Summary
Her præsenterer vi en protokol til påvisning af bakteriel motilitet baseret på en farvereaktion. De vigtigste fordele ved denne metode er, at den er let at evaluere og mere præcis og ikke kræver specialudstyr.
Abstract
Bakteriel motilitet er afgørende for bakteriel patogenicitet, biofilmdannelse og lægemiddelresistens. Bakteriel motilitet er afgørende for invasion og / eller spredning af mange patogene arter. Derfor er det vigtigt at detektere bakteriel motilitet. Bakterielle vækstbetingelser, såsom ilt, pH og temperatur, kan påvirke bakterievækst og ekspression af bakteriel flagella. Dette kan føre til nedsat bevægelighed eller endda tab af bevægelighed, hvilket resulterer i den unøjagtige evaluering af bakteriel motilitet. Baseret på farvereaktionen af 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) ved intracellulære dehydrogenaser af levende bakterier blev TTC tilsat til traditionel halvfast agar til bakteriel motilitetsdetektion. Resultaterne viste, at denne TTC semisolid agar-metode til påvisning af bakteriel motilitet er enkel, nem at betjene og ikke involverer store og dyre instrumenter. Resultaterne viste også, at den højeste bevægelighed blev observeret i halvfast medium fremstillet med 0,3% agar. Sammenlignet med det traditionelle halvfaste medium er resultaterne lettere at evaluere og mere præcise.
Introduction
Bakteriel motilitet spiller en kritisk rolle i bakteriel patogenicitet, biofilmdannelse og lægemiddelresistens1. Bakteriel motilitet er tæt forbundet med patogenicitet og er nødvendig for bakteriel kolonisering under tidlig infektion af værtsceller2. Biofilmdannelse er tæt forbundet med bakteriel motilitet, hvor bakterier klæber til overfladen af faste medier gennem bevægelighed. Bakteriel motilitet har længe været anset for at være positivt korreleret med biofilmdannelse. En høj grad af bakteriel lægemiddelresistens på grund af biofilm kan føre til vedvarende infektioner, der er en trussel mod menneskers sundhed 3,4,5. Derfor er det vigtigt at detektere bakteriel motilitet. Bakteriemotilitetstesten bruges hovedsageligt til at undersøge motiliteten af forskellige former for bakterier i levende tilstand, som indirekte kan bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af flagella og dermed har en vigtig rolle i identifikationen af bakterier.
Der er direkte og indirekte metoder til påvisning af bakteriel motilitet6. Da bakterier med flagella viser bevægelighed, er det muligt at opdage, om bakterier er bevægelige indirekte ved at detektere tilstedeværelsen eller fraværet af flagella. For eksempel er det muligt at detektere motilitet indirekte ved elektronmikroskopi og flagellær farvning for at indikere, at bakterier er bevægelige. Det er også muligt at detektere ved direkte metoder, såsom suspension drop og semisolid punkteringsmetoder.
Den halvfaste punkteringsmetode, der almindeligvis anvendes i bachelormikrobiologiske laboratorier til at detektere bakteriel motilitet, inokulerer bakterierne i punkteringen i det halvfaste agarmedium indeholdende 0,4-0,8% agar i henhold til retningen af bakterievækst. Hvis bakterierne vokser langs punkteringslinjen for at sprede sig rundt, vises skylignende (børstelignende) vækstspor, hvilket indikerer tilstedeværelsen af flagella og derfor bevægelighed. Hvis der ikke er nogen punkteringslinjevækstspor, er bakterien hverken flagelleret eller bevægelig.
Denne metode har imidlertid sine ulemper: bakterierne er farveløse og gennemsigtige, flagellæraktiviteten påvirkes af de levende bakteriers fysiologiske egenskaber og andre faktorer og koncentrationen af agar og reagensglassets lille diameter. Desuden er aerobe bakterier kun egnede til vækst på agaroverfladen, hvilket påvirker observationen af bakteriel motilitet. For at forbedre dette eksperiment blev der derfor tilsat 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) (farveløs) til mediet for at etablere en mere pålidelig og intuitiv metode til bestemmelse af bakteriel motilitet end den nuværende direkte punkteringsmetode ved anvendelse af intracellulære dehydrogenaser til at katalysere dannelsen af et rødt produkt af TTC 7,8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af halvfast medium
- Traditionel halvfast agar
- Forbered den traditionelle halvfaste agar i henhold til bakteriemotilitetstestmedieopskriften ved hjælp af basisingredienserne11. 10 g tryptose, 15 g NaCl, 4 g agar opløses i tilstrækkeligt destilleret vand, pH-værdien justeres til 7,2 ± 0,2, og det endelige volumen fyldes op til 1.000 ml.
- Agaren autoklaveres ved 121 °C i 20 minutter, og den hældes i 10 ml reagensglas som et 3 cm højt halvfast medium.
- Traditionel halvfast agar med TTC
- Efter autoklavering af det konventionelle halvfaste medium afkøles det til 50 °C, tilsættes 5 ml steril 1% TTC-opløsning til 100 ml medium, blandes og dispenseres i 10 ml reagensglas for at danne et 3 cm højt halvfast medium.
2. Bakteriestammer
BEMÆRK: Firs stammer blev isoleret fra vandmiljøet og identificeret ved hjælp af et automatiseret bakterieidentifikationsinstrument (se materialetabellen), herunder Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae og Aeromonas hydrophila (tabel 1). Staphylococcus aureus (se materialetabellen) blev anvendt som en negativ ikke-bevægelig kontrol; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa og Salmonella typhimurium (se materialetabellen) blev anvendt som positive kontrolstammer.
