Summary
Protokollen beskriver en metode for å introdusere kontrollerbart genetisk mangfold i hepatitt C-virusgenomet ved å kombinere full lengde mutant RNA-syntese ved hjelp av feilutsatt PCR og omvendt genetikk. Metoden gir en modell for fenotypeseleksjon og kan brukes til 10 kb lange positive sense RNA-virusgenomer.
Abstract
Mangelen på en praktisk metode for iterativ generering av forskjellige virusvarianter i full lengde har hindret studiet av rettet evolusjon i RNA-virus. Ved å integrere en full RNA-genomfeilutsatt PCR og omvendt genetikk, kan tilfeldig genom-bred substitusjonsmutagenese induseres. Vi har utviklet en metode ved hjelp av denne teknikken for å syntetisere forskjellige biblioteker for å identifisere virale mutanter med fenotyper av interesse. Denne metoden, kalt full lengde mutant RNA-syntese (FL-MRS), gir følgende fordeler: (i) evnen til å lage et stort bibliotek via en svært effektiv ett-trinns feilutsatt PCR; (ii) evnen til å skape grupper av biblioteker med varierende nivåer av genetisk mangfold ved å manipulere troskapen til DNA-polymerase; (iii) opprettelsen av et full-lengde PCR-produkt som direkte kan tjene som en mal for mutant RNA-syntese; og (iv) evnen til å lage RNA som kan leveres inn i vertsceller som et ikke-valgt inngangsbasseng for å skjerme for virale mutanter av ønsket fenotype. Vi har funnet, ved hjelp av en omvendt genetikktilnærming, at FL-MRS er et pålitelig verktøy for å studere virusrettet evolusjon i alle stadier i livssyklusen til hepatitt C-viruset, JFH1-isolatet. Denne teknikken ser ut til å være et uvurderlig verktøy for å bruke rettet evolusjon for å forstå tilpasning, replikasjon og rollen som virale gener i patogenese og antiviral resistens i positiv forstand RNA-virus.
Introduction
Fremskutt genetisk screening begynner med en viral fenotype av interesse, og deretter, gjennom sekvensering av genomet og sammenligning med den opprinnelige stammen, forsøker å identifisere mutasjonen (e) som forårsaker den fenotypen. I motsetning til dette, i omvendte genetiske skjermer, blir tilfeldige mutasjoner introdusert i et målgen, etterfulgt av en undersøkelse av den resulterende fenotypen (e)1. For omvendt genetikk tilnærming er in vitro mutagenese den mest brukte teknikken for å skape et basseng av varianter som deretter screenes for fenotyper av interesse. Ulike genetiske verktøy har blitt rapportert for å oppnå genom-bred tilfeldig mutagenese av RNA-virus, inkludert feilutsatt PCR (ep-PCR) 2,3, sirkulær polymeraseforlengelse4 og Mu-transposon innsetting mutagenese 5,6,7. De to sistnevnte metodene gir biblioteker som har begrenset sekvensmangfold og er utsatt for innføring av store innsettinger og slettinger, som er svært dødelige for virus og sterkt begrenser utvinningen av smittsomme virusvarianter.
ep-PCR er en velkjent kraftig mutageneseteknikk som er mye brukt i proteinteknikk for å generere mutante enzymer for valg av fenotyper med ønskede egenskaper, for eksempel forbedret termisk stabilitet, substratspesifisitet og katalytisk aktivitet 8,9,10. Denne teknikken er enkel å utføre fordi den krever enkelt utstyr, involverer ikke kjedelige manipulasjoner, bruker kommersielt tilgjengelige reagenser og er rask; Videre genererer det biblioteker av høy kvalitet.
Her utviklet vi en ny metode for full lengde mutant RNA-syntese (FL-MRS) for å generere komplette genomer av hepatitt C-virus (HCV) ved å integrere ep-PCR, som induserer tilfeldig genom-bred substitusjonsmutagenese og omvendt genetikk. Selv en enkelt nukleotidinnsetting eller sletting er svært skadelig for RNA-virus med positiv følelse ([+] ssRNA); Derfor er PCR-basert substitusjonsmutagenese den foretrukne metoden for iterativ generering av store, varierte biblioteker med fulle (+) ss RNA-virusgenomer med god levedyktighet.
