Summary
Protokollen beskriver en metode til at indføre kontrollerbar genetisk mangfoldighed i hepatitis C-virusgenomet ved at kombinere mutant RNA-syntese i fuld længde ved hjælp af fejlbehæftet PCR og omvendt genetik. Metoden giver en model for fænotypeselektion og kan bruges til 10 kb lange RNA-virusgenomer med positiv sans.
Abstract
Manglen på en bekvem metode til iterativ generering af forskellige virale varianter i fuld længde har hindret undersøgelsen af rettet evolution i RNA-vira. Ved at integrere en fuld RNA-genomfejlbehæftet PCR og omvendt genetik kan tilfældig genom-dækkende substitutionsmutagenese induceres. Vi har udviklet en metode, der bruger denne teknik til at syntetisere forskellige biblioteker for at identificere virale mutanter med fænotyper af interesse. Denne metode, kaldet fuld længde mutant RNA-syntese (FL-MRS), giver følgende fordele: (i) evnen til at oprette et stort bibliotek via en meget effektiv et-trins fejlbehæftet PCR; ii) evnen til at skabe grupper af biblioteker med forskellige niveauer af genetisk mangfoldighed ved at manipulere troskaben af DNA-polymerase iii) oprettelse af et PCR-produkt i fuld længde, der direkte kan tjene som skabelon for mutant RNA-syntese og (iv) evnen til at skabe RNA, der kan leveres til værtsceller som en ikke-valgt inputpulje til screening for virale mutanter af den ønskede fænotype. Vi har ved hjælp af en omvendt genetisk tilgang fundet, at FL-MRS er et pålideligt værktøj til at studere viral-rettet evolution på alle stadier i livscyklussen for hepatitis C-virus, JFH1-isolat. Denne teknik ser ud til at være et uvurderligt værktøj til at anvende rettet evolution til at forstå tilpasning, replikation og rollen som virale gener i patogenese og antiviral resistens i RNA-vira med positiv sans.
Introduction
Fremadrettet genetisk screening begynder med en viral fænotype af interesse og forsøger derefter ved at sekventere sit genom og sammenligne det med den oprindelige stamme at identificere mutationen (e), der forårsager fænotypen. I modsætning hertil introduceres tilfældige mutationer i et målgen i omvendt genetisk screening efterfulgt af en undersøgelse af den resulterende fænotype(r)1. For den omvendte genetiske tilgang er in vitro-mutagenese den mest anvendte teknik til at skabe en pulje af varianter, der efterfølgende screenes for fænotyper af interesse. Forskellige genetiske værktøjer er blevet rapporteret til opnåelse af genom-dækkende tilfældig mutagenese af RNA-vira, herunder fejlbehæftet PCR (ep-PCR)2,3, cirkulær polymeraseforlængelse4 og Mu-transposonindsættelsesmutagenese 5,6,7. De to sidstnævnte metoder giver biblioteker med begrænset sekvensdiversitet og er tilbøjelige til at indføre store indsættelser og sletninger, som er meget dødelige for vira og alvorligt begrænser genopretningen af infektiøse virale varianter.
ep-PCR er en velkendt kraftfuld mutageneseteknik, der i vid udstrækning anvendes inden for proteinteknologi til at generere mutante enzymer til udvælgelse af fænotyper med ønskede egenskaber, såsom forbedret termisk stabilitet, substratspecificitet og katalytisk aktivitet 8,9,10. Denne teknik er let at udføre, fordi den kræver simpelt udstyr, ikke involverer kedelige manipulationer, bruger kommercielt tilgængelige reagenser og er hurtig; Desuden genererer det biblioteker af høj kvalitet.
Her udviklede vi en ny metode til fuld længde mutant RNA-syntese (FL-MRS) til at generere komplette genomer af hepatitis C-virus (HCV) ved at integrere ep-PCR, som inducerer tilfældig genom-dækkende substitutionsmutagenese og omvendt genetik. Selv en enkelt nukleotidindsættelse eller deletion er meget skadelig for RNA-vira med positiv sans ([+]ssRNA); PCR-baseret substitutionsmutagenese er derfor den foretrukne metode til iterativ generering af store, forskelligartede biblioteker af fulde (+)ss RNA-virusgenomer med god levedygtighed.
