Summary
Hier presenteren we een protocol om bacteriële motiliteit te detecteren op basis van een kleurreactie. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat deze gemakkelijk te evalueren en nauwkeuriger is en geen gespecialiseerde apparatuur vereist.
Abstract
Bacteriële motiliteit is cruciaal voor bacteriële pathogeniciteit, biofilmvorming en medicijnresistentie. Bacteriële beweeglijkheid is cruciaal voor de invasie en/of verspreiding van vele pathogene soorten. Daarom is het belangrijk om bacteriële beweeglijkheid te detecteren. Bacteriële groeiomstandigheden, zoals zuurstof, pH en temperatuur, kunnen de bacteriegroei en de expressie van bacteriële flagellen beïnvloeden. Dit kan leiden tot verminderde beweeglijkheid of zelfs verlies van motiliteit, wat resulteert in de onnauwkeurige evaluatie van bacteriële motiliteit. Op basis van de kleurreactie van 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) door intracellulaire dehydrogenasen van levende bacteriën, werd TTC toegevoegd aan traditionele semisolid agar voor bacteriële motiliteitsdetectie. De resultaten toonden aan dat deze TTC semisolid agar-methode voor de detectie van bacteriële motiliteit eenvoudig is, gemakkelijk te bedienen en geen grote en dure instrumenten omvat. De resultaten toonden ook aan dat de hoogste beweeglijkheid werd waargenomen in halfvast medium bereid met 0,3% agar. In vergelijking met het traditionele semisolid medium zijn de resultaten gemakkelijker te evalueren en nauwkeuriger.
Introduction
Bacteriële motiliteit speelt een cruciale rol bij bacteriële pathogeniciteit, biofilmvorming en medicijnresistentie1. Bacteriële motiliteit is nauw verbonden met pathogeniciteit en is noodzakelijk voor bacteriële kolonisatie tijdens vroege infectie van gastheercellen2. Biofilmvorming is nauw verwant aan bacteriële motiliteit, waarbij bacteriën zich door beweeglijkheid hechten aan het oppervlak van vaste media. Bacteriële motiliteit wordt al lang beschouwd als positief gecorreleerd met biofilmvorming. Een hoge mate van bacteriële resistentie tegen geneesmiddelen als gevolg van biofilm kan leiden tot aanhoudende infecties die een bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid 3,4,5. Daarom is het belangrijk om bacteriële beweeglijkheid te detecteren. De bacteriële motiliteitstest wordt voornamelijk gebruikt om de beweeglijkheid van verschillende vormen van bacteriën in de levende toestand te onderzoeken, die indirect de aan- of afwezigheid van flagellen kunnen bepalen en dus een belangrijke rol spelen bij de identificatie van bacteriën.
Er zijn directe en indirecte methoden om bacteriële motiliteitte detecteren 6. Omdat bacteriën met flagella beweeglijkheid vertonen, is het mogelijk om te detecteren of bacteriën indirect beweeglijk zijn door de aan- of afwezigheid van flagella te detecteren. Het is bijvoorbeeld mogelijk om beweeglijkheid indirect te detecteren door elektronenmicroscopie en flagellaire kleuring om aan te geven dat bacteriën beweeglijk zijn. Het is ook mogelijk om te detecteren met directe methoden, zoals suspensieval en semisolid punctiemethoden.
De semisolid punctiemethode die vaak wordt gebruikt in niet-gegradueerde microbiologische laboratoria om bacteriële motiliteit te detecteren, ent de bacteriën in de punctie in het semisolid agar-medium met 0,4-0,8% agar, afhankelijk van de richting van bacteriële groei. Als de bacteriën langs de punctielijn groeien om zich te verspreiden, verschijnen er wolkachtige (borstelachtige) groeisporen, wat wijst op de aanwezigheid van flagella en dus beweeglijkheid. Als er geen groeisporen van de priklijn zijn, is de bacterie niet gevlagd of beweeglijk.