FL-MRS er en enkel tilnærming som kan brukes på ethvert RNA-virus med positiv følelse med en ~ 10 kb genomlengde gjennom den omhyggelige utformingen av et primersett som binder seg til den virale cDNA-klonen. pJFH1 er en smittsom cDNA-klon som koder for HCV-genotype 2a og kan rekapitulere alle trinnene i virusets livssyklus. Ved å bruke FL-MRS-tilnærmingen demonstrerte vi syntesen av tilfeldig mutageniserte fullgenombiblioteker (mutantbiblioteker [MLs]) for å produsere replikasjonskompetente JFH1-varianter der det ikke var noen forkunnskaper om egenskapene forbundet med mutasjoner. Ved eksponering for et antiviralt middel overvant noen av virusvariantene raskt medikamenttrykket med ønsket fenotypisk forandring. Ved hjelp av protokollen beskrevet her, kan en mengde virusvarianter genereres, noe som skaper muligheter for å studere utviklingen av (+) ssRNA-virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: JFH1-stammen (WT) som ble brukt her, var en snill gave fra Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. Den menneskelige hepatomcellelinjen, Huh7.5, var en snill gave fra Charles Rice, The Rockefeller University. Et skjema over metoden er vist i figur 1.
1. Genom-bred substitusjonsmutagenese av JFH1 ved bruk av feilutsatt PCR
- For å utføre ep-PCR, klargjør masterblandingen for fire sett med eksperimenter med primere J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' og J-Rev 5'-CATGATCTGCAGCAGAGAGAGAGAGGTACGGCACTCTC -3' (figur 1A), sammen med reaksjonskomponentene beskrevet i tabell 1 uten pJFH1-malen (plasmid isolert fra JFH1-stammen).
- Aliquot masterblandingen i fire rør, tilsett 100 ng, 50 ng, 25 ng og 10 ng mal i de enkelte rørene, og juster det totale volumet av reaksjonen til 50 μL. Påfør syklusbetingelsene beskrevet i tabell 2 for å forsterke et 9736 basepar (bp) fragment bestående av T7-promotoren og HCV-genomet i full lengde (figur 2).
MERK: Ep-PCR-produktet må inneholde T7-promotorsekvensen for å lette in vitro-transkripsjon av virusgenomet. Derfor må den fremre primeren være plassert oppstrøms for T7-promotoren til den virale cDNA-klonen, og den omvendte primersekvensen skal ende ved 3'-enden av virusgenomet for å lette transkripsjonsavrenningen. Optimaliser hver komponent av ep-PCR-reaksjonen innenfor det området som anbefales av produsenten av Taq DNA-polymerase for å oppnå høy utbytteamplifikasjon. I tillegg til varierte malmengder, kan ubalanserte dNTP (spesielt lav dATP og / eller dGTP-konsentrasjon) også brukes til å øke mangfoldet i lengden av virale genomer fra 6-8 kb lang3. - Estimere ep-PCR-produktet forsterket ved å laste like volumer av PCR-produktene (5 μL) og sammenligne med kjente mengder 1 kilobase (kb) DNA-stige ved å kjøre en 0.8% Tris-acetat-EDTA (TAE) -basert agarosegelelektroforese11. Rens produktet ved hjelp av et kolonnerensingssett som instruert av produsenten.
- Estimere konsentrasjonen av det rensede produktet ved å måle absorbansen ved 260 nm ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer12. Vakuumkonsentrer ep-PCR-produktet om nødvendig for å oppnå en produktkonsentrasjon ≥100 ng / μL.
MERK: Mer nøyaktig estimering kan gjøres ved å laste to ganger serielle fortynninger av ep-PCR-produkt og sammenligne intensitetene med de kjente mengdene på 1 kb DNA-stige.
2. Viral RNA-syntese
- Sett opp en 40 μL-reaksjon for å fordøye 5 μg klonal-pJFH1 med 4 U XbaI-enzym ved 37 °C i 2 timer, etterfulgt av kolonnerensing og måling av absorbansen ved 260 nm i et mikrovolumspektrofotometer12. Sett opp en 20 μL in vitro transkripsjonsreaksjon av det kolonnerensede ep-PCR-produktet eller klonal-pJFH1 (WT) ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig storskala RNA-produksjonssystem i henhold til produsentens instruksjoner.
- I et 200 μL mikrosentrifugerør blander du ca. 1 μg av det rensede ep-PCR-produktet (mutante biblioteker) eller XbaI fordøyd klonal-pJFH1, 10 μL 2x buffer inneholdende ribonukleotider og 2 μL T7 enzymblanding. Bland alle komponentene og spinn ned komponentene kort. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 °C i 45 minutter, etterfulgt av tilsetning av 1 E RNase-fritt DNase-enzym og inkubasjon ved 37 °C i 30 minutter (figur 1C).
