Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar motilidade bacteriana baseado em uma reação de cor. As principais vantagens deste método são que é fácil de avaliar e mais preciso, e não requer equipamentos especializados.
Abstract
A motilidade bacteriana é crucial para a patogenicidade bacteriana, formação de biofilme e resistência a drogas. A motilidade bacteriana é crucial para a invasão e/ou disseminação de muitas espécies patogênicas. Portanto, é importante detectar a motilidade bacteriana. Condições de crescimento bacteriano, como oxigênio, pH e temperatura, podem afetar o crescimento bacteriano e a expressão de flagelos bacterianos. Isso pode levar à redução da motilidade ou mesmo à perda da motilidade, resultando na avaliação imprecisa da motilidade bacteriana. Com base na reação de cor do cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) por desidrogenases intracelulares de bactérias vivas, o TTC foi adicionado ao ágar semissólido tradicional para detecção da motilidade bacteriana. Os resultados mostraram que este método de ágar semissólido TTC para detecção de motilidade bacteriana é simples, fácil de operar e não envolve instrumentos grandes e caros. Os resultados também mostraram que a maior motilidade foi observada em meio semissólido preparado com 0,3% de ágar. Em comparação com o meio semissólido tradicional, os resultados são mais fáceis de avaliar e mais precisos.
Introduction
A motilidade bacteriana desempenha um papel crítico na patogenicidade bacteriana, na formação de biofilme e na resistência a drogas1. A motilidade bacteriana está intimamente associada à patogenicidade e é necessária para a colonização bacteriana durante a infecção precoce das células dohospedeiro2. A formação de biofilme está intimamente relacionada à motilidade bacteriana, onde as bactérias aderem à superfície do meio sólido através da motilidade. A motilidade bacteriana tem sido considerada positivamente correlacionada com a formação de biofilme. Um alto grau de resistência bacteriana a drogas devido ao biofilme pode levar a infecções persistentes que são uma ameaça à saúde humana 3,4,5. Portanto, é importante detectar a motilidade bacteriana. O teste de motilidade bacteriana é usado principalmente para examinar a motilidade de diferentes formas de bactérias no estado vivo, que podem determinar indiretamente a presença ou ausência de flagelos e, portanto, tem um papel importante na identificação de bactérias.
Existem métodos diretos e indiretos para detectar a motilidade bacteriana6. Como as bactérias com flagelos apresentam motilidade, é possível detectar se as bactérias são móveis indiretamente, detectando a presença ou ausência de flagelos. Por exemplo, é possível detectar a motilidade indiretamente por microscopia eletrônica e coloração flagelar para indicar que as bactérias são móveis. Também é possível detectar por métodos diretos, como queda de suspensão e punção semissólida.
O método de punção semissólido comumente utilizado em laboratórios de microbiologia de graduação para detectar motilidade bacteriana inocula a bactéria na punção em meio ágar semissólido contendo 0,4-0,8% de ágar, de acordo com a direção do crescimento bacteriano. Se a bactéria crescer ao longo da linha de punção para se espalhar, aparecem vestígios de crescimento semelhantes a nuvens (semelhantes a escovas), indicando a presença de flagelos e, portanto, motilidade. Se não houver vestígios de crescimento na linha de punção, a bactéria não é flagelada nem móvel.
No entanto, este método tem suas desvantagens: as bactérias são incolores e transparentes, a atividade flagelar é afetada pelas características fisiológicas das bactérias vivas e outros fatores, e a concentração de ágar e o pequeno diâmetro do tubo de ensaio. Além disso, bactérias aeróbias são adequadas apenas para o crescimento na superfície do ágar, afetando a observação da motilidade bacteriana. Assim, para aprimorar este experimento, o cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) (incolor) foi adicionado ao meio para estabelecer um método mais confiável e intuitivo de determinação da motilidade bacteriana do que o método atual de punção direta, utilizando desidrogenases intracelulares para catalisar a formação de um produto vermelho do TTC 7,8,9,10.
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Protocol
1. Preparo do meio semissólido
- Ágar semissólido tradicional
- Preparar o ágar semissólido tradicional de acordo com a receita do meio teste de motilidade bacteriana utilizando os ingredientes básicos11. Dissolver 10 g de triptose, 15 g de NaCl, 4 g de ágar em água destilada suficiente, ajustar o pH para 7,2 ± 0,2 e perfazer o volume final para 1.000 mL.
- Autoclavar o ágar a 121 °C por 20 min e distribuí-lo em tubos de ensaio de 10 mL como meio semissólido de 3 cm de altura.
- Ágar semissólido tradicional com TTC
- Após a autoclavagem do meio semissólido convencional, resfriá-lo a 50 °C, adicionar 5 mL de solução TTC 1% estéril a 100 mL de meio, misturar e dispensá-lo em tubos de ensaio de 10 mL para formar um meio semissólido de 3 cm de altura.
2. Cepas bacterianas
NOTA: Oitenta cepas foram isoladas do ambiente aquático e identificadas usando um instrumento automatizado de identificação bacteriana (ver Tabela de Materiais), incluindo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp. , Klebsiella pneumoniae e Aeromonas hydrophila (Tabela 1). Staphylococcus aureus (ver Tabela de Materiais) foi utilizado como controle negativo não móvel; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium (ver Tabela de Materiais) foram utilizadas como cepas controle positivas.
