibrentasvir (een NS5A-remmer) voor de selectie van NS5A-resistente fenotypes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Agarosegelelektroforese van ep-PCR-producten. HCV-ep-PCR-producten met volledig genoom die werden gesynthetiseerd met behulp van verschillende sjabloonhoeveelheden (100 ng, 50 ng, 25 ng en 10 ng pJFH1) werden gescheiden met behulp van 0,8% TAE-agarosegelelektroforese. De verwachte grootte van het ep-PCR-product is 9,7 kb. De gescheiden producten werden gevisualiseerd door ethidiumbromide kleuring. Baan 1 is een DNA-ladder van 1 kb; Baan 6 is geen sjabloonbesturing (aangeduid als H2O). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: MOPS-formaldehyde-agarosegelelektroforese van virale transcripten. Linearized pJFH1 (Lane 2) en de mutantenbibliotheek verkregen met 50 ng (ML50) pJFH1 bevattend ep-PCR (Lane 3) werden gebruikt als sjablonen voor de in vitro transcriptiereactie. De integriteit van de transcripten werd geanalyseerd met behulp van een MOPS-formaldehyde 0,8% agarosegel gekleurd met ethidiumbromide. Baan 1 is een RNA-ladder van 1 kb. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Aandeel van substituties in mutantbibliotheken. NS5A-genen van RNA's van klonale-pJFH1, ML50 en ML25 werden geamplificeerd in high-fidelity PCR's, gevolgd door de toevoeging van 3' A-overhang, ligatie van het product met T-vector en transformatie van E. coli DH5α met het geligeerde product. Ongeveer 40.000 nucleotiden/bibliotheek of klonaal-pJFH1 werden gesequenced door Sanger. Er wordt een gemiddeld aandeel mutaties per 10.000 bp gekopieerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Schatting van EC50 van pibrentasvir ten opzichte van ML50-varianten. Huh7.5-cellen werden geïnfecteerd met klonale-JFH1-virus- of ML50-varianten en behandeld met seriële tweevoudige verdunningen vanaf 100 pM pibrentasvir, gevolgd door FFA na 3 dagen. Sigmoïdale dosis-responscurven met behulp van FFU-reductietestwaarden werden uitgezet in statistische analysesoftware om de effectieve concentratie van 50% te schatten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Componenten voor 50 μL | Vereiste voorraadwaarde | Eindconcentratie/reactie |
| 10x PCR-buffer | 5,0 μL | 1x |
| MgCl2 (50 mM) | 1,5 μL | 1,5 mM |
| KB Extender | 2,0 μL | - |
| dNTP's (10 mM) | 1,0 μL | 0,2 mM |
| Voorwaartse primer (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Omgekeerde primer (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Taq DNA-polymerase (10 E/μL) | 0,5 μL (1:4 verdund) | 1 U |
| Sjabloon (pJFH1, 20 ng/μL) | 0,5 tot 5,0 μL | 10 tot 100 ng |
| Water | 32,5 tot 37,5 μL | Aanpassen voor eindvolume van 50 μL |
Tabel 1. Ep-PCR-componenten voor de amplificatie van het volledige HCV-genoom.
| Temperatuur | Tijd | Cyclus(sen) |
| 95 °C | 3 min | 1 |
| 95 °C | 30 seconden | 30 |
| 60 °C | 25 seconden | |
| 72 °C | 8 min | |
| 72 °C | 10 min | 1 |
| 4 °C | Houden |
Tabel 2. Cyclusomstandigheden voor de ep-PCR van het volledige genoom van HCV.
| Test | Abc | Sequentie (5'-3') |
| Versterking van partiële NS4B-NS5A-partiële NS5B | 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| cDNA-synthese | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR | R9-148-S21FT (TaqMan-sonde) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6-130-S17 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| R6-290-R19 | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| Sequencing primers om de verhoudingen van mutaties in ep-PCR-producten te bepalen | 6208-SPF | CCCAACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-SPF | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| NS5A-gensequencing (en om proporties van mutaties in ep-PCR-producten te bepalen) | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
Tabel 3. Primers en sequenties die worden gebruikt in assays.