- Rens in vitro-syntetisert RNA ved hjelp av et RNA-oppryddingssett i henhold til produsentens instruksjoner, eluer i 40 μL RNase- og DNase-fritt vann, og estimere konsentrasjonen av det rensede RNA ved å måle absorbansen ved 260 nm ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer12. Lag alikoter etter behov (5 μg eller 2 μg) for å unngå frysetining og oppbevar dem ved -80 °C. Bekreft integriteten og størrelsen på virale transkripsjoner ved å bruke 2 μg RNA for et MOPS-formaldehyd 0,8% agarosegelelektroforese13 (figur 3).
3. Estimering av andelen mutasjoner i ep-PCR-produkter (mutantbiblioteker)
MERK: I dette trinnet muterte andelen nukleotider ved å underklone produktet oppnådd i trinn 2. ble anslått å demonstrere fordelen ved å bruke ep-PCR for å skape genetisk heterogenitet ved å bruke to fulle genommutantbiblioteker (ML50 og ML25) og klonale pJFH1-avledede virale RNAer. Andelen mutasjoner ble estimert i HCV NS5A-genet, som også var det fenotypiske avlesningsgenet (medikamentresistens) i denne studien.
- Sett opp en 20 μL cDNA-syntesereaksjon ved å tilsette ca. 1 μg av det virale RNA syntetisert i trinn 2., 5 μM omvendt primer 5'-GTGTACCTAGTGTGCCGCCGCTCTA-3' og 200 U revers transkriptase i henhold til produsentens anbefalinger.
- Bruk cDNA, amplifiser et 2571 bp-fragment som består av hele NS5A-genet. For å gjøre dette, lag en reaksjonsblanding inneholdende 0,5 μM for 5272F og 7848R primere (endelig konsentrasjon; Tabell 3), 1,5 mM MgCl2, 1x PCR-buffer og 1 U høy-fidelity Taq-polymerase i et totalvolum på 50 μL og kjører en amplifikasjonssyklus ved bruk av betingelsene beskrevet i tabell 4.
- Kjør produktet på en 0,8% TAE-basert agarosegel for å bekrefte produktstørrelsen på 2571 bp og rens deretter produktet ved hjelp av et kolonnerensingssett som instruert av produsenten. Elute det kolonnerensede produktet i 40 μL sterilt vann.
- For å legge til et 3' A overheng til produktet, tilsett 0,5 μM dATP og 1 U Taq DNA-polymerase med lav kvalitet og inkuber hele PCR-produktet ved 70 °C i 30 minutter sammen med 1x PCR-buffer og 1,5 mM MgCl2 (sluttkonsentrasjon). Rens blandingen ved hjelp av et kolonnerensingssett som instruert av produsenten
MERK: Alternativt kan du skjære det ~ 9,7 kb lange produktet fra gelen fra trinn 1.4. og utføre kloning ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett for kloning av lang-PCR-produkt i henhold til produsentens instruksjoner eller utføre NGS av ep-PCR-produktet ved hjelp av en Illumina-plattform2. - Sett opp en ligeringsreaksjon ved å tilsette 5 μL 2x ligeringsbuffer, 50 ng av T-vektor-DNA, omtrent 3 ganger molaroverskudd av innsats-DNA syntetisert i trinn 3.4., 3 Weiss-enheter av T4 DNA-ligase og nukleasefritt vann til et totalt volum på 10 μL. Inkuber denne reaksjonen ved romtemperatur i 3 timer og tilsett deretter 100 μL Escherichia coli DH5α med det ligerte DNA; varme sjokkerer cellene ved 42 °C i 35 s (figur 1B).
- Tilsett 1 ml Luria-Bertani (LB) medium (uten antibiotika) og inkuber med forsiktig risting i 1 time ved 37 °C for restitusjon. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 13 800 x g, kast supernatanten og resuspender i 200 μL ferskt LB-medium.
- Plate 100 μL av de transformerte E. coli DH5a-cellene på en LB-plate inneholdende 50 μg/ml ampicillin og inkuberes ved 37 °C i 16 timer. Sett opp minipreps av 25-30 kolonier i 5 ml LB medium + 50 μg / ml ampicillin og vokse over natten ved 37 ° C.
- Neste dag, trekk ut plasmidene med et plasmidrensingssett i henhold til produsentens instruksjoner og utfør restriksjonsenzymfordøyelse i 10 μL volum med 200 ng av de isolerte plasmidene, 2 U EcoR1 og 1x begrensningsbuffer for alle koloniene.
