Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי קל להעריך ומדויק יותר, ואינו דורש ציוד מיוחד.
Abstract
תנועתיות חיידקים חיונית לפתוגני חיידקים, ליצירת ביופילם ולעמידות לתרופות. תנועתיות חיידקים חיונית לפלישה ו/או הפצה של מינים פתוגניים רבים. לכן, חשוב לזהות תנועתיות חיידקית. תנאי גדילה חיידקיים, כגון חמצן, pH וטמפרטורה, יכולים להשפיע על גדילת חיידקים ועל ביטוי שוטונים חיידקיים. זה יכול להוביל לתנועתיות מופחתת או אפילו לאובדן תנועתיות, וכתוצאה מכך הערכה לא מדויקת של תנועתיות חיידקים. בהתבסס על תגובת הצבע של 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) על ידי dehydrogenases תוך תאי של חיידקים חיים, TTC נוסף לאגר מוצק למחצה מסורתי לזיהוי תנועתיות חיידקית. התוצאות הראו כי שיטת אגר מוצקה למחצה TTC לזיהוי תנועתיות חיידקים היא פשוטה, קלה לתפעול ואינה מערבת מכשירים גדולים ויקרים. התוצאות הראו גם כי התנועתיות הגבוהה ביותר נצפתה בתווך מוצק למחצה שהוכן עם 0.3% אגר. בהשוואה למדיום המסורתי המוצק למחצה, התוצאות קלות יותר להערכה ומדויקות יותר.
Introduction
תנועתיות חיידקים ממלאת תפקיד קריטי בפתוגניות חיידקים, בהיווצרות ביופילם ובעמידות לתרופות1. תנועתיות חיידקים קשורה קשר הדוק עם פתוגניות והיא הכרחית להתיישבות חיידקים במהלך זיהום מוקדם של תאים מארחים2. היווצרות ביופילם קשורה קשר הדוק לתנועתיות חיידקים, שבה חיידקים נצמדים לפני השטח של מדיה מוצקה באמצעות תנועתיות. תנועתיות חיידקים נחשבת מזה זמן רב לקורלציה חיובית עם היווצרות ביופילם. רמה גבוהה של עמידות חיידקית לתרופות עקב ביופילם עלולה להוביל לזיהומים מתמשכים המהווים איום על בריאות האדם 3,4,5. לכן, חשוב לזהות תנועתיות חיידקית. בדיקת תנועתיות החיידקים משמשת בעיקר לבחינת תנועתיותן של צורות שונות של חיידקים במצב החי, אשר יכול לקבוע בעקיפין את נוכחותם או היעדרם של שוטונים, ולכן יש לו תפקיד חשוב בזיהוי חיידקים.
ישנן שיטות ישירות ועקיפות לזיהוי תנועתיות חיידקית6. מכיוון שחיידקים עם שוטונים מראים תנועתיות, ניתן לזהות אם חיידקים נעים בעקיפין על ידי זיהוי נוכחות או היעדר שוטונים. לדוגמה, ניתן לזהות תנועתיות בעקיפין על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים וצביעת שוטונים כדי להצביע על כך שהחיידקים הם תנועתיים. ניתן גם לזהות בשיטות ישירות, כגון נפילת השעיה ושיטות ניקוב מוצקות למחצה.
שיטת הניקור המוצק למחצה הנפוצה במעבדות מיקרוביולוגיה לתואר ראשון לאיתור תנועתיות חיידקית מחסנת את החיידקים לנקב בתווך האגר המוצק למחצה המכיל 0.4-0.8% אגר, בהתאם לכיוון צמיחת החיידקים. אם החיידקים גדלים לאורך קו הנקב כדי להתפשט, מופיעים עקבות צמיחה דמויי ענן (דמויי מברשת), המעידים על נוכחות שוטונים, ולכן תנועתיות. אם אין עקבות צמיחה של קו ניקוב, החיידק אינו שוטון ואינו תנועתי.