| Temperatuur | Tijd | Cyclus(sen) |
| 95 °C | 4 min | 1 |
| 95 °C | 30 seconden | 5 |
| 68 °C | 30 seconden | |
| 72 °C | 2 min | |
| 95 °C | 30 seconden | 5 |
| 66 °C | 30 seconden | |
| 72 °C | 2 min | |
| 95 °C | 30 seconden | 5 |
| 64 °C | 30 seconden | |
| 72 °C | 2 min | |
| 95 °C | 30 seconden | 5 |
| 62 °C | 30 seconden | |
| 72 °C | 2 min | |
| 95 °C | 30 seconden | 10 |
| 60 °C | 30 seconden | |
| 72 °C | 2 min | |
| 72 °C | 10 min | 1 |
| 4 °C | Houden |
Tabel 4. Fietsomstandigheden voor NS5A-versterking.
| Vervanging(en) | Nee. Aantal klonen (n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36L | 1 |
Tabel 5. Pibrentasvir-resistentiesubstituties van NS5A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie hebben we een eenvoudige en snelle FL-MRS-procedure beschreven die ep-PCR18 en omgekeerde genetica integreert voor het synthetiseren van HCV-bibliotheken met volledig genoom, die vervolgens kunnen worden gebruikt in een celkweeksysteem om replicatiecompetente varianten te genereren voor de screening van resistente fenotypes. Het gebruik van low-fidelity Taq-DNA-polymerase is een voorwaarde voor ep-PCR die de opname van substituties mogelijk maakt tijdens PCR-amplificatie van een viraal genoom van volledige lengte. We testten verschillende low-fidelity Taq DNA-polymerasen en ontdekten dat Platinum Taq DNA-polymerase een ep-PCR-product van ~10 kb opleverde met een hoge opbrengst (gegevens niet getoond). We raden aan om een vast aantal thermische cycli te gebruiken en de hoeveelheid invoersjablonen te variëren om het aandeel mutaties in de volledige genoombibliotheken te controleren. Aangezien FL-MRS foutieve volledige genomen gebruikt als sjablonen voor virale RNA's van volledige lengte, is een zorgvuldig ontwerp van de primerset van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de RNA-synthesereactie virustranscripten van een gedefinieerde lengte produceert: (i) de voorste primer moet stroomopwaarts (~50 nucleotiden) van de T7-promotor van de cDNA-kloon worden geplaatst om de binding van T7-polymerase aan het ep-PCR-product te vergemakkelijken; en (ii) de omgekeerde primersequentie moet eindigen aan het 3'-uiteinde van het virusgenoom om transcriptieafvoer tijdens in vitro RNA-synthese te vergemakkelijken.
De methode is echter relatief grof en er is geen controle op het opnemen van het vereiste aantal en type substituties in interessegebieden in het genoom. Een groot voordeel van FL-MRS is dat de gesynthetiseerde transcripten van volledige lengte direct kunnen worden gebruikt om cellen te transfecteren, wat de aanpak eenvoudig en efficiënt maakt voor het genereren van een grote pool van virale varianten. Daarentegen vereisen circulaire polymerase-extensie en Mu-transposon-insertiemutagenesemethoden klonen van het PCR-product en screening van transformatoren voorafgaand aan de selectie van het gewenste fenotype, wat de diversiteit van de pool van mutanten ernstig beperkt. Hoewel onze methode de kans op het verkrijgen van meerdere gewenste fenotypes aanzienlijk vergroot, is de evaluatie van individuele virale varianten normaal gesproken vereist bij screening.
Integratie van ep-PCR met omgekeerde genetica van het virus stelde ons in staat om snel HCV-mutanten te genereren. Deze methode heeft het potentieel om honderden genetisch gemodificeerde virussen te genereren, een prestatie die schijnbaar niet mogelijk is met de momenteel beschikbare in-vitromutagenesetechnieken . De methode die hier wordt beschreven, is gemakkelijk aan te passen aan cDNA-klonen die (+)ssRNA-virussen dragen die genomen tot ~10 kb lang bevatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financieringssteun (subsidienummer BT/PR10906/MED/29/860/2014) voor deze studie werd verstrekt door het Department of Biotechnology, Government of India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U.
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R.
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