- Etter inkubering av fordøyelsesblandingene ved 37 ° C i 3 timer, oppløses produktene på 0,8% TAE-basert agarosegel for å bekrefte plasmid-DNA-innsetting.
- Utfør Sanger-sekvensering av plasmidene til 25 positive kloner ved bruk av M13 Forward, M13 revers, 6208-SPF og 6748-SPF primere (tabell 3) for å bestemme andelen mutasjoner (uttrykt som andelen nukleotider mutert) i virale RNA avledet fra bibliotekene og klonale pJFH1 (figur 1B og figur 4).
4. Viral RNA-transfeksjon av Huh7.5-cellelinjen
MERK: Bruk RNase / DNase-frie vevskulturmaterialer og arbeid i et sterilt klasse II biosikkerhetsskap. Arbeid i det anbefalte inneslutningsanlegget i henhold til organisasjonens retningslinjer for biosikkerhet.
- Opprettholde Huh7.5-celler ved å inkubere i en 5% CO 2 -inkubator ved 37 ° C i en T75 cm2 vevskulturflaske som inneholder 15 ml komplett Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplert med 10% (vol / vol) føtal bovint serum, penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 μg / ml; Figur 1D).
- Del cellene i forholdet 1:3 når samløpet når 90 %. Vask cellene med 1x forvarmet fosfatbufret saltvann (PBS; pH 7,4). Tilsett 5 ml 1x trypsin-EDTA-oppløsning for å dekke cellelaget helt, roter kolben forsiktig og inkuber deretter kolben ved 37 °C i 5 minutter.
MERK: Inkubasjonstiden kan variere; Inkuber cellene til cellelaget er helt løsrevet fra cellekulturkolbeoverflaten. - Tilsett 10 ml 1x forvarmet komplett DMEM, spre cellene ved gjentatt pipettering, og samle cellesuspensjonen i et 15 ml eller 50 ml sterilt sentrifugerør. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 252 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten, resuspender cellepelleten i 6 ml komplett DMEM, og inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator med 5% CO2.
- For kontinuerlig vedlikehold av naive, transfekterte eller virusinfiserte Huh7.5-celler, gjenta trinn 4.2. og trinn 4.3.
- 1 dag før transfeksjon, del cellene som beskrevet i trinn 4.1.-4.3., tell antall levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometer, frø Huh7.5-cellene med en tetthet på 0,6 x 106 i 35 mm retter i 2 ml komplett DMEM, og inkuber cellene ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2.
- På dagen etter, klargjør transkripsjon-lipidkomplekset. For å gjøre dette, fortynn 10 μL transfeksjonsreagens i 50 μL minimalt essensielt medium, og fortynn separat 5 μg virale transkripter i 50 μL minimalt essensielt medium.
- Inkuber begge blandingene ved romtemperatur i 10 minutter, og bland dem deretter i et enkelt sterilt mikrosentrifugerør og inkuber blandingen videre ved romtemperatur i 30 minutter for å danne transkripsjon-lipidkomplekset.
- Etter 16 timer celleinkubasjon, fjern kulturmediet fra kulturfatet, vask cellene 2x med forvarmet 1x PBS, og tilsett 1,5 ml minimalt essensielt medium. Legg sakte transkripsjon-lipidkomplekset til parabolen og virvle forsiktig med hendene for å sikre jevn fordeling av kompleksene.
- Inkuber cellene i en 5% CO2 -inkubator ved 37 ° C i 10 timer. Fjern deretter mediet, vask de transfekterte cellene 2x med 1 ml forvarmet 1x PBS, og tilsett 2 ml komplett DMEM.
5. Virusproduksjon
- Del de transfektede Huh7.5-cellene hver 2. dag eller 3 dager når de når 90% sammenløp. Samle virussupernatanter ved hver splitt og oppbevar dem ved -80 °C for videre analyse.
- Ved hver splitt må du overvåke spredningen av viruset ved hjelp av en fokusdannende analyse (FFA) som beskrevet i trinn 6.2. Høst viruset til viruset sprer seg når >80% av transfekterte celler (figur 1D).
MERK: Del de transfekterte cellene i forholdet 1: 1 for de første passasjene for å redde maksimalt antall virusvarianter. Virusspredningen avtar og levedyktigheten reduseres med økende andeler mutasjoner i fullgenomet MLs2.
