Summary
Protokol, hataya açık PCR ve ters genetik kullanarak tam uzunlukta mutant RNA sentezini birleştirerek hepatit C virüsü genomunda kontrol edilebilir genetik çeşitliliği tanıtmak için bir yöntemi açıklar. Yöntem, fenotip seçimi için bir model sağlar ve 10 kb uzunluğunda pozitif anlamlı RNA virüs genomları için kullanılabilir.
Abstract
Çeşitli tam uzunlukta viral varyantların yinelemeli üretimi için uygun bir yöntemin olmaması, RNA virüslerinde yönlendirilmiş evrim çalışmasını engellemiştir. Tam bir RNA genomu hataya eğilimli PCR ve ters genetiği entegre ederek, rastgele genom çapında ikame mutajenezi indüklenebilir. İlgilenilen fenotiplere sahip viral mutantları tanımlamak için çeşitli kütüphaneleri sentezlemek için bu tekniği kullanan bir yöntem geliştirdik. Tam uzunlukta mutant RNA sentezi (FL-MRS) olarak adlandırılan bu yöntem aşağıdaki avantajları sunar: (i) yüksek verimli, tek adımlı hataya eğilimli bir PCR aracılığıyla büyük bir kütüphane oluşturma yeteneği; (ii) DNA polimerazın aslına uygunluğunu manipüle ederek farklı seviyelerde genetik çeşitliliğe sahip kütüphane grupları oluşturma yeteneği; (iii) mutant RNA sentezi için doğrudan bir şablon görevi görebilecek tam uzunlukta bir PCR ürününün oluşturulması; ve (iv) istenen fenotipteki viral mutantları taramak için seçilmemiş bir girdi havuzu olarak konakçı hücrelere iletilebilen RNA oluşturma yeteneği. Ters genetik bir yaklaşım kullanarak, FL-MRS'nin hepatit C virüsü, JFH1 izolatının yaşam döngüsünün tüm aşamalarında viral yönelimli evrimi incelemek için güvenilir bir araç olduğunu bulduk. Bu teknik, pozitif anlamlı RNA virüslerinde adaptasyon, replikasyon ve viral genlerin patogenez ve antiviral dirençteki rolünü anlamak için yönlendirilmiş evrimi kullanmak için paha biçilmez bir araç gibi görünmektedir.
Introduction
İleri genetik tarama, ilgilenilen viral bir fenotiple başlar ve daha sonra genomunu dizileyerek ve orijinal suşunkiyle karşılaştırarak, bu fenotipe neden olan mutasyonları tanımlamaya çalışır. Buna karşılık, ters genetik taramalarda, bir hedef gende rastgele mutasyonlar ortaya çıkar ve ardından ortaya çıkan fenotip(ler)in incelenmesi sağlanır1. Ters genetik yaklaşımı için, in vitro mutajenez, daha sonra ilgilenilen fenotipler için taranan bir varyant havuzu oluşturmak için en yaygın kullanılan tekniktir. Hataya eğilimli PCR (ep-PCR)2,3, dairesel polimeraz uzantısı 4 ve Mu-transpozon ekleme mutajenezi 5,6,7 dahil olmak üzere RNA virüslerinin genom çapında rastgele mutajenezini elde etmek için çeşitli genetik araçlar bildirilmiştir. Son iki yöntem, sınırlı dizi çeşitliliği barındıran kütüphaneler sağlar ve virüsler için oldukça öldürücü olan ve bulaşıcı viral varyantların iyileşmesini ciddi şekilde sınırlayan büyük ekleme ve silmelerin ortaya çıkmasına eğilimlidir.
ep-PCR, gelişmiş termal stabilite, substrat özgüllüğü ve katalitik aktivitegibi istenen özelliklere sahip fenotiplerin seçimi için mutant enzimler üretmek üzere protein mühendisliğinde yaygın olarak kullanılan iyi bilinen güçlü bir mutajenez tekniğidir 8,9,10. Bu tekniğin uygulanması kolaydır çünkü basit ekipman gerektirir, sıkıcı manipülasyonlar içermez, piyasada bulunan reaktifleri kullanır ve hızlıdır; Ayrıca, yüksek kaliteli kütüphaneler oluşturur.
Burada, rastgele genom çapında ikame mutajenezi ve ters genetiği indükleyen ep-PCR'yi entegre ederek hepatit C virüsünün (HCV) tam genomlarını oluşturmak için tam uzunlukta mutant RNA sentezi (FL-MRS) için yeni bir yöntem geliştirdik. Tek bir nükleotid eklenmesi veya silinmesi bile pozitif anlamlı RNA virüsleri ([+]ssRNA) için oldukça zararlıdır; bu nedenle, PCR tabanlı ikame mutajenezi, iyi canlılığa sahip tam (+)ss RNA virüsü genomlarının büyük, çeşitli kütüphanelerinin yinelemeli üretimi için tercih edilen yöntemdir.