FL-MRS er en ligetil tilgang, der kan anvendes på enhver RNA-virus med positiv sans med en ~ 10 kb genomlængde gennem det omhyggelige design af et primersæt, der binder til den virale cDNA-klon. pJFH1 er en infektiøs cDNA-klon, der koder for HCV-genotype 2a og kan rekapitulere alle trin i viruslivscyklussen. Ved at bruge FL-MRS-tilgangen demonstrerede vi syntesen af tilfældigt mutageniserede fuldgenombiblioteker (mutantbiblioteker [ML'er]) for at producere replikationskompetente JFH1-varianter, for hvilke der ikke var forudgående kendskab til egenskaberne forbundet med mutationer. Ved eksponering for et antiviralt middel overvandt nogle af de virale varianter hurtigt lægemiddeltrykket med den ønskede fænotypiske ændring. Ved hjælp af protokollen beskrevet her kan der genereres en overflod af virale varianter, hvilket skaber muligheder for at studere udviklingen af (+) ssRNA-vira.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: JFH1-stammen (WT), der blev brugt her, var en venlig gave fra Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. Den menneskelige hepatomcellelinje, Huh7.5, var en venlig gave fra Charles Rice, The Rockefeller University. Et skema over metoden er vist i figur 1.
1. Substitutionsmutagenese af JFH1 for hele genomet ved anvendelse af fejlbehæftet PCR
- For at udføre ep-PCR skal du forberede masterblandingen til fire sæt eksperimenter med primerne J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' og J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (figur 1A) sammen med reaktionskomponenterne beskrevet i tabel 1 uden pJFH1-skabelonen (plasmid isoleret fra JFH1-stamme).
- Masterblandingen alikvote i fire rør, tilsæt 100 ng, 50 ng, 25 ng og 10 ng skabelon i de enkelte rør, og juster det samlede volumen af reaktionen til 50 μL. Cykelbetingelserne i tabel 2 anvendes til at forstærke et 9736 basepar (bp) fragment bestående af T7-promotoren og HCV-genomet i fuld længde (figur 2).
BEMÆRK: ep-PCR-produktet skal indeholde T7-promotorsekvensen for at lette in vitro-transkription af det virale genom. Derfor skal den forreste primer være placeret opstrøms for T7-promotoren af den virale cDNA-klon, og den omvendte primersekvens skal ende ved 3'-enden af virusgenomet for at lette transkriptionsafstrømning. Optimer hver komponent i ep-PCR-reaktionen inden for det område, der anbefales af producenten af Taq DNA-polymerase for at opnå amplifikation med højt udbytte. Ud over varierede skabelonmængder kan ubalancerede dNTP'er (især lav dATP- og / eller dGTP-koncentration) også bruges til at øge mangfoldigheden i længden af virale genomer fra 6-8 kb lange3. - Anslå ep-PCR-produktet forstærket ved at indlæse lige store mængder af PCR-produkterne (5 μL) og sammenligne med kendte mængder af 1 kilobase (kb) DNA-stige ved at køre en 0,8% Tris-acetat-EDTA (TAE)-baseret agarosegelelektroforese11. Rens produktet ved hjælp af et kolonnerensningssæt som anvist af producenten.
- Koncentrationen af det rensede produkt bestemmes ved måling af absorbansen ved 260 nm ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer12. Vakuumkoncentrer ep-PCR-produktet, hvis det er nødvendigt for at opnå en produktkoncentration ≥100 ng/μL.
BEMÆRK: Mere nøjagtig estimering kan foretages ved at indlæse tofoldige serielle fortyndinger af ep-PCR-produkt og sammenligne deres intensiteter med de kendte mængder af 1 kb DNA-stige.
2. Viral RNA-syntese
- Der indstilles en 40 μl reaktion for at fordøje 5 μg klonal-pJFH1 med 4 U XbaI-enzym ved 37 °C i 2 timer, efterfulgt af kolonnerensning og måling af absorbansen ved 260 nm i et mikrovolumenspektrofotometer12. Opsæt en 20 μL in vitro transkriptionsreaktion af det kolonneoprensede ep-PCR-produkt eller klonal-pJFH1 (WT) ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt RNA-produktionssystem i stor skala i henhold til producentens anvisninger.
- I et 200 μL mikrocentrifugeglas blandes ca. 1 μg af det oprensede ep-PCR-produkt (mutantbiblioteker) eller XbaI-fordøjet klonal-pJFH1, 10 μL 2x buffer indeholdende ribonukleotider og 2 μL T7-enzymblanding. Bland alle komponenterne og drej komponenterne kort ned. Reaktionsblandingen inkuberes ved 37 °C i 45 minutter, efterfulgt af tilsætning af 1 U RNasefrit DNase-enzym og inkubation ved 37 °C i 30 minutter (figur 1C).