6. Kvantifisering av virustitere
- Kvantifisering av viralt RNA
- Isoler viralt RNA fra 140 μL kultursupernatanter ved hjelp av et viralt RNA-isolasjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sett opp en 10 μL qRT-PCR-reaksjon ved hjelp av et kommersielt qRT-PCR-sett i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk den fremre primeren R6-130-S17, omvendt primer R6-290-R19 (endelig konsentrasjon 0,2 μM hver), og sonde R9-148-S21FT (endelig konsentrasjon 0,3 μM) for HCV RNA-kvantifisering (tabell 3). Sett kjøreforholdene til 48 °C i 20 minutter, 95 °C i 10 minutter og deretter 45 sykluser på 95 °C i 15 s og 60 °C i 1 min.
MERK: Sonden skal inneholde fluorescerende reporterfargestoff 6-karboksyfluorescein (FAM) og slukkerfargestoffet 6-karboksy-tetrametyl-rhodamin (TAMRA) i henholdsvis 5' og 3' ender. - Kjør reaksjoner i en sanntids PCR-maskin. Sett opp negative kontroller, dvs. RNA ekstrahert fra supernatanter av mock-infiserte celler og nukleasefritt vann samtidig for å sikre fravær av krysskontaminering.
- Parallelt genererer du en standardkurve ved å bruke et 10 ganger serielt fortynnet kjent kopinummer av HCV-transkripter (1 x 108 til 0) for kvantifisering av viralt RNA. Utfør kvantifiseringen i triplikat (figur 1D).
- Infeksiøs virustiterkvantifisering ved bruk av 50% vevskultur infeksiøs dose (TCID50)
- Ca. 16 timer før tilsetning av viruset, plate 6,5 x 103 Huh7,5 celler / brønn i en 96-brønnplate og inkuber cellene ved 37 ° C i en 5% CO2 -inkubator.
- I et kabinett i biosikkerhetsklasse II må du utføre 10 ganger serielle fortynninger (1 ml hver) som dekker 1 x 10-1 til 1 x 10-6 fortynninger (åtte fortynninger) av det høstede viruset (oppnådd når virusspredningen når >80 % av cellene som beskrevet i trinn 5.). Tilsett 100 μL / brønn (med åtte replikater) av det fortynnede viruset for å infisere Huh7.5-cellene og hold platen i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i 3 dager.
- Etter 3 dager, vask de infiserte cellene 3x med 0,1 ml PBS hver gang, og fikser og permeabiliser cellene med 0,1 ml iskald metanol ved -20 °C i 20 minutter. Vask brønnene med 1x PBS 3x og deretter 1x med PBS-T (1x PBS / 0,1% [v / v] Tween-20).
- Etter fjerning av PBS-T, blokker cellene i 30 minutter ved romtemperatur med 0,1 ml 1% bovint serumalbumin (BSA) som inneholder 0,2% skummet melk i PBST. Fjern blokkeringsløsningen og behandle cellene i 5 minutter med 0,1 ml 3%H2O2tilberedt i 1x PBS.
- Igjen, vask cellene 2x med 1x PBS og 1x med PBS-T, tilsett deretter 50 μL / brønn av anti-NS5A 9E10 mAb (1: 10000, lager 1 mg / ml, en snill gave fra Charles Rice, The Rockefeller University), og inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask brønnene igjen 3x med 1x PBS og 1x med PBS-T.
- Tilsett 50 μL/brønn av HRP-konjugert geiteanti-mus sekundær IgG (1:4000), inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, og fjern deretter det ubundne antistoffet ved å vaske brønnene med 0,1 ml 1x PBS.
- Tilsett 30 μL DAB (diaminobenzidintetrahydroklorid) fargesubstrat og inkuber platen med forsiktig gynging i 10 minutter ved romtemperatur. Substratet utvikler et brunt bunnfall på brønnoverflaten som indikerer HCV NS5A-antigen. Fjern DAB-oppløsningen og vask brønnene 2x med 1x PBS og 1x med destillert vann. Tilsett 100 μL PBS inneholdende 0,03% natriumazid.
- Undersøk hver brønn under et invertert lysmikroskop ved hjelp av et 10x objektiv. Tell antall positive brønner. Hvis brønnen inneholder en eller flere NS5A-positive celler, så er den positiv; hvis brønnen viser et fravær av NS5A-positive celler, er det negativt. Bruk en Reed og Muench kalkulator for å estimere endepunktfortynningen som infiserer 50% av brønnene (TCID50)14,15. En gjensidig av fortynningen som kreves for å gi TCID50 er virusets smittsomhetstiter (focidannende enheter) per volumenhet.
MERK: Virusinfeksjonstitere varierer for forskjellige mutantbiblioteker.