עם זאת, לשיטה זו חסרונות: החיידקים חסרי צבע ושקופים, פעילות השוטון מושפעת מהמאפיינים הפיזיולוגיים של החיידקים החיים וגורמים נוספים, ומריכוז האגר וקוטרה הקטן של המבחנה. יתר על כן, חיידקים אירוביים מתאימים רק לצמיחה על פני האגר, המשפיעים על התצפית על תנועתיות החיידקים. לפיכך, כדי לשפר את הניסוי הזה, 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) (חסר צבע) נוסף למדיום כדי לבסס שיטה אמינה ואינטואיטיבית יותר לקביעת תנועתיות חיידקים מאשר שיטת ניקוב ישיר הנוכחית באמצעות dehydrogenases תוך תאיים כדי לזרז את היווצרות של מוצר אדום של TTC 7,8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדיום מוצק למחצה
- אגר מסורתי חצי מוצק
- הכינו את האגר המסורתי המוצק למחצה על פי המתכון הבינוני לבדיקת תנועתיות חיידקים תוך שימוש במרכיבים הבסיסיים11. להמיס 10 גרם טריפטוז, 15 גרם NaCl, 4 גרם אגר במים מזוקקים מספיק, להתאים את ה- pH ל 7.2 ± 0.2, ולהשלים את הנפח הסופי ל 1,000 מ"ל.
- הוציאו את האגר בטמפרטורה של 121°C למשך 20 דקות, וחלקו אותו למבחנות בנפח 10 מ"ל כמדיום מוצק למחצה בגובה 3 ס"מ.
- אגר מסורתי חצי מוצק עם TTC
- לאחר autoclaving המדיום הקונבנציונאלי מוצק למחצה, לקרר אותו ל 50 ° C, להוסיף 5 מ"ל של פתרון סטרילי 1% TTC ל 100 מ"ל של בינוני, לערבב, ולחלק אותו לתוך 10 מ"ל מבחנות הבדיקה כדי ליצור מדיום מוצק למחצה בגובה 3 ס"מ.
2. זני חיידקים
הערה: שמונים זנים בודדו מהסביבה הימית וזוהו באמצעות מכשיר זיהוי חיידקים אוטומטי (ראה טבלת חומרים), כולל Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae ו - Aeromonas hydrophila (טבלה 1). סטפילוקוקוס זהוב (Staphylococcus aureus ) (ראו טבלת חומרים) שימש כבקרה שלילית שאינה תנועתית; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, ו - Salmonella typhimurium (ראה טבלת חומרים) שימשו כזני בקרה חיוביים.
- זהה זני חיידקים לבדיקה שישמשו לניתוח תנועתיות.
- כלול בקרות שליליות שאינן נעות וזני בקרה חיוביים תנועתיים.
3. תצפית תנועתיות חיידקית משופרת TTC
- בחר מושבות בודדות של חיידקי בדיקה מצלחות אגר וחסן אותם לשני מדיה מוצקה למחצה לעיל (שלבים 1.1.2 ו 1.2.1) על ידי ניקוב באמצעות מחטים חיסון.
- תרבית את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 24-48 שעות כדי לצפות בתוצאות.
- שימו לב למצב הצמיחה: אפיין את החיידקים כחסרי תנועה (-) אם רק קו הנקב אדום. אפיין את החיידקים כתנועתיים (+) אם הצבע האדום מתפשט קלות החוצה לאורך קו הניקוב12.
4. השפעת ריכוזי אגר שונים על תנועתיות החיידקים
- הכינו מדיה מוצקה למחצה המכילה 0.3%, 0.5% ו-0.8% אגר וחסנו אותם על ידי ניקוב, כמתואר לעיל. שימו לב לתוצאות לאחר 24-48 שעות של דגירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הן זנים סטנדרטיים והן זנים מבודדים הושוו לצורך זיהוי תנועתיות, והתוצאות מוצגות בטבלה 1. בשל היעדר שוטונים, Staphylococcus aureus ו Klebsiella pneumoniae רק גדל לאורך הקו מחוסן על מדיה מסורתית TTC מוצק למחצה. לעומת זאת, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli ו-Salmonella typhimurium הראו צמיחה בכל הכיוונים סביב הקו המחוסן לאחר תרבית במשך 24 שעות על מדיום מוצק למחצה TTC. זה היה אפילו יותר ברור אחרי תרבית של 48 שעות (איור 1). למרות שהחיידקים גדלו לכל הכיוונים בתווך המוצק למחצה המסורתי, היה הרבה יותר קשה לדמיין מאשר בתווך TTC בגלל המספר הקטן של חיידקים בצד החיצוני של הקו המחוסן.