- Purify in vitro syntetiseret RNA ved hjælp af et RNA-oprydningssæt i henhold til producentens anvisninger, eluer i 40 μL RNase- og DNasefrit vand, og estimer koncentrationen af det oprensede RNA ved at måle absorbansen ved 260 nm ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer12. Der laves alikvoter efter behov (5 μg eller 2 μg) for at undgå fryseoptøning og opbevares ved -80 °C. Kontroller integriteten og størrelsen af de virale transkripter ved hjælp af 2 μg RNA til en MOPS-formaldehyd 0,8% agarosegelelektroforese13 (figur 3).
3. Estimering af andelen af mutationer i ep-PCR-produkter (mutantbiblioteker)
BEMÆRK: I dette trin er andelen af nukleotider muteret ved subkloning af produktet opnået i trin 2. blev anslået til at demonstrere fordelen ved at anvende ep-PCR til at skabe genetisk heterogenitet ved hjælp af to fuldgenommutantbiblioteker (ML50 og ML25) og klonale pJFH1-afledte virale RNA'er. Andelen af mutationer blev estimeret i HCV NS5A-genet, som også var det fænotypiske udlæsningsgen (lægemiddelresistens) i denne undersøgelse.
- Opsæt en 20 μL cDNA-syntesereaktion ved at tilsætte ca. 1 μg af det virale RNA syntetiseret i trin 2., 5 μM omvendt primer 5'-GTGTACCTAGTGTGCCGCTCTA-3' og 200 U revers transkriptase i henhold til producentens anbefalinger.
- Brug cDNA til at forstærke et 2571 bp-fragment, der omfatter det komplette NS5A-gen. For at gøre dette fremstilles en reaktionsblanding indeholdende 0,5 μM til 5272F og 7848R primere (slutkoncentration; Tabel 3), 1,5 mM MgCl2, 1x PCR-buffer og 1 U high-fidelity Taq-polymerase i et samlet volumen på 50 μL og køre en amplifikationscyklus under anvendelse af betingelserne beskrevet i tabel 4.
- Kør produktet på en 0,8% TAE-baseret agarosegel for at bekræfte produktstørrelsen på 2571 bp, og rens derefter produktet ved hjælp af et søjlerensningssæt som anvist af producenten. Det søjlerensede produkt elueres i 40 μL sterilt vand.
- For at tilføje et 3' A-udhæng til produktet tilsættes 0,5 μM dATP og 1 U Taq DNA-polymerase med lav nøjagtighed og inkuberes hele PCR-produktet ved 70 °C i 30 minutter sammen med 1x PCR-buffer og 1,5 mMMgCl2 (slutkoncentration). Rens blandingen ved hjælp af et kolonnerensningssæt som anvist af producenten
BEMÆRK: Alternativt kan du beskatte det ~ 9,7 kb lange produkt fra gelen fra trin 1.4. og udføre kloning ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit til kloning af lang-PCR-produkt i henhold til producentens instruktioner eller udføre NGS af ep-PCR-produktet ved hjælp af en Illumina-platform2. - Der opsættes en ligeringsreaktion ved at tilsætte 5 μL 2x ligeringsbuffer, 50 ng af T-vektor-DNA'et, ca. 3 gange molært overskud af insert-DNA'et syntetiseret i trin 3.4., 3 Weiss-enheder T4-DNA-ligase og nukleasefrit vand til et samlet volumen på 10 μL. Denne reaktion inkuberes ved stuetemperatur i 3 timer, og der tilsættes derefter 100 μL Escherichia coli DH5α med det ligerede DNA; varmechok cellerne ved 42 °C i 35 s (figur 1B).
- Der tilsættes 1 ml Luria-Bertani (LB) substrat (uden antibiotika) og inkuberes under forsigtig omrystning i 1 time ved 37 °C til genvinding. Cellesuspensionen centrifugeres ved 13.800 x g, supernatanten kasseres, og opslæmmes igen i 200 μl frisk LB-substrat.
- Plade 100 μL af de transformerede E. coli DH5α-celler på en LB-plade indeholdende 50 μg/ml ampicillin og inkuberes ved 37 °C i 16 timer. Opsæt minipreps af 25-30 kolonier i 5 ml LB medium + 50 μg/ml ampicillin og dyrk natten over ved 37 °C.
- Den næste dag ekstraheres plasmiderne med et plasmidrensningssæt i henhold til producentens anvisninger og udfører restriktionsenzymfordøjelse i 10 μL volumen med 200 ng af de isolerede plasmider, 2 U EcoR1 og 1x restriktionsbuffer for alle kolonierne.