FL-MRS, viral cDNA klonuna bağlanan bir primer setinin titiz tasarımı yoluyla ~10 kb genom uzunluğuna sahip herhangi bir pozitif anlamlı RNA virüsüne uygulanabilen basit bir yaklaşımdır. pJFH1, HCV genotip 2a'yı kodlayan ve virüs yaşam döngüsünün tüm adımlarını özetleyebilen bulaşıcı bir cDNA klonudur. FL-MRS yaklaşımını kullanarak, mutasyonlarla ilişkili özellikler hakkında önceden bilgi sahibi olmayan, replikasyona yetkin JFH1 varyantları üretmek için rastgele mutajenize edilmiş tam genom kütüphanelerinin (mutant kütüphaneler [ML'ler]) sentezini gösterdik. Bir antiviral'e maruz kaldıktan sonra, bazı viral varyantlar, istenen fenotipik değişiklikle ilaç baskısının üstesinden hızla geldi. Burada açıklanan protokol kullanılarak, (+)ssRNA virüslerinin evrimini incelemek için fırsatlar yaratan çok sayıda viral varyant oluşturulabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Burada kullanılan JFH1 suşu (WT), Ulusal Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü'nden Takaji Wakita'nın nazik bir hediyesiydi. İnsan hepatom hücre hattı, Huh7.5, Rockefeller Üniversitesi'nden Charles Rice'ın nazik bir armağanıydı. Yöntemin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Hataya açık PCR kullanılarak JFH1'in genom çapında ikame mutajenezi
- ep-PCR gerçekleştirmek için, ana karışımı 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' ve J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' primerleri ile dört set deney için hazırlayın (Şekil 1A), pJFH1 şablonu olmadan Tablo 1'de açıklanan reaksiyon bileşenleri (JFH1 suşundan izole edilen plazmit) ile birlikte.
- Ana karışımı dört tüpe ayırın, tek tek tüplere 100 ng, 50 ng, 25 ng ve 10 ng şablon ekleyin ve reaksiyonun toplam hacmini 50 μL'ye ayarlayın. T7 promotörü ve tam uzunlukta HCV genomunu içeren bir 9736 baz çifti (bp) fragmanını amplifiye etmek için Tablo 2'de açıklanan döngü koşullarını uygulayın (Şekil 2).
NOT: ep-PCR ürünü, viral genomun in vitro transkripsiyonunu kolaylaştırmak için T7 promotör dizisini içermelidir. Bu nedenle, ileri primer, viral cDNA klonunun T7 promotörünün yukarı akışına yerleştirilmeli ve ters primer dizisi, transkripsiyon akışını kolaylaştırmak için virüs genomunun 3' ucunda sona ermelidir. Yüksek verimli amplifikasyon elde etmek için ep-PCR reaksiyonunun her bir bileşenini Taq DNA polimeraz üreticisi tarafından önerilen aralıkta optimize edin. Çeşitli şablon miktarlarına ek olarak, dengesiz dNTP'ler (özellikle düşük dATP ve/veya dGTP konsantrasyonu), viral genomların uzunluğundaki çeşitliliği 6-8 kb uzunluğundan artırmak için de kullanılabilir3. - Eşit hacimlerde PCR ürünleri (5 μL) yükleyerek ve %0,8 Tris-asetat-EDTA (TAE) bazlı agaroz jel elektroforezi çalıştırarak bilinen 1 kilobaz (kb) DNA merdiveni miktarlarıyla karşılaştırarak amplifiye edilen ep-PCR ürününü tahmin edin11. Ürünü, üretici tarafından belirtildiği şekilde bir kolon arıtma kiti kullanarak arındırın.
- Bir mikrohacim spektrofotometresi12 kullanarak 260 nm'de absorbansı ölçerek saflaştırılmış ürünün konsantrasyonunu tahmin edin. ≥100 ng/μL'lik bir ürün konsantrasyonu elde etmek için gerekirse ep-PCR ürününü vakumla konsantre edin.
NOT: ep-PCR ürününün iki katlı seri dilüsyonları yüklenerek ve yoğunlukları bilinen 1 kb DNA merdiveni miktarlarıyla karşılaştırılarak daha doğru tahmin yapılabilir.
2. Viral RNA sentezi
- 2 saat boyunca 37 ° C'de 4 U XbaI enzimi ile 5 μg klonal-pJFH1'i sindirmek için 40 μL'lik bir reaksiyon ayarlayın, ardından kolon saflaştırması ve bir mikrohacim spektrofotometresinde 260 nm'de absorbansı ölçme12. Üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen büyük ölçekli bir RNA üretim sistemi kullanarak kolonla saflaştırılmış ep-PCR ürününün veya klonal-pJFH1'in (WT) 20 μL'lik bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunu ayarlayın.
- 200 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, yaklaşık 1 μg saflaştırılmış ep-PCR ürünü (mutant kütüphaneler) veya XbaI sindirilmiş klonal-pJFH1, 10 μL ribonükleotid içeren 2x tampon ve 2 μL T7 enzim karışımı karıştırın. Tüm bileşenleri karıştırın ve bileşenleri kısaca döndürün. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 45 dakika inkübe edin, ardından 1 U RNaz içermeyen DNaz enzimi ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin (Şekil 1C).
