Summary
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la motilità batterica basata su una reazione di colore. I principali vantaggi di questo metodo sono che è facile da valutare e più accurato e non richiede attrezzature specializzate.
Abstract
La motilità batterica è cruciale per la patogenicità batterica, la formazione di biofilm e la resistenza ai farmaci. La motilità batterica è cruciale per l'invasione e/o la diffusione di molte specie patogene. Pertanto, è importante rilevare la motilità batterica. Le condizioni di crescita batterica, come ossigeno, pH e temperatura, possono influenzare la crescita batterica e l'espressione dei flagelli batterici. Ciò può portare a una ridotta motilità o addirittura alla perdita di motilità, con conseguente valutazione imprecisa della motilità batterica. Sulla base della reazione cromatica del cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) da parte delle deidrogenasi intracellulari di batteri viventi, il TTC è stato aggiunto all'agar semisolido tradizionale per il rilevamento della motilità batterica. I risultati hanno mostrato che questo metodo di agar semisolido TTC per la rilevazione della motilità batterica è semplice, facile da usare e non coinvolge strumenti grandi e costosi. I risultati hanno anche mostrato che la motilità più alta è stata osservata nel mezzo semisolido preparato con agar allo 0,3%. Rispetto al tradizionale mezzo semisolido, i risultati sono più facili da valutare e più accurati.
Introduction
La motilità batterica svolge un ruolo critico nella patogenicità batterica, nella formazione di biofilm e nella resistenza ai farmaci1. La motilità batterica è strettamente associata alla patogenicità ed è necessaria per la colonizzazione batterica durante l'infezione precoce delle cellule ospiti2. La formazione di biofilm è strettamente correlata alla motilità batterica, in cui i batteri aderiscono alla superficie dei mezzi solidi attraverso la motilità. La motilità batterica è stata a lungo considerata positivamente correlata con la formazione di biofilm. Un alto grado di resistenza batterica ai farmaci dovuto al biofilm può portare a infezioni persistenti che rappresentano una minaccia per la salute umana 3,4,5. Pertanto, è importante rilevare la motilità batterica. Il test di motilità batterica viene utilizzato principalmente per esaminare la motilità di diverse forme di batteri allo stato vivente, che possono determinare indirettamente la presenza o l'assenza di flagelli e, quindi, ha un ruolo importante nell'identificazione dei batteri.
Esistono metodi diretti e indiretti per rilevare la motilità batterica6. Poiché i batteri con flagelli mostrano motilità, è possibile rilevare se i batteri sono mobili indirettamente rilevando la presenza o l'assenza di flagelli. Ad esempio, è possibile rilevare la motilità indirettamente mediante microscopia elettronica e colorazione flagellare per indicare che i batteri sono mobili. È anche possibile rilevare con metodi diretti, come la caduta della sospensione e i metodi di puntura semisolida.
Il metodo di puntura semisolida comunemente usato nei laboratori universitari di microbiologia per rilevare la motilità batterica inocula i batteri nella puntura nel mezzo di agar semisolido contenente 0,4-0,8% di agar, secondo la direzione della crescita batterica. Se i batteri crescono lungo la linea di puntura per diffondersi, appaiono tracce di crescita simili a nuvole (simili a pennelli), che indicano la presenza di flagelli e, quindi, di motilità. Se non ci sono tracce di crescita della linea di puntura, il batterio non è né flagellato né mobile.
Tuttavia, questo metodo ha i suoi svantaggi: i batteri sono incolori e trasparenti, l'attività flagellare è influenzata dalle caratteristiche fisiologiche dei batteri viventi e da altri fattori, dalla concentrazione di agar e dal piccolo diametro della provetta. Inoltre, i batteri aerobici sono adatti solo per la crescita sulla superficie dell'agar, influenzando l'osservazione della motilità batterica. Quindi, per migliorare questo esperimento, il cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (incolore) è stato aggiunto al mezzo per stabilire un metodo più affidabile e intuitivo per determinare la motilità batterica rispetto all'attuale metodo di puntura diretta che utilizza deidrogenasi intracellulari per catalizzare la formazione di un prodotto rosso di TTC 7,8,9,10.
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Protocol
1. Preparazione del mezzo semisolido
- Agar semisolido tradizionale
- Preparare l'agar semisolido tradizionale secondo la ricetta del mezzo di prova della motilità batterica utilizzando gli ingredienti di base11. Sciogliere 10 g di triptosio, 15 g di NaCl, 4 g di agar in acqua distillata a sufficienza, regolare il pH a 7,2 ± 0,2 e portare il volume finale a 1.000 ml.
- Autoclavare l'agar a 121 °C per 20 minuti ed erogarlo in provette da 10 mL come mezzo semisolido alto 3 cm.
- Agar semisolido tradizionale con TTC
- Dopo aver sterilizzato in autoclave il mezzo semisolido convenzionale, raffreddarlo a 50 °C, aggiungere 5 ml di soluzione sterile di TTC all'1% a 100 ml di terreno, mescolare ed erogarlo in provette da 10 ml per formare un mezzo semisolido alto 3 cm.
2. Ceppi batterici
NOTA: Ottanta ceppi sono stati isolati dall'ambiente acquatico e identificati utilizzando uno strumento automatizzato di identificazione dei batteri (vedere la tabella dei materiali), tra cui Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae e Aeromonas hydrophila (Tabella 1). Lo Staphylococcus aureus (vedi la tabella dei materiali) è stato usato come controllo non mobile negativo; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium (vedere la tabella dei materiali) sono stati utilizzati come ceppi di controllo positivo.