- Identificar cepas bacterianas de teste a serem usadas para análise de motilidade.
- Inclua controles negativos não móveis e cepas de controle positivo móveis.
3. Observação da motilidade bacteriana reforçada pelo TTC
- Seleccionar colónias únicas de bactérias de ensaio a partir de placas de ágar e inocular-as nos dois meios semissólidos acima referidos (passos 1.1.2 e 1.2.1) por punção utilizando agulhas inoculantes.
- Cultivar os tubos a 37 °C na incubadora por 24-48 h para observar os resultados.
- Observe o estado de crescimento: caracterize as bactérias como não móveis (-) se apenas a linha de punção for vermelha. Caracterizar as bactérias como móveis (+) se a cor vermelha se espalhar levemente para fora ao longo da linha de punção12.
4. Efeito de diferentes concentrações de ágar sobre a motilidade bacteriana
- Preparar meios semissólidos contendo 0,3%, 0,5% e 0,8% de ágar e inocular-os por punção, conforme descrito acima. Observe os resultados após 24-48 h de incubação.
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Representative Results
Tanto as cepas padrão quanto as isoladas foram comparadas para detecção da motilidade, e os resultados são mostrados na Tabela 1. Devido à ausência de flagelos, Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae cresceram apenas ao longo da linha inoculada em ambos os meios semissólido tradicional e TTC. Em contraste, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella typhimurium apresentaram crescimento em todas as direções ao redor da linhagem inoculada após cultivo por 24 h em meio TTC semissólido. Isso ficou ainda mais evidente após 48 h de cultura (Figura 1). Embora as bactérias tenham crescido em todas as direções no meio semissólido tradicional, foi muito mais difícil de visualizar do que no meio TTC devido ao pequeno número de bactérias no lado externo da linha inoculada.
Figura 1: Resultados do teste de motilidade utilizando meio semissólido TTC. Staphylococcus aureus à esquerda, Escherichia coli à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Coar | Meio semissólido com 0,4% de ágar | Meio semissólido com 0,4% ágar e 0,005% TTC | |||
| 24 horas | 48 horas | 24 horas | 48 horas | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| E. coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium ATCC14028 | + | + | + | + | |
| S. aureus ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hidrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| ( 8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Os números indicam os números de cepas positivas (+) e negativas (-). | |||||
Tabela 1: Comparação da motilidade bacteriana.
Figura 2: Observação da atividade da motilidade de Escherichia coli em diferentes concentrações de ágar. Da esquerda para a direita: 0,3%, 0,5%, 0,8% ágar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A influência da concentração de ágar na motilidade bacteriana é mostrada na Figura 2. Verificou-se que a maior motilidade foi observada em meio semissólido preparado com 0,3% de ágar. A cor média no tubo ficou quase inteiramente vermelha. Em contraste, a área de difusão vermelha diminuiu, e a difusão foi prolongada com o aumento da concentração de ágar.
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Discussion
A detecção da motilidade bacteriana pelo método do meio semissólido é afetada por váriosfatores13,14. Condições de crescimento bacteriano, como oxigênio (aeróbio na superfície do ágar, não aeróbio no fundo do tubo com o meio semissólido), pH e temperatura, podem afetar a viabilidade dos flagelos bacterianos, o que pode levar à redução da motilidade ou mesmo à perda da motilidade15. Além disso, algumas bactérias do tipo muco como sua motilidade podem ser afetadas pela produção de podoconjugados.
A adição de TTC ao meio semissólido auxilia na observação da motilidade. As bactérias fermentativas com poder motriz podem crescer em todas as direções ao longo da linha de punção após a incubação. Assim, o meio ao redor da linha de punção torna-se vermelho. As bactérias não fermentativas com poder motriz apresentam baixo teor de oxigênio na parte inferior do meio. Assim, essas bactérias crescem mal, de modo que apenas a camada superior do meio é vermelha. Bactérias sem força motriz só podem crescer na linha de inoculação, e apenas a linha de punção aparece vermelha.
Ao detectar a motilidade bacteriana com meio TTC-semissólido, quanto maior o tempo de cultivo, mais evidentes são os resultados, principalmente com menores concentrações de ágar. Se o resultado for difícil de interpretar, o tempo de cultura deve ser estendido adequadamente. Isso pode estar relacionado à concentração de ágar do meio semissólido, ao número de bactérias e à sua motilidade16. Além disso, este método revelou que algumas cepas de E. coli e P. aeruginosa não puderam crescer em meio ágar semissólido convencional e apresentaram apenas uma leve coloração vermelha na superfície do meio em meio ágar semissólido TTC. Isso pode ser devido à produção de cápsulas por essas cepas, o que afeta sua motilidade17. Esse fenômeno também ocorre em Neisseria meningitidis18 devido à sua cápsula. Em conclusão, a detecção da motilidade bacteriana utilizando um meio semissólido cromogênico contendo TTC reduz a influência de fatores bacterianos nos resultados dos testes e torna os resultados mais fáceis de serem observados a olho nu. A vantagem de uma alta taxa de detecção torna este um método eficaz que pode substituir o meio semissólido tradicional para detectar a motilidade bacteriana.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Desenvolvimento do Programa Acadêmico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD) e pelo Projeto de Pesquisa de Reforma do Ensino da Universidade Farmacêutica da China (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
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