- Efter inkubation af fordøjelsesblandingerne ved 37 °C i 3 timer opløses produkterne på 0,8 % TAE-baseret agarosegel for at bekræfte plasmid-DNA-indsættelsen.
- Udfør Sanger-sekventering af plasmiderne fra 25 positive kloner ved hjælp af M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF og 6748-SPF primere (tabel 3) for at bestemme andelen af mutationer (udtrykt som andelen af nukleotider muteret) i virale RNA'er afledt af bibliotekerne og klonal pJFH1 (figur 1B og figur 4).
4. Viral RNA-transfektion af Huh7.5-cellelinjen
BEMÆRK: Brug RNase/DNase-frie vævskulturmaterialer og arbejd i et sterilt klasse II biosikkerhedsskab. Arbejde i den anbefalede indeslutningsfacilitet i henhold til organisationens retningslinjer for biosikkerhed.
- Oprethold Huh7,5-celler ved at inkubere i en 5% CO 2 -inkubator ved 37 ° C i en T75 cm2 vævskulturkolbe indeholdende 15 ml komplet Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suppleret med 10% (vol / vol) føtalt bovint serum, penicillin (100 E / ml) og streptomycin (100 μg / ml; Figur 1D).
- Opdel cellerne i forholdet 1: 3, når sammenløbet når 90%. Cellerne vaskes med 1x forvarmet fosfatbufret saltvand (PBS; pH 7,4). Der tilsættes 5 ml 1x trypsin-EDTA-opløsning for at dække cellelaget helt, hvirvler forsigtigt kolben rundt, og kolben inkuberes derefter ved 37 °C i 5 minutter.
BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere; Cellerne inkuberes, indtil cellelaget er helt løsrevet fra cellekulturkolbens overflade. - Tilsæt 10 ml 1x forvarmet komplet DMEM, spred cellerne ved gentagen pipettering, og opsaml cellesuspensionen i et 15 ml eller 50 ml sterilt centrifugerør. Centrifuger cellesuspensionen ved 252 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, cellepelletsen resuspenderes i 6 ml komplet DMEM, og cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5 % CO2.
- Gentag trin 4.2 for kontinuerlig vedligeholdelse af naive, transfekterede eller virusinficerede Huh7.5-celler. og trin 4.3.
- 1 dag før transfektion opdeles cellerne som beskrevet i trin 4.1.-4.3., antallet af levedygtige celler tælles ved hjælp af et hæmocytometer, Huh7,5-cellerne frøes med en densitet på 0,6 x 106 i 35 mm skåle i 2 ml komplet DMEM, og cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet inkubator med 5% CO2.
- Den følgende dag skal du forberede transkript-lipidkomplekset. For at gøre dette fortyndes 10 μL transfektionsreagens i 50 μL minimalt essentielt medium og fortyndes separat 5 μg virale transkripter i 50 μL minimalt essentielt medium.
- Begge blandinger inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter, og blandes derefter i et enkelt sterilt mikrocentrifugerør og inkuberes yderligere blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter for at danne transkriptlipidkomplekset.
- Efter 16 timers celleinkubation fjernes dyrkningsmediet fra dyrkningsskålen, cellerne vaskes 2x med forvarmet 1x PBS, og der tilsættes 1,5 ml minimalt essentielt medium. Tilsæt langsomt transkript-lipidkomplekset til skålen og hvirvl forsigtigt med hænderne for at sikre ensartet fordeling af komplekserne.
- Cellerne inkuberes i en 5% CO2 -inkubator ved 37 °C i 10 timer. Fjern derefter mediet, vask de transfekterede celler 2x med 1 ml forvarmet 1x PBS, og tilsæt 2 ml komplet DMEM.
5. Virus produktion
- Opdel de transfekterede Huh7.5-celler hver 2. dag eller 3. dag, når de når 90% sammenløb. Virussupernatanterne indsamles ved hver opdeling og opbevares ved -80 °C til yderligere analyse.
- Ved hver opdeling overvåges spredningen af virussen ved hjælp af et fokusdannende assay (FFA) som beskrevet i trin 6.2. Høst virussen, indtil virusspredningen når >80% af transfekterede celler (figur 1D).
BEMÆRK: Opdel de transfekterede celler i forholdet 1: 1 i de første par passager for at redde det maksimale antal virale varianter. Virusspredningen aftager, og levedygtigheden falder med stigende andele af mutationer i fuldgenomet ML'er2.
