Summary
Aquí, presentamos un protocolo para detectar la motilidad bacteriana basada en una reacción de color. Las ventajas clave de este método son que es fácil de evaluar y más preciso, y no requiere equipo especializado.
Abstract
La motilidad bacteriana es crucial para la patogenicidad bacteriana, la formación de biopelículas y la resistencia a los medicamentos. La motilidad bacteriana es crucial para la invasión y/o diseminación de muchas especies patógenas. Por lo tanto, es importante detectar la motilidad bacteriana. Las condiciones de crecimiento bacteriano, como el oxígeno, el pH y la temperatura, pueden afectar el crecimiento bacteriano y la expresión de flagelos bacterianos. Esto puede conducir a una motilidad reducida o incluso a la pérdida de motilidad, lo que resulta en la evaluación inexacta de la motilidad bacteriana. Basado en la reacción de color del cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) por deshidrogenasas intracelulares de bacterias vivas, TTC se agregó al agar semisólido tradicional para la detección de la motilidad bacteriana. Los resultados mostraron que este método de agar semisólido TTC para la detección de la motilidad bacteriana es simple, fácil de operar y no involucra instrumentos grandes y costosos. Los resultados también mostraron que la mayor motilidad se observó en medio semisólido preparado con agar 0,3%. En comparación con el medio semisólido tradicional, los resultados son más fáciles de evaluar y más precisos.
Introduction
La motilidad bacteriana juega un papel crítico en la patogenicidad bacteriana, la formación de biopelículas y la resistencia a los medicamentos1. La motilidad bacteriana está estrechamente asociada con la patogenicidad y es necesaria para la colonización bacteriana durante la infección temprana de las células huésped2. La formación de biopelículas está estrechamente relacionada con la motilidad bacteriana, donde las bacterias se adhieren a la superficie de los medios sólidos a través de la motilidad. Durante mucho tiempo se ha considerado que la motilidad bacteriana se correlaciona positivamente con la formación de biopelículas. Un alto grado de resistencia bacteriana a los medicamentos debido al biofilm puede conducir a infecciones persistentes que son una amenaza para la salud humana 3,4,5. Por lo tanto, es importante detectar la motilidad bacteriana. La prueba de motilidad bacteriana se utiliza principalmente para examinar la motilidad de diferentes formas de bacterias en el estado vivo, lo que puede determinar indirectamente la presencia o ausencia de flagelos y, por lo tanto, tiene un papel importante en la identificación de bacterias.
Existen métodos directos e indirectos para detectar la motilidad bacteriana6. Como las bacterias con flagelos muestran motilidad, es posible detectar si las bacterias son móviles indirectamente detectando la presencia o ausencia de flagelos. Por ejemplo, es posible detectar la motilidad indirectamente mediante microscopía electrónica y tinción flagelar para indicar que las bacterias son móviles. También es posible detectar por métodos directos, como la caída de suspensión y los métodos de punción semisólida.
El método de punción semisólida comúnmente utilizado en los laboratorios de microbiología de pregrado para detectar la motilidad bacteriana inocula a las bacterias en la punción en el medio de agar semisólido que contiene 0.4-0.8% de agar, de acuerdo con la dirección del crecimiento bacteriano. Si las bacterias crecen a lo largo de la línea de punción para extenderse, aparecen rastros de crecimiento en forma de nube (en forma de cepillo), lo que indica la presencia de flagelos y, por lo tanto, motilidad. Si no hay rastros de crecimiento de la línea de perforación, la bacteria no es flagelada ni móvil.
Sin embargo, este método tiene sus inconvenientes: las bacterias son incoloras y transparentes, la actividad flagelar se ve afectada por las características fisiológicas de las bacterias vivas y otros factores, y la concentración de agar y el pequeño diámetro del tubo de ensayo. Además, las bacterias aeróbicas solo son adecuadas para el crecimiento en la superficie del agar, lo que afecta la observación de la motilidad bacteriana. Por lo tanto, para mejorar este experimento, se agregó cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (incoloro) al medio para establecer un método más confiable e intuitivo para determinar la motilidad bacteriana que el método actual de punción directa utilizando deshidrogenasas intracelulares para catalizar la formación de un producto rojo de TTC 7,8,9,10.
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Protocol
1. Preparación del medio semisólido
- Agar semisólido tradicional
- Prepare el agar semisólido tradicional de acuerdo con la receta del medio de prueba de motilidad bacteriana utilizando los ingredientes básicos11. Disuelva 10 g de triptosa, 15 g de NaCl, 4 g de agar en suficiente agua destilada, ajuste el pH a 7.2 ± 0.2 y enrasar el volumen final a 1,000 mL.
- Autoclave el agar a 121 °C durante 20 min, y dispense en tubos de ensayo de 10 ml como un medio semisólido de 3 cm de altura.
- Agar semisólido tradicional con TTC
- Después de esterilizar en autoclave el medio semisólido convencional, enfriarlo a 50 °C, agregar 5 ml de solución estéril de TTC al 100 ml de medio, mezclar y dispensar en tubos de ensayo de 10 ml para formar un medio semisólido de 3 cm de altura.
2. Cepas bacterianas
NOTA: Se aislaron ochenta cepas del medio acuático y se identificaron utilizando un instrumento automatizado de identificación de bacterias (ver la Tabla de materiales), incluyendo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae y Aeromonas hydrophila (Tabla 1). Staphylococcus aureus (ver la Tabla de materiales) se utilizó como un control negativo inmóvil; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella typhimurium (ver la Tabla de materiales) se utilizaron como cepas de control positivo.