- Üreticinin talimatlarına göre bir RNA temizleme kiti kullanarak in vitro sentezlenmiş RNA'yı saflaştırın, 40 μL RNaz ve DNaz içermeyen suda elüte edin ve bir mikrohacim spektrofotometresi12 kullanarak 260 nm'de absorbansı ölçerek saflaştırılmış RNA'nın konsantrasyonunu tahmin edin. Donma-çözülmeyi önlemek için gerektiği gibi (5 μg veya 2 μg) alikotlar yapın ve bunları −80 °C'de saklayın. MOPS formaldehit %0.8 agaroz jel elektroforezi13 için 2 μg RNA kullanarak viral transkriptlerin bütünlüğünü ve boyutunu doğrulayın (Şekil 3).
3. ep-PCR ürünlerindeki mutasyon oranının tahmini (mutant kütüphaneler)
NOT: Bu adımda, 2. adımda elde edilen ürünün alt klonlanmasıyla mutasyona uğrayan nükleotidlerin oranı. iki tam genom mutant kütüphanesi (ML50 ve ML25) ve klonal pJFH1'den türetilmiş viral RNA'lar kullanılarak genetik heterojenlik oluşturmak için ep-PCR kullanmanın avantajını gösterdiği tahmin edilmektedir. Mutasyonların oranı, bu çalışmada aynı zamanda fenotipik okuma geni (ilaç direnci) olan HCV NS5A geninde tahmin edildi.
- Adım 2'de sentezlenen yaklaşık 1 μg viral RNA, üreticinin tavsiyelerine göre 5 μM ters primer 5'-GTGTACCTAGTGTGCCGCTCTA-3' ve 200 U ters transkriptaz ekleyerek 20 μL'lik bir cDNA sentez reaksiyonu oluşturun.
- cDNA'yı kullanarak, tam NS5A genini içeren 2571 bp'lik bir fragmanı çoğaltın. Bunu yapmak için, 5272F ve 7848R primerleri için 0,5 μM içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın (son konsantrasyon; Tablo 3), toplam 50 μL hacimde 1.5 mM MgCl2, 1x PCR tamponu ve 1 U yüksek kaliteli Taq polimeraz ve Tablo 4'te açıklanan koşulları kullanarak bir amplifikasyon döngüsü çalıştırın.
- 2571 bp'lik ürün boyutunu doğrulamak için ürünü %0,8 TAE bazlı agaroz jel üzerinde çalıştırın ve ardından üretici tarafından belirtildiği şekilde bir kolon saflaştırma kiti kullanarak ürünü saflaştırın. Kolonla saflaştırılmış ürünü 40 μL steril suda elute.
- Ürüne 3' A çıkıntı eklemek için 0,5 μM dATP ve 1 U düşük kaliteli Taq DNA polimeraz ekleyin ve tüm PCR ürününü 70 °C'de 30 dakika boyunca 1x PCR tamponu ve 1,5 mM MgCl2 (son konsantrasyon) ile birlikte inkübe edin. Üretici tarafından belirtildiği gibi bir kolon arıtma kiti kullanarak karışımı saflaştırın
NOT: Alternatif olarak, ~ 9.7 kb uzunluğundaki ürünü 1.4. adımdan itibaren jelden çıkarın. ve üreticinin talimatlarına göre uzun PCR ürününün klonlanması için piyasada bulunan bir kit kullanarak klonlama gerçekleştirin veya bir Illumina platformu2 kullanarak ep-PCR ürününün NGS'sini gerçekleştirin. - 5 μL 2x ligasyon tamponu, 50 ng T-vektör DNA'sı, adım 3.4'te sentezlenen insert DNA'nın yaklaşık 3 kat molar fazlası, 3 Weiss birimi T4 DNA ligaz ve nükleaz içermeyen su ekleyerek toplam 10 μL hacme bir ligasyon reaksiyonu oluşturun. Bu reaksiyonu oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin ve ardından bağlanmış DNA ile 100 μL Escherichia coli DH5α ekleyin; hücreleri 42 °C'de 35 saniye boyunca ısı şoku (Şekil 1B).
- 1 mL Luria-Bertani (LB) ortamı (antibiyotiksiz) ekleyin ve iyileşme için 37 ° C'de 1 saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Hücre süspansiyonunu 13.800 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve 200 μL taze LB ortamında yeniden süspanse edin.
- 50 μg/mL ampisilin içeren bir LB plakası üzerine dönüştürülmüş E. coli DH5α hücrelerinin 100 μL'sini plakalayın ve 37 °C'de 16 saat inkübe edin. 5 mL LB ortamı + 50 μg/mL ampisilin içinde 25-30 koloniden oluşan mini preparatlar hazırlayın ve gece boyunca 37 °C'de büyütün.
- Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre plazmitleri bir plazmit saflaştırma kiti ile ekstrakte edin ve tüm koloniler için 200 ng izole plazmit, 2 U EcoR1 ve 1x kısıtlama tamponu ile 10 μL hacimde kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirin.