6. Kvantificering af virustitere
- Kvantificering af viralt RNA
- Virale RNA isoleres fra 140 μL kultursupernatanter ved hjælp af et viralt RNA-isolationssæt i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Opsæt en 10 μL qRT-PCR-reaktion ved hjælp af et kommercielt qRT-PCR-sæt i henhold til producentens anvisninger. Brug den fremadrettede primer R6-130-S17, omvendt primer R6-290-R19 (slutkoncentration 0,2 μM hver) og sonde R9-148-S21FT (slutkoncentration 0,3 μM) til HCV RNA-kvantificering (tabel 3). Indstil kørselsbetingelserne til 48 °C i 20 minutter, 95 °C i 10 minutter og derefter 45 cyklusser med 95 °C i 15 sekunder og 60 °C i 1 min.
BEMÆRK: Sonden skal indeholde fluorescerende reporterfarvestof 6-carboxyfluorescein (FAM) og quencher farvestof 6-carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAMRA) i henholdsvis 5' og 3' ender. - Kør reaktioner i en PCR-maskine i realtid. Opsæt negative kontroller, dvs. RNA ekstraheret fra supernatanterne i mock-inficerede celler og nukleasefrit vand samtidigt for at sikre fraværet af krydskontaminering.
- Parallelt genereres en standardkurve ved hjælp af et 10 gange serielt fortyndet kendt kopiantal HCV-transkripter (1 x 108 til 0) til kvantificering af viralt RNA. Kvantificeringen udføres i tre eksemplarer (figur 1D).
- Kvantificering af infektiøs virustiter ved anvendelse af 50 % vævskultur infektiøs dosis (TCID50)
- Ca. 16 timer før tilsætning af virussen plades 6,5 x 103 Huh7,5 celler/brønd i en 96-brønds plade og inkuberes cellerne ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator.
- I et biosikkerhedsklasse II-kabinet udføres 10 gange serielle fortyndinger (1 ml hver), der dækker 1 x 10-1 til 1 x 10-6 fortyndinger (otte fortyndinger) af den høstede virus (opnået, når virusspredningen når >80% af cellerne som beskrevet i trin 5.). Der tilsættes 100 μL/hul (med otte replikater) af den fortyndede virus for at inficere Huh7,5-cellerne, og pladen opbevares i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 3 dage.
- Efter 3 dage vaskes de inficerede celler 3x med 0,1 ml PBS hver gang, og cellerne fikseres og permeabiliseres med 0,1 ml iskold methanol ved -20 °C i 20 minutter. Vask hullerne med 1x PBS 3x og derefter 1x med PBS-T (1x PBS/0,1% [v/v] Tween-20).
- Efter fjernelse af PBS-T blokeres cellerne i 30 minutter ved stuetemperatur med 0,1 ml 1% bovint serumalbumin (BSA) indeholdende 0,2% skummetmælk i PBST. Den blokerende opløsning fjernes og cellerne behandles i 5 minutter med 0,1 ml 3%H2O2fremstillet i 1x PBS.
- Vask igen cellerne 2x med 1x PBS og 1x med PBS-T, tilsæt derefter 50 μL / hul anti-NS5A 9E10 mAb (1:10000, lager 1 mg / ml; en venlig gave fra Charles Rice, The Rockefeller University), og inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Brøndene vaskes igen 3x med 1x PBS og 1x med PBS-T.
- Der tilsættes 50 μL/hul HRP-konjugeret sekundær IgG (1:4000), inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur, og det ubundne antistof fjernes derefter ved at vaske hullerne med 0,1 ml 1x PBS.
- Tilsæt 30 μL DAB (diaminobenzidintetrahydrochlorid) farvesubstrat og inkuber pladen med forsigtig vuggen i 10 minutter ved stuetemperatur. Substratet udvikler et brunt bundfald på brøndoverfladen, der indikerer HCV NS5A-antigen. Fjern DAB-opløsningen og vask hullerne 2x med 1x PBS og 1x med destilleret vand. Der tilsættes 100 μL PBS indeholdende 0,03% natriumazid.
- Undersøg hver brønd under et omvendt lysmikroskop ved hjælp af et 10x mål. Tæl antallet af positive brønde. Hvis brønden indeholder en eller flere NS5A-positive celler, er den positiv; hvis brønden viser et fravær af NS5A-positive celler, er den negativ. Brug en Reed and Muench-beregner til at estimere slutpunktsfortyndingen, der inficerer 50% af brøndene (TCID50)14,15. En gensidig fortynding, der kræves for at give TCID50, er virusinfektivitetsetiteren (focidannende enheder) pr. volumenenhed.
BEMÆRK: Virusinfektivitetstitre varierer for forskellige mutantbiblioteker.