Deze methode heeft echter zijn nadelen: de bacteriën zijn kleurloos en transparant, de flagellaire activiteit wordt beïnvloed door de fysiologische kenmerken van de levende bacteriën en andere factoren, en de concentratie van agar en de kleine diameter van de reageerbuis. Bovendien zijn aërobe bacteriën alleen geschikt voor groei op het agaroppervlak, wat de observatie van bacteriële beweeglijkheid beïnvloedt. Om dit experiment te verbeteren, werd daarom 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) (kleurloos) aan het medium toegevoegd om een betrouwbaardere en intuïtievere methode voor het bepalen van bacteriële motiliteit vast te stellen dan de huidige directe punctiemethode met behulp van intracellulaire dehydrogenasen om de vorming van een rood product van TTC 7,8,9,10 te katalyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van halfvast medium
- Traditionele semisolid agar
- Bereid de traditionele halfvaste agar volgens het recept van het bacteriële motiliteitstestmedium met behulp van de basisingrediënten11. Los 10 g tryptose, 15 g NaCl, 4 g agar op in voldoende gedestilleerd water, stel de pH in op 7,2 ± 0,2 en vul het uiteindelijke volume aan tot 1.000 ml.
- Autoclaaf de agar bij 121 °C gedurende 20 minuten en doseer deze in 10 ml reageerbuizen als een 3 cm hoog halfvast medium.
- Traditionele halfvaste agar met TTC
- Na het autoclaveren van het conventionele halfvaste medium, koel het af tot 50 °C, voeg 5 ml steriele 1% TTC-oplossing toe aan 100 ml medium, meng en doseer het in 10 ml reageerbuizen om een 3 cm hoog halfvast medium te vormen.
2. Bacteriestammen
OPMERKING: Tachtig stammen werden geïsoleerd uit het aquatisch milieu en geïdentificeerd met behulp van een geautomatiseerd bacterie-identificatie-instrument (zie de tabel met materialen), waaronder Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae en Aeromonas hydrophila (tabel 1). Staphylococcus aureus (zie de tabel met materialen) werd gebruikt als een negatieve niet-beweeglijke controle; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa en Salmonella typhimurium (zie de tabel met materialen) werden gebruikt als positieve controlestammen.
- Identificeer testbacteriestammen die moeten worden gebruikt voor motiliteitsanalyse.
- Neem negatieve niet-beweeglijke controles en beweeglijke positieve controlestammen op.
3. TTC-verbeterde bacteriële motiliteitsobservatie
- Pluk afzonderlijke kolonies van testbacteriën uit agarplaten en ent ze in de bovenstaande twee semisolid media (stappen 1.1.2 en 1.2.1) door punctie met behulp van entnaalden.
- Kweek de buisjes bij 37 °C in de incubator gedurende 24-48 uur om de resultaten te observeren.
- Let op de groeitoestand: karakteriseer de bacteriën als niet-beweeglijk (-) als alleen de punctielijn rood is. Karakteriseer de bacteriën als beweeglijk (+) als de rode kleur zich licht naar buiten verspreidt langs de punctielijn12.
4. Effect van verschillende agarconcentraties op bacteriële motiliteit
- Bereid halfvaste media met 0,3%, 0,5% en 0,8% agar en ent ze door punctie, zoals hierboven beschreven. Observeer de resultaten na 24-48 uur incubatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zowel standaardstammen als geïsoleerde stammen werden vergeleken voor motiliteitsdetectie en de resultaten zijn weergegeven in tabel 1. Door de afwezigheid van flagella groeiden Staphylococcus aureus en Klebsiella pneumoniae alleen langs de geënte lijn op zowel traditionele als TTC semisolid media. Daarentegen vertoonden Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli en Salmonella typhimurium groei in alle richtingen rond de geënte lijn na 24 uur kweken op TTC halfvast medium. Dit was nog duidelijker na 48 uur cultuur (figuur 1). Hoewel de bacteriën in alle richtingen groeiden in het traditionele halfvaste medium, was het veel moeilijker te visualiseren dan in TTC-medium vanwege het kleine aantal bacteriën aan de buitenzijde van de geënte lijn.