- Çürütme karışımlarını 37 °C'de 3 saat inkübe ettikten sonra, plazmit DNA eklemesini doğrulamak için ürünleri %0.8 TAE bazlı agaroz jel üzerinde çözün.
- Kütüphanelerden ve klonal pJFH1'den türetilen viral RNA'lardaki mutasyonların oranını (mutasyona uğramış nükleotidlerin oranı olarak ifade edilir) belirlemek için M13 İleri, M13 ters, 6208-SPF ve 6748-SPF primerlerini (Tablo 3) kullanarak 25 pozitif klonun plazmitlerinin Sanger dizilimini gerçekleştirin (Şekil 1B ve Şekil 4).
4. Huh7.5 hücre hattının viral RNA transfeksiyonu
NOT: RNase/DNaz içermeyen doku kültürü malzemeleri kullanın ve steril sınıf II biyogüvenlik kabininde çalışın. Kuruluşun biyogüvenlik yönergelerine göre önerilen muhafaza tesisinde çalışın.
- %10 (hacim/hacim) fetal sığır serumu, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL; Şekil 1D).
- İzdiham %90'a ulaştığında hücreleri 1:3 oranında bölün. Hücreleri 1x önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7.4) ile yıkayın. Hücre tabakasını tamamen kaplamak için 5 mL 1x tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin, şişeyi hafifçe döndürün ve ardından şişeyi 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
NOT: Kuluçka süresi değişebilir; Hücre tabakası hücre kültürü şişesi yüzeyinden tamamen ayrılana kadar hücreleri inkübe edin. - 10 mL önceden ısıtılmış 1x tam DMEM ekleyin, hücreleri tekrar pipetleme ile dağıtın ve hücre süspansiyonunu 15 mL veya 50 mL steril santrifüj tüpünde toplayın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 252 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücre peletini 6 mL tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
- Naif, transfekte edilmiş veya virüs bulaşmış Huh7.5 hücrelerinin sürekli bakımı için adım 4.2'yi tekrarlayın. ve adım 4.3.
- Transfeksiyondan 1 gün önce, hücreleri 4.1.-4.3. adımlarında açıklandığı gibi bölün, bir hemositometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın, Huh7.5 hücrelerini 2 mL tam DMEM'de 35 mm'lik kaplarda 0.6 x 106 yoğunlukta tohumlayın ve hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
- Ertesi gün, transkript-lipid kompleksini hazırlayın. Bunu yapmak için, 10 μL transfeksiyon reaktifini 50 μL minimal esansiyel ortamda seyreltin ve 50 μL minimal esansiyel ortamda 5 μg viral transkripti ayrı ayrı seyreltin.
- Her iki karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve daha sonra bunları tek bir steril mikrosantrifüj tüpünde karıştırın ve ayrıca transkript-lipid kompleksini oluşturmak için karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- 16 saatlik hücre inkübasyonundan sonra, kültür ortamını kültür kabından çıkarın, hücreleri önceden ısıtılmış 1x PBS ile 2x yıkayın ve 1.5 mL minimum esansiyel ortam ekleyin. Transkript-lipid kompleksini yavaşça tabağa ekleyin ve komplekslerin eşit dağılımını sağlamak için elinizle hafifçe döndürün.
- Hücreleri% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 10 saat inkübe edin. Daha sonra, ortamı çıkarın, transfekte edilmiş hücreleri 2x 1 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın ve 2 mL tam DMEM ekleyin.
5. Virüs üretimi
- Transfekte edilen Huh7.5 hücrelerini her 2 günde bir veya %90 birleşmeye ulaştıklarında 3 günde bir bölün. Her bölmede virüs süpernatantlarını toplayın ve daha fazla analiz için -80 °C'de saklayın.
- Her bölünmede, adım 6.2'de açıklandığı gibi bir odak oluşturma testi (FFA) kullanarak virüsün yayılmasını izleyin. Virüs yayılımı transfekte edilen hücrelerin %>80'ine ulaşana kadar virüsü hasat edin (Şekil 1D).
NOT: Maksimum sayıda viral varyantı kurtarmak için transfekte edilmiş hücreleri ilk birkaç pasaj için 1:1 oranında bölün. Virüs yayılımı yavaşlar ve tam genom ML'lerindeki mutasyon oranlarının artmasıyla canlılık azalır2.
6. Virüs titrelerinin ölçülmesi
- Viral RNA'nın miktar tayini
- Üreticinin talimatlarına göre bir viral RNA izolasyon kiti kullanarak viral RNA'yı 140 μL kültür süpernatantlarından izole edin.
- Üreticinin talimatlarına göre ticari bir qRT-PCR kiti kullanarak 10 μL'lik bir qRT-PCR reaksiyonu ayarlayın. HCV RNA kantifikasyonu için ileri primer R6-130-S17, ters primer R6-290-R19 (her biri 0.2 μM nihai konsantrasyon) ve R9-148-S21FT probu (son konsantrasyon 0.3 μM) kullanın (Tablo 3). Çalışma koşullarını 20 dakika boyunca 48 °C, 10 dakika boyunca 95 °C ve ardından 15 saniye boyunca 95 °C'lik 45 döngü ve 1 dakika boyunca 60 °C olarak ayarlayın.