7. Valg af lægemiddelresistent viral variant
- Pibrentasvir (PIB), en NS5A-hæmmer, opløses i 100% DMSO til en koncentration på 1 mM og fortyndes yderligere i komplet DMEM til en koncentration på 10 nM.
- For at bestemme den effektive koncentration af PIB på 50 % frøs Huh7,5-celler med en densitet på 0,6 x 106/brønd i en 6-brønds plade og inkuberer cellerne ved 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator. Efter 16 timers celleinkubation tilsættes en virusdosis af enten ML50- eller klonal JFH1-virus for at inficere 50 % af cellerne, og derefter behandles cellerne 12 timer efter infektion (h p.i.) med en dobbelt fortyndingsserie af PIB fra 0,5-100 pM. Mål FFA og kvantificer FFU som i trin 6.2. efter 3 dages inkubation.
- Plot dosis-responskurverne ved hjælp af FFU-reduktionsassayværdier i statistisk analysesoftware. Fra sigmoidalkurven opnås den effektive koncentration på 50% (EC50; Figur 5).
BEMÆRK: Det effektive koncentrationsområde kan variere afhængigt af klassen, mellem HCV-antivirale lægemidler af samme klasse og afhængigt af mutantbiblioteket. - Til eksperimentet inficeres naive Huh7.5-celler ved 70% sammenløb med en ML50-virus (varianter afledt af ML50 RNA) dosis for at inficere 50% af cellerne i 12 timer og derefter overføre de inficerede celler til 6-brøndplader 24 timer efter infektion.
- Der tilsættes 1x EC50 PIB (47,3 pM) til de inficerede celler efter 16 timers celledeling. Gør dette efter hver celledeling i seks på hinanden følgende passager (18 dage), efterfulgt af tre stoffrie passagecyklusser, og overvåg virusspredning ved hjælp af FFA'er som beskrevet i trin 6.2. Opskalering af FFA-reagenser i henhold til vækstområdet. Der høstes evirale supernatanter ved hver passage og opbevares ved -80 °C indtil brug.
BEMÆRK: Viral spredning til mere end 50% af cellerne under behandlingsopfølgning kan defineres som et gennembrud, og viral spredning i lægemiddeludtagningsperioden kan defineres som viralt tilbagefald16. - Viralt RNA ekstraheres fra supernatanten på dag 18 som beskrevet i trin 6.1.1, og derefter syntetiseres cDNA som vist i trin 3.1. NS5A-genet amplificeres ved hjælp af 5 μL 1:5 fortyndet cDNA og PCR-komponenterne beskrevet i trin 3.2. Følg derefter trin 3.3.-3.5. at bestemme NS5A-lægemiddelresistensmutationer i 6-8 positive bakterielle plasmider ved anvendelse af NS5A-sekventeringsprimerne 6186F, 6862F og 6460R (tabel 3 og tabel 4).
BEMÆRK: Her i dette studie rapporterede vi substitutioner i NS5A af varianter udvalgt under PIB-behandling ved 1x EC50. Dette vil udelukke bidraget fra andre substitutioner end NS5A til nedsat modtagelighed for PIB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En overflod af HCV-varianter i fuld længde kan genereres og screenes for lægemiddelresistente fænotyper af interesse ved at følge procedurerne beskrevet i figur 1. Fuldgenommutantbiblioteker blev syntetiseret ved hjælp af klonal-pJFH1 i faldende mængder (100-10 ng), som vist i figur 2. Det gennemsnitlige udbytte af ep-PCR-produkter (mutantbiblioteker) varierede fra 3,8-12,5 ng/μL. Figur 3 viser de virale transkripter syntetiseret fra klonal-pJFH1 og det repræsentative mutantbibliotek (ML50 syntetiseret ved hjælp af 50 ng klonal-pJFH1). Den klonale-pJFH1 blev lineariseret via XbaI-fordøjelsen , mens ML50 blev anvendt direkte i in vitro-transkriptionsreaktionen . Andelen af mutationer i mutante biblioteker (mutante virale RNA'er) steg med faldende input pJFH1 i ep-PCR-reaktionen, som vist i figur 4. ML50 syntetiseret ved hjælp af 50 ng af skabelonen (klonal-pJFH1) havde 4 substitutioner pr. 10.000 bp kopieret, mens ML25 syntetiseret ved hjælp af 25 ng skabelon indeholdt 9 substitutioner. Der blev ikke fundet substitutioner inden for antallet af sekventerede nukleotider i klonal-pJFH1. ML50-virusvarianter var mindre modtagelige (12,7 gange) for pibrentasvir, en NS5A-hæmmer, sammenlignet med klonal-JFH1-virus, som vist i figur 5. Tabel 5 har NS5A-substitutioner identificeret i ML50-virusvarianter udvalgt mod 1x EC50 af pibrentasvirbehandling. Af de otte NS5A-kloner havde fire en kombination af D7V + F28C, mens V8A + F28C og F36L forekom i en klon hver. Disse mutationer var i N-terminalregionen NS5A, som vides at rumme klinisk relevante NS5A-resistensmutationer17.