- Identificare i ceppi batterici da utilizzare per l'analisi della motilità.
- Includere controlli non mobili negativi e ceppi di controllo positivi mobili.
3. Osservazione della motilità batterica potenziata da TTC
- Prelevare singole colonie di batteri in esame dalle piastre di agar e inocularle nei due mezzi semisolidi di cui sopra (fasi 1.1.2 e 1.2.1) mediante puntura con aghi inoculanti.
- Coltivare i tubi a 37 °C nell'incubatore per 24-48 ore per osservare i risultati.
- Osservare lo stato di crescita: caratterizzare i batteri come non mobili (-) se solo la linea di puntura è rossa. Caratterizzare i batteri come mobili (+) se il colore rosso si diffonde leggermente verso l'esterno lungo la linea di puntura12.
4. Effetto di diverse concentrazioni di agar sulla motilità batterica
- Preparare mezzi semisolidi contenenti 0,3%, 0,5% e 0,8% di agar e inocularli mediante foratura, come descritto sopra. Osservare i risultati dopo 24-48 ore di incubazione.
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Representative Results
Sia i ceppi standard che i ceppi isolati sono stati confrontati per il rilevamento della motilità e i risultati sono mostrati nella Tabella 1. A causa dell'assenza di flagelli, Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae sono cresciuti solo lungo la linea inoculata su terreni semisolidi tradizionali e TTC. Al contrario, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella typhimurium hanno mostrato una crescita in tutte le direzioni attorno alla linea inoculata dopo la coltura per 24 ore su terreno semisolido TTC. Questo era ancora più evidente dopo 48 ore di cultura (Figura 1). Sebbene i batteri crescessero in tutte le direzioni nel tradizionale mezzo semisolido, era molto più difficile da visualizzare rispetto al mezzo TTC a causa del piccolo numero di batteri sul lato esterno della linea inoculata.
Figura 1: Risultati del test di motilità utilizzando il mezzo semisolido TTC. Staphylococcus aureus a sinistra, Escherichia coli a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Sforzo | Mezzo semisolido con agar allo 0,4% | Mezzo semisolido con 0,4% di agar e 0,005% di TTC | |||
| 24 ore su 24 | 48 ore | 24 ore su 24 | 48 ore | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| Coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium ATCC14028 | + | + | + | + | |
| S. aureus ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hydrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| I numeri indicano il numero di ceppi positivi (+) e negativi (-). | |||||
Tabella 1: Confronto della motilità batterica.
Figura 2: Osservazione dell'attività di motilità di Escherichia coli a diverse concentrazioni di agar. Da sinistra a destra: 0,3%, 0,5%, 0,8% agar. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L'influenza della concentrazione di agar sulla motilità batterica è mostrata nella Figura 2. Abbiamo scoperto che la motilità più alta è stata osservata nel mezzo semisolido preparato con agar allo 0,3%. Il colore medio nel tubo è diventato quasi interamente rosso. Al contrario, l'area di diffusione rossa è diminuita e la diffusione è stata prolungata con l'aumentare della concentrazione di agar.
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Discussion
La rilevazione della motilità batterica con il metodo del mezzo semisolido è influenzata da molti fattori13,14. Le condizioni di crescita batterica, come l'ossigeno (aerobico sulla superficie dell'agar, non aerobico sul fondo del tubo con il mezzo semisolido), il pH e la temperatura, possono influenzare la vitalità dei flagelli batterici, che possono portare a una ridotta motilità o addirittura alla perdita di motilità15. Inoltre, alcuni batteri di tipo muco come la loro motilità possono essere influenzati dalla produzione di podoconiugati.
L'aggiunta di TTC al mezzo semisolido aiuta l'osservazione della motilità. I batteri fermentativi con forza motrice possono crescere in tutte le direzioni lungo la linea di puntura dopo l'incubazione. Quindi, il mezzo attorno alla linea di puntura diventa rosso. I batteri non fermentativi con forza motrice hanno un basso contenuto di ossigeno nella parte inferiore del mezzo. Quindi, questi batteri crescono male, in modo che solo lo strato superiore del mezzo sia rosso. I batteri senza forza motrice possono crescere solo sulla linea di inoculazione e solo la linea di puntura appare rossa.
Quando si rileva la motilità batterica con terreno semisolido TTC, più lungo è il tempo di coltura, più evidenti sono i risultati, specialmente con concentrazioni di agar più basse. Se il risultato è difficile da interpretare, il tempo di coltura dovrebbe essere esteso in modo appropriato. Questo può essere correlato alla concentrazione di agar del mezzo semisolido, al numero di batteri e alla loro motilità16. Inoltre, questo metodo ha rivelato che alcuni ceppi di E. coli e P. aeruginosa non potevano crescere su terreno di agar semisolido convenzionale e mostravano solo un debole colore rosso sulla superficie del terreno su terreno di agar semisolido TTC. Ciò può essere dovuto alla produzione di capsule da parte di tali ceppi, che influisce sulla loro motilità17. Questo fenomeno si verifica anche in Neisseria meningitidis18 a causa della sua capsula. In conclusione, la rilevazione della motilità batterica utilizzando un mezzo semisolido cromogenico contenente TTC riduce l'influenza dei fattori batterici sui risultati del test e rende i risultati più facili da osservare ad occhio nudo. Il vantaggio di un alto tasso di rilevamento rende questo un metodo efficace che può sostituire il tradizionale mezzo semisolido per rilevare la motilità batterica.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) e dal Teaching Reform Research Project della China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
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