NOT: Prob, sırasıyla 5' ve 3' uçlarında floresan raportör boyası 6-karboksifloresein (FAM) ve söndürücü boya 6-karboksi-tetrametil-rodamin (TAMRA) içermelidir. - Reaksiyonları gerçek zamanlı bir PCR makinesinde çalıştırın. Çapraz kontaminasyonun olmamasını sağlamak için negatif kontrolleri, yani sahte enfekte hücrelerin süpernatanlarından ve nükleaz içermeyen sudan aynı anda ekstrakte edilen RNA'yı kurun.
- Paralel olarak, viral RNA'nın miktar tayini için 10 kat seri olarak seyreltilmiş bilinen HCV transkript kopya sayısını (1 x 108 ila 0) kullanarak standart bir eğri oluşturun. Nicelemeyi üç kopya halinde gerçekleştirin (Şekil 1D).
- %50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID50) kullanılarak enfeksiyöz virüs titresi ölçümü
- Virüsü eklemeden yaklaşık 16 saat önce, 96 oyuklu bir plakada 6.5 x 103 Huh7.5 hücre/kuyu plaka ve hücreleri% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
- Bir biyogüvenlik sınıfı II kabininde, hasat edilen virüsün 1 x 10−1 ila 1 x 10−6 seyreltmesini (sekiz seyreltme) kapsayan 10 kat seri seyreltme (her biri 1 mL) gerçekleştirin (virüs yayılımı 5. adımda açıklandığı gibi hücrelerin %>80'ine ulaştığında elde edilir). Huh7.5 hücrelerini enfekte etmek için seyreltilmiş virüsün 100 μL/kuyu (sekiz kopya ile) ekleyin ve plakayı 3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde tutun.
- 3 gün sonra, enfekte olmuş hücreleri her seferinde 0.1 mL PBS ile 3x yıkayın ve hücreleri 20 dakika boyunca −20 ° C'de 0.1 mL buz gibi soğuk metanol ile sabitleyin ve geçirgenleştirin. Kuyuları 1x PBS 3x ve ardından 1x PBS-T (1x PBS/%0.1 [h/h] Tween-20) ile yıkayın.
- PBS-T'yi çıkardıktan sonra, PBST'de% 0.2 yağsız süt içeren 0.1 mL% 1 sığır serum albümini (BSA) ile hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika bloke edin. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve hücrelere 1x PBS'de hazırlanan 0.1 mL% 3H2O2ile 5 dakika muamele edin.
- Yine, hücreleri 2x 1x PBS ve 1x PBS-T ile yıkayın, ardından 50 μL / kuyu anti-NS5A 9E10 mAb (1:10000, stok 1 mg / mL; Charles Rice, Rockefeller Üniversitesi'nden nazik bir hediye) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuyuları tekrar 3x PBS ile 1x ve 1x PBS-T ile yıkayın.
- 50 μL / kuyucuk HRP konjuge keçi anti-fare ikincil IgG (1:4000) ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve ardından kuyucukları 0.1 mL 1x PBS ile yıkayarak bağlanmamış antikoru çıkarın.
- 30 μL DAB (diaminobenzidin tetrahidroklorür) renkli substrat ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Substrat, kuyu yüzeyinde HCV NS5A antijenini gösteren kahverengi bir çökelti geliştirir. DAB çözeltisini çıkarın ve kuyuları 2x 1x PBS ve 1x damıtılmış su ile yıkayın. % 0.03 sodyum azid içeren 100 μL PBS ekleyin.
- Her bir kuyuyu 10x objektif kullanarak ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Pozitif kuyuların sayısını sayın. Kuyu bir veya daha fazla NS5A-pozitif hücre içeriyorsa, o zaman pozitiftir; kuyu NS5A pozitif hücrelerin yokluğunu gösteriyorsa, o zaman negatiftir. Kuyuların %50'sini etkileyen uç nokta seyreltmesini tahmin etmek için bir Reed ve Muench hesaplayıcısı kullanın (TCID50)14,15. TCID50'yi elde etmek için gereken seyreltmenin bir tersi, birim hacim başına virüs enfektivitesi titresidir (odak oluşturan birimler).
NOT: Virüs enfektivites titreleri, farklı mutant kütüphaneler için farklılık gösterir.
7. İlaca dirençli viral varyant seçimi
- Bir NS5A inhibitörü olan pibrentasvir'i (PIB)% 100 DMSO'da 1 mM'lik bir konsantrasyona çözün ve ayrıca tam DMEM'de 10 nM'lik bir konsantrasyona seyreltin.
- PIB'nin %50 etkili konsantrasyonunu belirlemek için, Huh7.5 hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 0.6 x 106/kuyu yoğunluğunda tohumlayın ve hücreleri %5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. 16 saatlik hücre inkübasyonundan sonra, hücrelerin% 50'sini enfekte etmek için ML50 veya klonal JFH1 virüsünün bir virüs dozunu ekleyin ve daha sonra, enfeksiyondan 12 saat sonra (h pi), hücrelere 0.5-100 pm arasında değişen iki katlı bir seyreltme serisi PIB uygulayın. FFA'yı ölçün ve adım 6.2'deki gibi FFU'yu ölçün. 3 günlük inkübasyondan sonra.