איור 1: תוצאות בדיקת תנועתיות באמצעות מדיום מוצק למחצה TTC. Staphylococcus aureus משמאל, Escherichia coli מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| זן | בינוני חצי מוצק עם 0.4% אגר | בינוני חצי מוצק עם 0.4% אגר ו-0.005% TTC | |||
| 24 שעות | 48 שעות | 24 שעות | 48 שעות | ||
| פ. ארוגינוסה ATCC27853 | + | + | + | + | |
| אי קולי ATCC25922 | + | + | + | + | |
| ס. טיפימוריום ATCC14028 | + | + | + | + | |
| ס. אוראוס ATCC25923 | - | - | - | - | |
| אי קולי (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| סלמונלה spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| א. הידרופילה (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| פ. ארוגינוסה (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| ק. דלקת ריאות (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| מספרים מציינים את מספר הזנים החיוביים (+) והכתמים השליליים (-). | |||||
טבלה 1: השוואה בין תנועתיות חיידקים.
איור 2: תצפית על פעילות תנועתיות Escherichia coli בריכוזי אגר שונים. משמאל לימין: 0.3%, 0.5%, 0.8% אגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ההשפעה של ריכוז האגר על תנועתיות החיידקים מוצגת באיור 2. מצאנו כי התנועתיות הגבוהה ביותר נצפתה בתווך מוצק למחצה שהוכן עם 0.3% אגר. הצבע הבינוני בצינור הפך כמעט כולו לאדום. לעומת זאת, שטח הדיפוזיה האדומה הצטמצם, והדיפוזיה התארכה עם עלייה בריכוז האגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי תנועתיות החיידקים בשיטת המדיום המוצק למחצה מושפע מגורמים רבים13,14. תנאי גידול חיידקים, כגון חמצן (אירובי על משטח אגר, לא אירובי בתחתית הצינור עם המדיום המוצק למחצה), pH וטמפרטורה, יכולים להשפיע על הכדאיות של שוטונים חיידקיים, מה שעלול להוביל לתנועתיות מופחתת או אפילו לאובדן תנועתיות15. בנוסף, כמה חיידקים מסוג ריר כמו תנועתיות שלהם יכול להיות מושפע על ידי ייצור של podoconjugates.
הוספת TTC למדיום המוצק למחצה מסייעת לתצפית על תנועתיות. החיידקים המתסיסים בעלי הכוח המניע יכולים לגדול לכל הכיוונים לאורך קו הנקב לאחר הדגירה. לפיכך, המדיום סביב קו הניקוב הופך לאדום. חיידקים לא מותססים עם כוח מניע יש תוכן חמצן נמוך בחלק התחתון של המדיום. לפיכך, חיידקים אלה גדלים גרוע, כך שרק השכבה העליונה של המדיום היא אדומה. חיידקים ללא כוח מניע יכולים לגדול רק על קו החיסון, ורק קו הנקב נראה אדום.
כאשר מזהים תנועתיות חיידקית עם תווך מוצק למחצה TTC, ככל שזמן התרבית ארוך יותר, כך התוצאות ברורות יותר, במיוחד עם ריכוזי אגר נמוכים יותר. אם התוצאה קשה לפרשנות, יש להאריך את זמן התרבות כראוי. זה עשוי להיות קשור לריכוז האגר של התווך המוצק למחצה, מספר החיידקים, והתנועתיות שלהם16. בנוסף, שיטה זו גילתה כי זנים מסוימים של E. coli ו - P. aeruginosa לא יכלו לגדול סביב על מדיום אגר מוצק למחצה קונבנציונאלי והראו רק צבע אדום קלוש על פני השטח של התווך על מדיום אגר מוצק למחצה TTC. זה יכול להיות בגלל ייצור של כמוסות על ידי זנים כאלה, אשר משפיע על תנועתיות שלהם17. תופעה זו מתרחשת גם Neisseria meningitidis18 בגלל הקפסולה שלה. לסיכום, זיהוי תנועתיות חיידקים באמצעות תווך כרומוגני מוצק למחצה המכיל TTC מפחית את השפעת הגורמים החיידקיים על תוצאות הבדיקה ומקל על הצפייה בתוצאות בעין בלתי. היתרון של שיעור זיהוי גבוה הופך את השיטה הזו ליעילה שיכולה להחליף את המדיום החצי-מוצק המסורתי לזיהוי תנועתיות חיידקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי פיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (PAPD) ופרויקט המחקר של רפורמת ההוראה של אוניברסיטת התרופות של סין (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D.
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W.
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