7. Valg av stoffresistent viral variant
- Oppløs pibrentasvir (PIB), en NS5A-hemmer, i 100% DMSO til en konsentrasjon på 1 mM og fortynn den ytterligere i fullstendig DMEM til en konsentrasjon på 10 nM.
- For å bestemme den 50% effektive konsentrasjonen av PIB, frø Huh7.5-celler med en tetthet på 0,6 x 10 6 / brønn i en6-brønnplate og inkuber cellene ved 37 ° C i en 5% CO2 -inkubator. Etter 16 timer med celleinkubasjon, legg til en virusdose av enten ML50 eller klonalt JFH1-virus for å infisere 50% av cellene, og deretter, 12 timer etter infeksjon (h p.i.), behandle cellene med en to ganger fortynningsserie av PIB fra 0,5-100 pM. Mål FFA og kvantifiser FFU som i trinn 6.2. etter 3 dager med inkubasjon.
- Plott dose-responskurvene ved hjelp av FFU-reduksjonsanalyseverdier i statistisk analyseprogramvare. Fra sigmoidalkurven oppnår du 50% effektiv konsentrasjon (EC50; Figur 5).
MERK: Det effektive konsentrasjonsområdet kan variere avhengig av klassen, mellom HCV-antivirale midler i samme klasse, og avhengig av mutantbiblioteket. - For eksperimentet, infiser naive Huh7.5-celler ved 70% sammenløp med en ML50-virus (varianter avledet fra ML50 RNA) dose for å infisere 50% av cellene i 12 timer, og overfør deretter de infiserte cellene til 6-brønnplater 24 timer etter infeksjon.
- Legg til 1x EC50 PIB (47,3 pM) til de infiserte cellene etter 16 timers celledeling. Gjør dette etter hver cellesplitt i seks påfølgende passasjer (18 dager), etterfulgt av tre medikamentfrie passasjesykluser, og overvåk virusspredning ved hjelp av FFAs som beskrevet i trinn 6.2. Oppskalering av FFA-reagenser i henhold til vekstområdet. Høst virale supernatanter ved hver passasje og oppbevar dem ved -80 °C til bruk.
MERK: Virusspredning til mer enn 50 % av cellene under behandlingsoppfølging kan defineres som et gjennombrudd, og virusspredning i seponeringsperioden kan defineres som virustilbakefall16. - Ekstraher viralt RNA fra supernatanten på dag 18, som beskrevet i trinn 6.1.1., og syntetiser deretter cDNA, som vist i trinn 3.1. Forsterk NS5A-genet ved å bruke 5 μL av 1:5 fortynnet cDNA og PCR-komponentene beskrevet i trinn 3.2. Følg deretter trinn 3.3.-3.5. å bestemme NS5A-stoffresistensmutasjoner i 6-8 positive bakterielle plasmider ved bruk av NS5A-sekvenseringsprimerne 6186F, 6862F og 6460R (tabell 3 og tabell 4).
MERK: Her i denne studien rapporterte vi substitusjoner i NS5A av varianter valgt under PIB-behandling ved 1x EC50. Dette vil utelukke bidrag fra andre substitusjoner enn NS5A i redusert følsomhet for PIB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mengde HCV-varianter i full lengde kan genereres og screenes for medikamentresistente fenotyper av interesse etter prosedyrene beskrevet i figur 1. Fulle genommutantbiblioteker ble syntetisert ved bruk av klonal-pJFH1 i synkende mengder (100-10 ng), som vist i figur 2. Gjennomsnittlig utbytte av ep-PCR-produkter (mutantbiblioteker) varierte fra 3,8-12,5 ng / μL. Figur 3 viser virale transkripsjoner syntetisert fra klonal-pJFH1 og det representative mutantbiblioteket (ML50 syntetisert ved bruk av 50 ng klonal-pJFH1). Klonal-pJFH1 ble linearisert via XbaI fordøyelse, mens ML50 ble brukt direkte i in vitro transkripsjonsreaksjonen. Andelen mutasjoner i muterte biblioteker (muterte virale RNA) økte med avtagende inngang pJFH1 i ep-PCR-reaksjonen, som vist i figur 4. ML50 syntetisert ved hjelp av 50 ng av malen (klonal-pJFH1) hadde 4 substitusjoner per 10 000 bp kopiert, mens ML25 syntetisert ved hjelp av 25 ng mal hadde 9 substitusjoner. Ingen substitusjoner innenfor antall sekvenserte nukleotider ble funnet i klonal-pJFH1. ML50-virusvarianter var mindre mottakelige (12,7 ganger) for pibrentasvir, en NS5A-hemmer, sammenlignet med klonalt JFH1-virus, som vist i figur 5. Tabell 5 har NS5A-substitusjoner identifisert i ML50 virusvarianter valgt mot 1x EC50 av pibrentasvirbehandling. Av de åtte NS5A-klonene hadde fire en kombinasjon av D7V + F28C, mens V8A + F28C og F36L forekom i en klone hver. Disse mutasjonene var i N-terminalregionen av NS5A, som er kjent for å ha klinisk relevante NS5A-resistensmutasjoner17.