- İstatistiksel analiz yazılımında FFU-redüksiyon tahlil değerlerini kullanarak doz-yanıt eğrilerini çizin. Sigmoidal eğriden,% 50 etkili konsantrasyonu elde edin (EC50; Şekil 5).
NOT: Etkili konsantrasyon aralığı sınıfa bağlı olarak, aynı sınıftaki HCV antiviralleri arasında ve mutant kütüphanesine bağlı olarak değişebilir. - Deney için, 12 saat boyunca hücrelerin %50'sini enfekte etmek için bir ML50 virüsü (ML50 RNA'dan türetilen varyantlar) dozu ile %70 birleşimde saf Huh7.5 hücrelerini enfekte edin ve ardından enfekte olmuş hücreleri enfeksiyondan 24 saat sonra 6 oyuklu plakalara aktarın.
- 16 saatlik hücre bölünmesinden sonra enfekte olmuş hücrelere 1x EC50 PIB (47.3 pM) ekleyin. Bunu, her hücre ardışık altı geçiş (18 gün) boyunca bölündükten sonra, ardından üç ilaçsız geçiş döngüsü izledikten sonra yapın ve adım 6.2'de açıklandığı gibi FFA'ları kullanarak virüs yayılımını izleyin. Büyüme alanına göre ölçek büyütme FFA reaktifleri. Her geçişte viral süpernatantları toplayın ve kullanana kadar −80 °C'de saklayın.
NOT: Tedavi takibi sırasında hücrelerin %50'sinden fazlasına viral yayılım bir atılım olarak tanımlanabilir ve ilaç bırakma döneminde viral yayılım viral nüksolarak tanımlanabilir 16. - Adım 6.1.1'de açıklandığı gibi 18. günde süpernatanttan viral RNA'yı çıkarın ve ardından adım 3.1'de gösterildiği gibi cDNA'yı sentezleyin. NS5A genini, 5 μL 1:5 seyreltilmiş cDNA ve adım 3.2'de açıklanan PCR bileşenlerini kullanarak çoğaltın. Ardından, 3.3.-3.5 adımlarını izleyin. NS5A dizileme primerleri 6186F, 6862F ve 6460R kullanılarak 6-8 pozitif bakteri plazmitinde NS5A ilaç direnci mutasyonlarını belirlemek için (Tablo 3 ve Tablo 4).
NOT: Bu çalışmada, 1x EC50'de PIB tedavisi sırasında seçilen varyantların NS5A'daki ikamelerini bildirdik. Bu, NS5A dışındaki ikamelerin PIB'ye duyarlılığın azaltılmasına katkısını ortadan kaldıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de açıklanan prosedürleri takiben ilgilenilen ilaca dirençli fenotipler için çok sayıda tam uzunlukta HCV varyantı oluşturulabilir ve taranabilir. Tam genom mutant kütüphaneleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi, azalan miktarlarda (100-10 ng) klonal-pJFH1 kullanılarak sentezlendi. Ep-PCR ürünlerinin (mutant kütüphaneleri) ortalama verimleri 3.8-12.5 ng/μL arasında değişmektedir. Şekil 3, klonal-pJFH1'den ve temsili mutant kütüphanesinden (50 ng klonal-pJFH1 kullanılarak sentezlenen ML50) sentezlenen viral transkriptleri göstermektedir. Klonal-pJFH1, XbaI sindirimi yoluyla doğrusallaştırılırken, ML50 doğrudan in vitro transkripsiyon reaksiyonunda kullanıldı. Mutant kütüphanelerdeki (mutant viral RNA'lar) mutasyonların oranı, Şekil 4'te gösterildiği gibi, ep-PCR reaksiyonunda pJFH1 girdisinin azalmasıyla artmıştır. 50 ng şablon (klonal-pJFH1) kullanılarak sentezlenen ML50, kopyalanan 10.000 bp başına 4 ikameye sahipken, 25 ng şablon kullanılarak sentezlenen ML25, 9 ikame barındırıyordu. Klonal-pJFH1'de dizilenen nükleotid sayısı içinde herhangi bir ikame bulunmadı. ML50 viral varyantları, Şekil 5'te gösterildiği gibi, klonal-JFH1 virüsüne kıyasla bir NS5A inhibitörü olan pibrentasvir'e daha az duyarlıydı (12.7 kat). Tablo 5, pibrentasvir tedavisinin 1x EC 50'sine karşı seçilen ML50 viral varyantlarında tanımlananNS5A ikamelerine sahiptir. Sekiz NS5A klonundan dördü D7V+F28C kombinasyonuna sahipken, V8A+F28C ve F36L'nin her biri bir klonda meydana geldi. Bu mutasyonlar, klinik olarak anlamlı NS5A direnç mutasyonlarını barındırdığı bilinen NS5A'nın N-terminal bölgesindeydi17.