- Identificar las cepas bacterianas de prueba que se utilizarán para el análisis de la motilidad.
- Incluye controles negativos inmóviles y tensiones móviles de control positivo.
3. Observación de la motilidad bacteriana mejorada por TTC
- Recoger colonias individuales de bacterias problema de las placas de agar e inocularlas en los dos medios semisólidos anteriores (pasos 1.1.2 y 1.2.1) mediante punción con agujas inoculantes.
- Cultivar los tubos a 37 °C en la incubadora durante 24-48 h para observar los resultados.
- Observe el estado de crecimiento: caracterice las bacterias como inmóviles (-) si solo la línea de punción es roja. Caracterizar las bacterias como móviles (+) si el color rojo se extiende ligeramente hacia afuera a lo largo de la línea de punción12.
4. Efecto de diferentes concentraciones en agar sobre la motilidad bacteriana
- Prepare medios semisólidos que contengan agar 0.3%, 0.5% y 0.8% e inoculos por punción, como se describió anteriormente. Observe los resultados después de 24-48 h de incubación.
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Representative Results
Tanto las cepas estándar como las cepas aisladas se compararon para la detección de la motilidad, y los resultados se muestran en la Tabla 1. Debido a la ausencia de flagelos, Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae solo crecieron a lo largo de la línea inoculada en medios semisólidos tradicionales y TTC. En contraste, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella typhimurium mostraron crecimiento en todas las direcciones alrededor de la línea inoculada después de cultivar durante 24 h en medio semisólido TTC. Esto fue aún más obvio después de 48 h de cultivo (Figura 1). Aunque las bacterias crecieron en todas las direcciones en el medio semisólido tradicional, fue mucho más difícil de visualizar que en el medio TTC debido al pequeño número de bacterias en el lado externo de la línea inoculada.
Figura 1: Resultados de la prueba de motilidad utilizando medio semisólido TTC. Staphylococcus aureus a la izquierda, Escherichia coli a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Colar | Medio semisólido con 0,4% de agar | Medio semisólido con 0,4% de agar y 0,005% de TTC | |||
| 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| E. coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium ATCC14028 | + | + | + | + | |
| S. aureus ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hydrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Los números indican el número de cepas positivas (+) y manchas negativas (-). | |||||
Tabla 1: Comparación de la motilidad bacteriana.
Figura 2: Observación de la actividad de la motilidad de Escherichia coli a diferentes concentraciones de agar. De izquierda a derecha: 0,3%, 0,5%, 0,8% agar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La influencia de la concentración de agar en la motilidad bacteriana se muestra en la Figura 2. Encontramos que la mayor motilidad se observó en medio semisólido preparado con agar 0,3%. El color medio en el tubo se volvió casi completamente rojo. En contraste, el área de difusión roja disminuyó, y la difusión se prolongó con el aumento de la concentración de agar.
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Discussion
La detección de la motilidad bacteriana por el método del medio semisólido se ve afectada por muchos factores13,14. Las condiciones de crecimiento bacteriano, como el oxígeno (aeróbico en la superficie del agar, no aeróbico en la parte inferior del tubo con el medio semisólido), el pH y la temperatura, pueden afectar la viabilidad de los flagelos bacterianos, lo que puede conducir a una motilidad reducida o incluso a la pérdida de la motilidad15. Además, algunas bacterias de tipo mucoso como su motilidad pueden verse afectadas por la producción de podoconjugados.
La adición de TTC al medio semisólido ayuda a la observación de la motilidad. Las bacterias fermentativas con fuerza motriz pueden crecer en todas las direcciones a lo largo de la línea de punción después de la incubación. Por lo tanto, el medio alrededor de la línea de punción se vuelve rojo. Las bacterias no fermentativas con fuerza motriz tienen bajo contenido de oxígeno en la parte inferior del medio. Por lo tanto, estas bacterias crecen mal, de modo que solo la capa superior del medio es roja. Las bacterias sin fuerza motriz solo pueden crecer en la línea de inoculación, y solo la línea de punción aparece roja.
Al detectar la motilidad bacteriana con medio semisólido TTC, cuanto mayor sea el tiempo de cultivo, más obvios serán los resultados, especialmente con concentraciones más bajas de agar. Si el resultado es difícil de interpretar, el tiempo de cultivo debe extenderse adecuadamente. Esto puede estar relacionado con la concentración en agar del medio semisólido, el número de bacterias y su motilidad16. Además, este método reveló que algunas cepas de E. coli y P. aeruginosa no podían crecer alrededor de un medio de agar semisólido convencional y mostraron solo un tenue color rojo en la superficie del medio en el medio de agar semisólido TTC. Esto puede deberse a la producción de cápsulas por tales cepas, lo que afecta su motilidad17. Este fenómeno también ocurre en Neisseria meningitidis18 debido a su cápsula. En conclusión, la detección de la motilidad bacteriana utilizando un medio semisólido cromogénico que contiene TTC reduce la influencia de los factores bacterianos en los resultados de la prueba y hace que los resultados sean más fáciles de observar a simple vista. La ventaja de una alta tasa de detección hace que este sea un método eficaz que puede reemplazar el medio semisólido tradicional para detectar la motilidad bacteriana.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD) y el Proyecto de Investigación de Reforma Docente de la Universidad Farmacéutica de China (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
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