- Identificer testbakteriestammer, der skal bruges til motilitetsanalyse.
- Inkluder negative ikke-bevægelige kontroller og bevægelige positive kontrolstammer.
3. TTC-forbedret bakteriel motilitetsobservation
- Der udvælges enkelte kolonier af testbakterier fra agarpladerne, og de podes i ovennævnte to halvfaste medier (trin 1.1.2 og 1.2.1) ved punktering med podende nåle.
- Dyrk rørene ved 37 °C i inkubatoren i 24-48 timer for at observere resultaterne.
- Overhold væksttilstanden: karakteriser bakterierne som ikke-bevægelige (-), hvis kun punkteringslinjen er rød. Karakteriser bakterierne som bevægelige (+), hvis den røde farve spredes let udad langs punkteringslinjen12.
4. Virkning af forskellige agarkoncentrationer på bakteriel motilitet
- Forbered halvfaste medier indeholdende 0,3%, 0,5% og 0,8% agar og inokuler dem ved punktering som beskrevet ovenfor. Overhold resultaterne efter 24-48 timers inkubation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både standardstammer og isolerede stammer blev sammenlignet for motilitetsdetektion, og resultaterne er vist i tabel 1. På grund af fraværet af flagella voksede Staphylococcus aureus og Klebsiella pneumoniae kun langs den podede linje på både traditionelle og TTC semifaste medier. I modsætning hertil viste Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og Salmonella typhimurium vækst i alle retninger omkring den podede linje efter dyrkning i 24 timer på TTC halvfast medium. Dette var endnu mere tydeligt efter 48 timers kultur (figur 1). Selvom bakterierne voksede i alle retninger i det traditionelle halvfaste medium, var det meget vanskeligere at visualisere end i TTC-medium på grund af det lille antal bakterier på ydersiden af den podede linje.
Figur 1: Motilitetstestresultater ved hjælp af TTC semifast medium. Staphylococcus aureus til venstre, Escherichia coli til højre. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Stamme | Halvfast medium med 0,4% agar | Halvfast medium med 0,4% agar og 0,005% TTC | |||
| 24 timer | 48 timer | 24 timer | 48 timer | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| E. coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium ATCC14028 | + | + | + | + | |
| S. aureus ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hydrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Tal angiver antallet af positive stammer (+) og negative pletter (-). | |||||
Tabel 1: Sammenligning af bakteriel motilitet.
Figur 2: Observation af Escherichia coli-motilitetsaktivitet ved forskellige agarkoncentrationer. Fra venstre mod højre: 0,3%, 0,5%, 0,8% agar. Klik her for at se en større version af denne figur.
Agarkoncentrationens indflydelse på bakteriel motilitet er vist i figur 2. Vi fandt, at den højeste motilitet blev observeret i halvfast medium fremstillet med 0,3% agar. Mellemfarven i røret blev næsten helt rød. I modsætning hertil faldt området med rød diffusion, og diffusionen blev forlænget med stigende agarkoncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Påvisning af bakteriel motilitet ved halvfast medium-metoden påvirkes af mange faktorer13,14. Bakterielle vækstbetingelser, såsom ilt (aerob på agaroverfladen, ikke-aerob i bunden af røret med det halvfaste medium), pH og temperatur, kan påvirke levedygtigheden af bakteriel flagella, hvilket kan føre til nedsat bevægelighed eller endda tab af bevægelighed15. Derudover kan nogle slimbakterier som deres bevægelighed påvirkes af produktionen af podokonjugater.
Tilsætningen af TTC til det halvfaste medium hjælper observationen af bevægelighed. De fermentative bakterier med drivkraft kan vokse i alle retninger langs punkteringslinjen efter inkubation. Derfor bliver mediet omkring punkteringslinjen rødt. De ikke-fermentative bakterier med drivkraft har lavt iltindhold i den nederste del af mediet. Derfor vokser disse bakterier dårligt, så kun det øverste lag af mediet er rødt. Bakterier uden drivkraft kan kun vokse på podningslinjen, og kun punkteringslinjen vises rød.
Ved påvisning af bakteriel motilitet med TTC-semifast medium, jo længere dyrkningstid, jo mere indlysende er resultaterne, især med lavere agarkoncentrationer. Hvis resultatet er vanskeligt at fortolke, bør kulturtiden forlænges tilsvarende. Dette kan være relateret til agarkoncentrationen af det halvfaste medium, antallet af bakterier og deres bevægelighed16. Desuden afslørede denne metode, at nogle stammer af E. coli og P. aeruginosa ikke kunne vokse rundt på konventionelt halvfast agarmedium og kun viste en svag rød farve på overfladen af mediet på TTC halvfast agarmedium. Dette kan skyldes produktionen af kapsler af sådanne stammer, hvilket påvirker deres bevægelighed17. Dette fænomen forekommer også i Neisseria meningitidis18 på grund af dets kapsel. Afslutningsvis reducerer påvisning af bakteriel motilitet ved hjælp af et kromogent halvfast medium indeholdende TTC indflydelsen af bakterielle faktorer på testresultaterne og gør resultaterne lettere at observere med det blotte øje. Fordelen ved en høj detektionshastighed gør dette til en effektiv metode, der kan erstatte det traditionelle halvfaste medium til påvisning af bakteriel motilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) og Teaching Reform Research Project of China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D.
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W.
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