Şekil 1: FL-MRS stratejisinin şeması ve ilaca dirençli fenotip seçimi. (A) pJFH1 cDNA (vahşi tip) klonu, tam uzunlukta bir genotip 2a virüs genomu ve T7 promotörü taşır. Primer J-For, T7 promotörünün yukarısındadır ve primer J-Rev, HCV genomunun 3' ucunda bulunur. (B) Clonal-pJFH1, genetik varyasyonları tasarlamak ve tam genom mutant kütüphaneleri oluşturmak için hataya eğilimli PCR kullanılarak rastgele mutajenize edilir. Clonal-pJFH1, XbaI sindirimi ile doğrusallaştırılır. (C) Tam genomlu ep-PCR ürünleri ve doğrusallaştırılmış klonal-pJFH1, in vitro transkripsiyon için şablonlardır. ML'lerin ve klonal-JFH1'in viral RNA'larındaki mutasyonların oranı, NS5A'nın TA alt klonlaması ve pozitif TA klonlarının Sanger dizilimi ile belirlendi. (D) Huh7.5 hücrelerinin mutant viral RNA transfeksiyonundan sonra üretilen replikasyona yetkin varyantlar, NS5A'ya dirençli fenotiplerin seçimi için pibrentasvir (bir NS5A inhibitörü) ile muamele edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ep-PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi. Değişen şablon miktarları (100 ng, 50 ng, 25 ng ve 10 ng pJFH1) kullanılarak sentezlenen HCV tam genom ep-PCR ürünleri, %0.8 TAE agaroz jel elektroforezi kullanılarak ayrıldı. ep-PCR ürününün beklenen boyutu 9.7 kb'dir. Ayrılan ürünler etidyum bromür boyama ile görselleştirildi. Şerit 1, 1 kb'lik bir DNA merdivenidir; Şerit 6, şablonsuz kontroldür (H2O olarak etiketlenir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Viral transkriptlerin MOPS formaldehit agaroz jel elektroforezi. Doğrusallaştırılmış pJFH1 (Şerit 2) ve ep-PCR (Şerit 3) içeren 50 ng (ML50) pJFH1 ile elde edilen mutant kütüphane, in vitro transkripsiyon reaksiyonu için şablon olarak kullanıldı. Transkriptlerin bütünlüğü, etidyum bromür ile boyanmış bir MOPS formaldehit %0.8 agaroz jel kullanılarak analiz edildi. Şerit 1, 1 kb'lik bir RNA merdivenidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mutant kütüphanelerdeki ikamelerin oranı. Klonal-pJFH1, ML50 ve ML25 RNA'larından NS5A genleri, yüksek kaliteli PCR'lerde amplifiye edildi, ardından 3' A çıkıntısı eklendi, ürünün T-vektörü ile bağlanması ve E. coli DH5α'nın bağlanmış ürün ile dönüşümü izledi. Yaklaşık 40.000 nükleotid/kütüphane veya klonal-pJFH1 Sanger dizilimine tabi tutulmuştur. Kopyalanan 10.000 bp başına ortalama mutasyon oranı gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5:ML50 varyantlarına karşı pibrentasvirin EC 50 tahmini. Huh7.5 hücreleri, klonal-JFH1 virüsü veya ML50 varyantları ile enfekte edildi ve 100 pM pibrentasvir'den başlayarak seri iki katlı dilüsyonlarla tedavi edildi, ardından 3 gün sonra FFA ile tedavi edildi. FFU-redüksiyon test değerleri kullanılarak sigmoidal doz-yanıt eğrileri,% 50 etkili konsantrasyonu tahmin etmek için istatistiksel analiz yazılımında çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 50 μL için bileşenler | Gerekli stok değeri | Son konsantrasyon/reaksiyon |
| 10x PCR arabelleği | 5,0 μL | 1 adet |
| MgCl2 (50 mM) | 1,5 μL | 1,5 milyon |
| KB Genişletici | 2,0 μL | - |
| dNTP'ler (10 mM) | 1,0 μL | 0,2 milyon |
| İleri astar (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Ters astar (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Taq DNA Polimeraz (10 U/μL) | 0,5 μL (1:4 seyreltilmiş) | 1 U |
| Şablon (pJFH1, 20 ng/μL) | 0,5 ila 5,0 μL | 10 ila 100 ng |
| Su | 32,5 ila 37,5 μL | 50 μL'lik son hacim için ayarlayın |
Tablo 1. HCV tam genomunun amplifikasyonu için Ep-PCR bileşenleri.
| Sıcaklık | Saat | Döngü(ler) |
| 95 °C | 3 dk | 1 |
| 95 °C | 30 saniye | 30 |
| 60 °C | 25 saniye | |
| 72 °C | 8 dk | |
| 72 °C | 10 dk | 1 |
| 4 °C | Tutmak |
Tablo 2. HCV tam genomunun ep-PCR'si için döngü koşulları.