Figur 1: Skematisk oversigt over FL-MRS-strategien og valg af lægemiddelresistent fænotype. (A) pJFH1 cDNA (vildtype) klon bærer et genotype 2a-virusgenom i fuld længde og T7-promotor. Primeren J-For er opstrøms for T7-promotoren, og primeren J-Rev er placeret i 3'-enden af HCV-genomet. (B) Klonal-pJFH1 er tilfældigt mutageniseret ved hjælp af fejlbehæftet PCR til at konstruere genetiske variationer og skabe fulde genommutantbiblioteker. Klonal-pJFH1 er lineær af XbaI fordøjelse. (C) Ep-PCR-produkter med fuldt genom og lineariseret klonal-pJFH1 er skabelonerne til in vitro-transkription . Andelen af mutationer i virale RNA'er af ML'er og klonal-JFH1 blev bestemt ved TA-subkloning af NS5A og Sanger-sekventering af positive TA-kloner. (D) Replikationskompetente varianter genereret efter mutant viral RNA-transfektion af Huh7.5-celler blev behandlet med pibrentasvir (en NS5A-hæmmer) til udvælgelse af NS5A-resistente fænotyper. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Agarosegelelektroforese af ep-PCR-produkter. HCV ep-PCR-produkter med fuld genom syntetiseret ved hjælp af varierende skabelonmængder (100 ng, 50 ng, 25 ng og 10 ng pJFH1) blev separeret under anvendelse af 0,8% TAE agarosegelelektroforese. Den forventede størrelse af ep-PCR-produktet er 9,7 kb. De adskilte produkter blev visualiseret ved ethidiumbromidfarvning. Bane 1 er en 1 kb DNA-stige; Bane 6 er ingen skabelonkontrol (mærket som H2O). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: MOPS-formaldehydagarosegelelektroforese af virale transkripter. Lineariseret pJFH1 (bane 2) og mutantbiblioteket opnået med 50 ng (ML50) pJFH1 indeholdende ep-PCR (bane 3) blev brugt som skabeloner til in vitro-transkriptionsreaktionen. Transkripternes integritet blev analyseret under anvendelse af en MOPS-formaldehyd 0,8% agarosegel farvet med ethidiumbromid. Bane 1 er en 1 kb RNA-stige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Andel af substitutioner i mutantbiblioteker. NS5A-gener fra RNA'er af klonal-pJFH1, ML50 og ML25 blev amplificeret i high-fidelity PCR'er efterfulgt af tilsætning af 3' A-udhæng, ligering af produktet med T-vektor og transformation af E. coli DH5α med det ligerede produkt. Omkring 40.000 nukleotider/bibliotek eller klonal-pJFH1 blev Sanger-sekventeret. En gennemsnitlig andel af mutationer pr. 10.000 bp kopieret vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skøn over EC50 af pibrentasvir i forhold til ML50-varianter. Huh7.5-celler blev inficeret med klonal-JFH1-virus eller ML50-varianter og behandlet med serielle tofoldsfortyndinger startende ved 100 pM pibrentasvir efterfulgt af FFA efter 3 dage. Sigmoide dosis-responskurver ved hjælp af FFU-reduktionsassayværdier blev plottet i statistisk analysesoftware for at estimere den effektive koncentration på 50%. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponenter til 50 μL | Påkrævet lagerværdi | Endelig koncentration/reaktion |
| 10x PCR-buffer | 5,0 μL | 1x |
| MgCl2 (50 mM) | 1,5 μL | 1,5 mM |
| KB Extender | 2,0 μL | - |
| dNTP'er (10 mM) | 1,0 μL | 0,2 mM |
| Fremadgående primer (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Omvendt primer (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Taq DNA-polymerase (10 U / μL) | 0,5 μL (1:4 fortyndet) | 1 U |
| Skabelon (pJFH1, 20 ng/μL) | 0,5 til 5,0 μL | 10 til 100 NG |
| Vand | 32,5 til 37,5 μL | Juster til endelig volumen på 50 μL |
Tabel 1. Ep-PCR-komponenter til amplifikation af HCV-helgenom.