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av FL-MRS-strategi og medikamentresistent fenotypeseleksjon. (A) pJFH1 cDNA (villtype) klonen bærer et genotype 2a-virusgenom i full lengde og T7-promotor. Primeren J-For er oppstrøms for T7-promotoren, og primeren J-Rev ligger i 3'-enden av HCV-genomet. (B) Clonal-pJFH1 er tilfeldig mutagenisert ved hjelp av feilutsatt PCR for å konstruere genetiske variasjoner og for å skape fulle genommutantbiblioteker. Klonal-pJFH1 er linearisert av XbaI fordøyelse. (C) Full-genom ep-PCR-produkter og linearisert klonal-pJFH1 er malene for in vitro transkripsjon. Andelen mutasjoner i virale RNA av MLs og klonal-JFH1 ble bestemt ved TA-subkloning av NS5A og Sanger-sekvensering av positive TA-kloner. (D) Replikasjonskompetente varianter generert etter mutert viral RNA-transfeksjon av Huh7.5-celler ble behandlet med pibrentasvir (en NS5A-hemmer) for valg av NS5A-resistente fenotyper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Agarosegelelektroforese av ep-PCR-produkter. HCV ep-PCR-produkter fra fullgenom syntetisert ved bruk av varierende malmengder (100 ng, 50 ng, 25 ng og 10 ng pJFH1) ble separert ved bruk av 0,8% TAE-agarosegelelektroforese. Den forventede størrelsen på ep-PCR-produktet er 9,7 kb. De separerte produktene ble visualisert ved ethidiumbromidfarging. Lane 1 er en 1 kb DNA-stige; Bane 6 er kontroll uten mal (merket som H2O). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: MOPS formaldehydagarosegelelektroforese av virale transkripter. Linearisert pJFH1 (Lane 2) og mutantbiblioteket oppnådd med 50 ng (ML50) pJFH1 inneholdende ep-PCR (Lane 3) ble brukt som maler for in vitro transkripsjonsreaksjonen. Transkripsjonenes integritet ble analysert ved bruk av et MOPS-formaldehyd 0,8 % agarosegel farget med ethidiumbromid. Lane 1 er en 1 kb RNA-stige. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Andel substitusjoner i mutantbibliotek. NS5A-gener fra RNA av klonal-pJFH1, ML50 og ML25 ble amplifisert i hi-fidelity-PCR, etterfulgt av tilsetning av 3' A-overheng, ligering av produktet med T-vektor og transformasjon av E. coli DH5α med det ligerte produktet. Rundt 40 000 nukleotider/bibliotek eller klonal-pJFH1 ble Sanger-sekvensert. En gjennomsnittlig andel mutasjoner per 10 000 bp kopiert er vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Estimering av EC50 av pibrentasvir mot ML50-varianter. Huh7.5-celler ble infisert med klonalt JFH1-virus eller ML50-varianter og behandlet med serielle to ganger fortynninger som startet ved 100 pM pibrentasvir, etterfulgt av FFA etter 3 dager. Sigmoidale dose-responskurver ved bruk av FFU-reduksjonsanalyseverdier ble plottet i statistisk analyseprogramvare for å estimere den 50% effektive konsentrasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponenter for 50 μL | Nødvendig lagerverdi | Endelig konsentrasjon/reaksjon |
| 10x PCR-buffer | 5,0 μL | 1x |
| MgCl2 (50 mM) | 1,5 μL | 1,5 mM |
| KB Extender-enhet | 2,0 μL | - |
| dNTP (10 mM) | 1,0 μL | 0,2 mM |
| Forovergrunning (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Omvendt primer (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Taq DNA-polymerase (10 U/μL) | 0,5 μL (1:4 fortynnet) | 1 U |
| Mal (pJFH1, 20 ng/μL) | 0,5 til 5,0 μL | 10 til 100 ng |
| Vann | 32,5 til 37,5 μL | Juster for endelig volum på 50 μL |
Tabell 1. Ep-PCR-komponenter for amplifisering av HCV fullt genom.