| Tahlil | Astar | Sıra (5'-3') |
| Kısmi NS4B-NS5A-kısmi NS5B'nin amplifikasyonu | 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R Serisi | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| cDNA sentezi | 9464R Serisi | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR | R9-148-S21FT (TaqMan probu) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6-130-S17 Serisi | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| R6-290-R19 Serisi | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| ep-PCR ürünlerindeki mutasyonların oranlarını belirlemek için primerlerin dizilenmesi | 6208-SPF (Ortalama) | CCCAACTACTTGGCTCTCTCTTAC |
| 6748-SPF (Türkçe) | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| NS5A gen dizilimi (ve ep-PCR ürünlerindeki mutasyon oranlarını belirlemek için) | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R Serisi | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
Tablo 3. Tahlillerde kullanılan primerler ve diziler.
| Sıcaklık | Saat | Döngü(ler) |
| 95 °C | 4 dk | 1 |
| 95 °C | 30 saniye | 5 |
| 68 °C | 30 saniye | |
| 72 °C | 2 dk | |
| 95 °C | 30 saniye | 5 |
| 66 °C | 30 saniye | |
| 72 °C | 2 dk | |
| 95 °C | 30 saniye | 5 |
| 64 °C | 30 saniye | |
| 72 °C | 2 dk | |
| 95 °C | 30 saniye | 5 |
| 62 °C | 30 saniye | |
| 72 °C | 2 dk | |
| 95 °C | 30 saniye | 10 |
| 60 °C | 30 saniye | |
| 72 °C | 2 dk | |
| 72 °C | 10 dk | 1 |
| 4 °C | Tutmak |
Tablo 4. NS5A amplifikasyonu için döngü koşulları.
| Oyuncu değişikliği(ler)i | Hayır. klon sayısı (n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36L | 1 |
Tablo 5. NS5A'nın Pibrentasvir direnci ikameleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, HCV tam genom kütüphanelerini sentezlemek için ep-PCR18 ve ters genetiği entegre eden basit ve hızlı bir FL-MRS prosedürünü detaylandırdık ve daha sonra ilaca dirençli fenotiplerin taranması için replikasyona yetkin varyantlar oluşturmak için bir hücre kültürü sisteminde kullanılabilir. Düşük kaliteli Taq DNA polimerazın kullanımı, tam uzunlukta bir viral genomun PCR amplifikasyonu sırasında ikamelerin dahil edilmesine izin veren ep-PCR'nin bir ön koşuludur. Birkaç düşük kaliteli Taq DNA polimerazını test ettik ve Platinum Taq DNA polimerazın yüksek verime sahip ~10 kb boyutunda bir ep-PCR ürünü verdiğini bulduk (veriler gösterilmemiştir). Tam genom kitaplıklarındaki mutasyonların oranını kontrol etmek için sabit sayıda termal döngü kullanmanızı ve girdi şablonu miktarını değiştirmenizi öneririz. FL-MRS, tam uzunlukta viral RNA'lar için şablon olarak hatalı tam genomlar kullandığından, RNA sentez reaksiyonunun tanımlanmış uzunlukta virüs transkriptleri üretmesini sağlamak için primer setinin dikkatli bir tasarımı kritik öneme sahiptir: (i) ileri primer, T7 polimerazın ep-PCR ürününe bağlanmasını kolaylaştırmak için cDNA klonunun T7 promotörünün, yukarı akışına (~50 nükleotid) yerleştirilmelidir; ve (ii) in vitro RNA sentezi sırasında transkripsiyon akışını kolaylaştırmak için ters primer dizisi virüs genomunun 3' ucunda sona ermelidir.
Bununla birlikte, yöntem nispeten kabadır ve genomdaki ilgili bölgelerde gerekli sayıda ve türde ikamelerin dahil edilmesi üzerinde hiçbir kontrol yoktur. FL-MRS'nin önemli bir avantajı, sentezlenen tam uzunluktaki transkriptlerin doğrudan hücreleri transfekte etmek için kullanılabilmesidir, bu da yaklaşımı büyük bir viral varyant havuzu oluşturmak için basit ve verimli hale getirir. Buna karşılık, dairesel polimeraz uzatma ve Mu-transpozon ekleme mutajenez yöntemleri, mutant havuzunun çeşitliliğini ciddi şekilde sınırlayan, istenen fenotipin seçilmesinden önce PCR ürününün klonlanmasını ve transformatörlerin taranmasını gerektirir. Yöntemimiz istenen birkaç fenotipi verme şansını büyük ölçüde artırsa da, taramada normalde bireysel viral varyantların değerlendirilmesi gerekir.
ep-PCR'nin virüs ters genetiği ile entegrasyonu, HCV mutantlarını hızlı bir şekilde üretmemizi sağladı. Bu yöntem, yüzlerce genetiği değiştirilmiş virüs üretme potansiyeline sahiptir, bu da şu anda mevcut olan in vitro mutajenez teknikleriyle mümkün görünmemektedir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, ~10 kb uzunluğa kadar genom içeren herhangi bir (+)ssRNA virüsünü taşıyan cDNA klonlarına kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma için finansman desteği (hibe numarası BT/PR10906/MED/29/860/2014) Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U.
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R.
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