Figuur 1: Motiliteitstestresultaten met behulp van TTC halfvast medium. Staphylococcus aureus links, Escherichia coli rechts. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Zeven | Halfvast medium met 0,4% agar | Halfvast medium met 0,4% agar en 0,005% TTC | |||
| 24 uur | 48 u | 24 uur | 48 u | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| E. coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium Atcc14028 | + | + | + | + | |
| S. Aureus ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hydrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Getallen geven het aantal positieve stammen (+) en negatieve vlekken (-) aan. | |||||
Tabel 1: Vergelijking van bacteriële motiliteit.
Figuur 2: Observatie van Escherichia coli motiliteitsactiviteit bij verschillende agarconcentraties. Van links naar rechts: 0,3%, 0,5%, 0,8% agar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De invloed van de agarconcentratie op de bacteriële motiliteit is weergegeven in figuur 2. We vonden dat de hoogste beweeglijkheid werd waargenomen in halfvast medium bereid met 0,3% agar. De medium kleur in de tube werd bijna helemaal rood. Daarentegen nam het gebied van rode diffusie af en werd de diffusie verlengd met toenemende agarconcentratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De detectie van bacteriële motiliteit door de semisolid medium-methode wordt beïnvloed door vele factoren13,14. Bacteriële groeiomstandigheden, zoals zuurstof (aeroob op agaroppervlak, niet-aeroob aan de onderkant van de buis met het halfvaste medium), pH en temperatuur, kunnen de levensvatbaarheid van bacteriële flagellen beïnvloeden, wat kan leiden tot verminderde beweeglijkheid of zelfs verlies van beweeglijkheid15. Bovendien kunnen sommige slijmachtige bacteriën als hun beweeglijkheid worden beïnvloed door de productie van podoconjugaten.
De toevoeging van TTC aan het halfvaste medium helpt de observatie van motiliteit. De fermentatieve bacteriën met drijfkracht kunnen na incubatie in alle richtingen langs de punctielijn groeien. Vandaar dat het medium rond de punctielijn rood wordt. De niet-fermentatieve bacteriën met aandrijfkracht hebben een laag zuurstofgehalte in het onderste deel van het medium. Vandaar dat deze bacteriën slecht groeien, zodat alleen de bovenste laag van het medium rood is. Bacteriën zonder drijfkracht kunnen alleen op de inentingslijn groeien en alleen de punctielijn lijkt rood.
Bij het detecteren van bacteriële motiliteit met TTC-halfvast medium, hoe langer de kweektijd, hoe duidelijker de resultaten zijn, vooral bij lagere agarconcentraties. Als het resultaat moeilijk te interpreteren is, moet de kweektijd op de juiste manier worden verlengd. Dit kan verband houden met de agarconcentratie van het halfvaste medium, het aantal bacteriën en hun beweeglijkheid16. Bovendien onthulde deze methode dat sommige stammen van E. coli en P. aeruginosa niet konden groeien op conventioneel semisolid agar-medium en slechts een zwakke rode kleur vertoonden op het oppervlak van het medium op TTC semisolid agar-medium. Dit kan te wijten zijn aan de productie van capsules door dergelijke stammen, wat hun beweeglijkheid beïnvloedt17. Dit fenomeen komt ook voor bij Neisseria meningitidis18 vanwege de capsule. Kortom, de detectie van bacteriële motiliteit met behulp van een chromogeen semisolid medium dat TTC bevat, vermindert de invloed van bacteriële factoren op de testresultaten en maakt de resultaten gemakkelijker waar te nemen met het blote oog. Het voordeel van een hoge detectiesnelheid maakt dit een effectieve methode die het traditionele semisolid-medium voor het detecteren van bacteriële motiliteit kan vervangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) en het Teaching Reform Research Project van de China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D.
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W.
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