| Temperatur | Tid | Syklus(er) |
| 95 °C | 3 min | 1 |
| 95 °C | 30 sek | 30 |
| 60 °C | 25 sek | |
| 72 °C | 8 min | |
| 72 °C | 10 min | 1 |
| 4 °C | Holde |
Tabell 2. Syklingsbetingelser for ep-PCR av HCV fullt genom.
| Analyse | Grunning | Sekvens (5'-3') |
| Forsterkning av partiell NS4B-NS5A-partiell NS5B | 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| cDNA-syntese | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR | R9-148-S21FT (TaqMan-sonde) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6-130-S17 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| R6-290-R19 | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| Sekvensering av primere for å bestemme proporsjoner av mutasjoner i ep-PCR-produkter | 6208-SPF | CCCAACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-SPF | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| NS5A gensekvensering (og for å bestemme proporsjoner av mutasjoner i ep-PCR-produkter) | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
Tabell 3. Primere og sekvenser brukt i analyser.
| Temperatur | Tid | Syklus(er) |
| 95 °C | 4 min | 1 |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 68 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 min | |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 66 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 min | |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 64 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 min | |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 62 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 min | |
| 95 °C | 30 sek | 10 |
| 60 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 min | |
| 72 °C | 10 min | 1 |
| 4 °C | Holde |
Tabell 4. Sykkelforhold for NS5A-forsterkning.
| Erstatning(er) | Nei. Antall kloner (n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36L | 1 |
Tabell 5. Pibrentasvirresistenssubstitusjoner av NS5A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har vi beskrevet en enkel og rask FL-MRS-prosedyre som integrerer ep-PCR18 og omvendt genetikk for syntetisering av HCV-fullgenombiblioteker, som deretter kan brukes i et cellekultursystem for å generere replikasjonskompetente varianter for screening av stoffresistente fenotyper. Bruken av Taq DNA-polymerase med lav kvalitet er en forutsetning for ep-PCR som tillater inkorporering av substitusjoner under PCR-amplifisering av et viralt genom i full lengde. Vi testet flere Taq DNA-polymeraser med lav kvalitet og fant at Platinum Taq DNA-polymerase ga et ~ 10 kb størrelse ep-PCR-produkt med høyt utbytte (data ikke vist). Vi anbefaler å bruke et fast antall termiske sykluser og variere mengden inndatamaler for å kontrollere andelen mutasjoner i full-genombibliotekene. Siden FL-MRS bruker feilaktige fullgenomer som maler for virale RNA i full lengde, er en nøye utforming av primersettet avgjørende for å sikre at RNA-syntesereaksjonen produserer virustranskripsjoner av definert lengde: (i) den fremre primeren må være lokalisert oppstrøms (~ 50 nukleotider) av T7-promotoren av cDNA-klonen for å lette T7-polymerasebinding til ep-PCR-produktet; og (ii) den omvendte primersekvensen må ende ved 3'-enden av virusgenomet for å lette transkripsjonsavrenning under in vitro RNA-syntese.
Metoden er imidlertid relativt grov, og det er ingen kontroll over å inkorporere det nødvendige antallet og typen substitusjoner i regioner av interesse for genomet. En stor fordel med FL-MRS er at de syntetiserte transkripsjonene i full lengde kan brukes direkte til å transfektere celler, noe som gjør tilnærmingen enkel og effektiv for å generere et stort basseng av virale varianter. I motsetning til dette krever sirkulær polymeraseforlengelse og Mu-transposon innsettingsmutagenesemetoder kloning av PCR-produktet og screening av transformanter før valg av ønsket fenotype, noe som sterkt begrenser mangfoldet av mutantbassenget. Selv om vår metode øker sjansen for å gi flere ønskede fenotyper, er evaluering av individuelle virusvarianter vanligvis nødvendig i screening.
Integrering av ep-PCR med virus omvendt genetikk tillot oss å raskt generere HCV-mutanter. Denne metoden har potensial til å generere hundrevis av genetisk modifiserte virus, en prestasjon som tilsynelatende ikke er mulig med de tilgjengelige in vitro mutageneseteknikkene. Metoden som er beskrevet her, kan lett tilpasses cDNA-kloner som bærer alle (+) ssRNA-virus som inneholder genomer opp til ~ 10 kb i lengde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Finansieringsstøtte (tilskuddsnummer BT/PR10906/MED/29/860/2014) for denne studien ble gitt av Department of Biotechnology, Government of India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U.
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R.
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