| Temperatur | Tidspunkt | Cyklus(er) |
| 95 °C | 3 minutter | 1 |
| 95 °C | 30 sek | 30 |
| 60 °C | 25 sek | |
| 72 °C | 8 minutter | |
| 72 °C | 10 minutter | 1 |
| 4 °C | Holde |
Tabel 2. Cykelbetingelser for ep-PCR af HCV helgenom.
| Undersøgelse | Primer | Sekvens (5'-3') |
| Forstærkning af delvis NS4B-NS5A-delvis NS5B | 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| cDNA-syntese | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR | R9-148-S21FT (TaqMan-sonde) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6-130-S17 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| R6-290-R19 | AGTACCAAGGCCTTTCG | |
| Sekventering af primere til bestemmelse af proportioner af mutationer i ep-PCR-produkter | 6208-SPF | CCCAACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-SPF | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| NS5A gensekventering (og til bestemmelse af proportioner af mutationer i ep-PCR-produkter) | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
Tabel 3. Primere og sekvenser, der anvendes i assays.
| Temperatur | Tidspunkt | Cyklus(er) |
| 95 °C | 4 minutter | 1 |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 68 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minutter | |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 66 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minutter | |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 64 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minutter | |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 62 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minutter | |
| 95 °C | 30 sek | 10 |
| 60 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minutter | |
| 72 °C | 10 minutter | 1 |
| 4 °C | Holde |
Tabel 4. Cykelbetingelser for NS5A-forstærkning.
| Udskiftning(er) | Nej. Antal kloner (n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36L | 1 |
Tabel 5. Pibrentasvir-resistenssubstitutioner af NS5A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse har vi beskrevet en enkel og hurtig FL-MRS-procedure, der integrerer ep-PCR18 og omvendt genetik til syntetisering af HCV-fuldgenombiblioteker, som derefter kan bruges i et cellekultursystem til at generere replikationskompetente varianter til screening af lægemiddelresistente fænotyper. Anvendelsen af Taq DNA-polymerase med lav nøjagtighed er en forudsætning for ep-PCR, der tillader inkorporering af substitutioner under PCR-amplifikation af et viralt genom i fuld længde. Vi testede flere Taq DNA-polymeraser med lav nøjagtighed og fandt ud af, at Platinum Taq DNA-polymerase gav et ep-PCR-produkt i størrelse ~ 10 kb med et højt udbytte (data ikke vist). Vi anbefaler at bruge et fast antal termiske cyklusser og variere inputskabelonmængden for at kontrollere andelen af mutationer i fuldgenombibliotekerne. Da FL-MRS anvender fejlagtige fulde genomer som skabeloner til virale RNA'er i fuld længde, er et omhyggeligt design af primersættet afgørende for at sikre, at RNA-syntesereaktionen producerer virustranskripter af defineret længde: (i) den fremadgående primer skal være placeret opstrøms (~ 50 nukleotider) for T7-promotoren af cDNA-klonen for at lette T7-polymerasebinding til ep-PCR-produktet; og (ii) den omvendte primersekvens skal ende ved 3'-enden af virusgenomet for at lette transkriptionsafstrømning under in vitro RNA-syntese.
Metoden er dog relativt rå, og der er ingen kontrol med at inkorporere det krævede antal og type substitutioner i regioner af interesse for genomet. En stor fordel ved FL-MRS er, at de syntetiserede transkripter i fuld længde direkte kan bruges til at transfektere celler, hvilket gør tilgangen enkel og effektiv til generering af en stor pulje af virale varianter. I modsætning hertil kræver metoder til cirkulær polymeraseudvidelse og Mu-transposonindsættelsesmutagenese kloning af PCR-produktet og screening af transformanter inden valg af den ønskede fænotype, hvilket alvorligt begrænser mangfoldigheden af puljen af mutanter. Selvom vores metode i høj grad øger chancen for at give flere ønskede fænotyper, er evaluering af individuelle virale varianter normalt påkrævet i screening.
Integration af ep-PCR med virus omvendt genetik tillod os hurtigt at generere HCV-mutanter. Denne metode har potentiale til at generere hundredvis af genetisk modificerede vira, hvilket tilsyneladende ikke er muligt med de in vitro-mutageneseteknikker, der findes i øjeblikket. Metoden, der er beskrevet her, kan let tilpasses cDNA-kloner, der bærer enhver (+) ssRNA-virus, der indeholder genomer op til ~ 10 kb i længden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Finansieringsstøtte (bevillingsnummer BT/PR10906/MED/29/860/2014) til denne undersøgelse blev ydet af Department of Biotechnology, Indiens regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U.
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R.
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
