Summary
Здесь мы представляем протокол для обнаружения бактериальной подвижности, основанный на цветовой реакции. Ключевые преимущества этого метода заключаются в том, что он прост в оценке и более точен, и не требует специализированного оборудования.
Abstract
Подвижность бактерий имеет решающее значение для патогенности бактерий, образования биопленки и лекарственной устойчивости. Подвижность бактерий имеет решающее значение для инвазии и/или распространения многих патогенных видов. Поэтому важно выявлять бактериальную подвижность. Условия роста бактерий, такие как кислород, рН и температура, могут влиять на рост бактерий и экспрессию бактериальных жгутиков. Это может привести к снижению подвижности или даже потере подвижности, что приводит к неточной оценке подвижности бактерий. Основываясь на цветовой реакции 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТС) внутриклеточными дегидрогеназами живых бактерий, ТТС добавляли к традиционному полутвердому агару для определения подвижности бактерий. Результаты показали, что этот метод обнаружения подвижности бактерий с полутвердым агаром TTC прост, удобен в эксплуатации и не требует больших и дорогостоящих инструментов. Результаты также показали, что наибольшая подвижность наблюдалась в полутвердой среде, приготовленной с 0,3% агара. По сравнению с традиционной полутвердой средой результаты легче оценить и они более точны.
Introduction
Подвижность бактерий играет решающую роль в патогенности бактерий, образовании биопленки и лекарственной устойчивости1. Бактериальная подвижность тесно связана с патогенностью и необходима для колонизации бактерий во время раннего инфицирования клеток-хозяев2. Образование биопленки тесно связано с подвижностью бактерий, когда бактерии прилипают к поверхности твердой среды за счет подвижности. Долгое время считалось, что подвижность бактерий положительно коррелирует с образованием биопленки. Высокая степень бактериальной лекарственной устойчивости из-за биопленки может привести к персистирующим инфекциям, представляющим угрозу для здоровья человека 3,4,5. Поэтому важно выявлять бактериальную подвижность. Тест на подвижность бактерий в основном используется для изучения подвижности различных форм бактерий в живом состоянии, которые могут косвенно определять наличие или отсутствие жгутиков и, таким образом, играют важную роль в идентификации бактерий.
Различают прямые и непрямые методы выявления бактериальной подвижности6. Поскольку бактерии со жгутиками проявляют подвижность, можно определить, являются ли бактерии подвижными косвенно, обнаружив наличие или отсутствие жгутиков. Например, можно косвенно обнаружить подвижность с помощью электронной микроскопии и окрашивания жгутиков, чтобы указать, что бактерии подвижны. Также возможно обнаружение прямыми методами, такими как капля суспензии и полутвердая пункция.
Метод полутвердой пункции, обычно используемый в микробиологических лабораториях бакалавриата для обнаружения подвижности бактерий, инокулирует бактерии в прокол в полутвердой агаровой среде, содержащей 0,4-0,8% агара, в зависимости от направления роста бактерий. Если бактерии растут вдоль линии прокола, чтобы распространиться вокруг, появляются облачные (кистевидные) следы роста, указывающие на наличие жгутиков и, следовательно, подвижность. Если нет следов роста на линии прокола, бактерия не является ни жгутиковой, ни подвижной.
Однако у этого метода есть свои недостатки: бактерии бесцветны и прозрачны, на жгутиковую активность влияют физиологические особенности живых бактерий и другие факторы, а также концентрация агара и малый диаметр пробирки. Более того, аэробные бактерии пригодны только для роста на поверхности агара, влияя на наблюдение за подвижностью бактерий. Следовательно, для улучшения этого эксперимента в среду был добавлен 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (TTC) (бесцветный), чтобы установить более надежный и интуитивно понятный метод определения подвижности бактерий, чем текущий метод прямой пункции с использованием внутриклеточных дегидрогеназ для катализа образования красного продукта TTC 7,8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление полутвердой среды
- Традиционный полутвердый агар
- Приготовьте традиционный полутвердый агар в соответствии с рецептурой среды для тестирования на подвижность бактерий, используя основные ингредиенты11. Растворите 10 г триптозы, 15 г NaCl, 4 г агара в достаточном количестве дистиллированной воды, отрегулируйте рН до 7,2 ± 0,2 и доведите конечный объем до 1000 мл.
- Автоклавируйте агар при 121 ° C в течение 20 минут и распределите его в пробирки по 10 мл в виде полутвердой среды высотой 3 см.
- Традиционный полутвердый агар с ТТС
- После автоклавирования обычной полутвердой среды охладите ее до 50 °C, добавьте 5 мл стерильного 1% раствора TTC к 100 мл среды, перемешайте и распределите ее в пробирки по 10 мл с образованием полутвердой среды высотой 3 см.
2. Бактериальные штаммы
ПРИМЕЧАНИЕ: Восемьдесят штаммов были выделены из водной среды и идентифицированы с помощью автоматизированного инструмента идентификации бактерий (см. Таблицу материалов), включая Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae и Aeromonas hydrophila (таблица 1). Золотистый стафилококк (см. Таблицу материалов) использовался в качестве отрицательного неподвижного контроля; В качестве положительных контрольных штаммов использовали Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella typhimurium (см. Таблицу материалов).
- Определите тестовые штаммы бактерий, которые будут использоваться для анализа подвижности.
- Включите отрицательные неподвижные контрольные и подвижные положительные контрольные штаммы.
3. Наблюдение за подвижностью бактерий с усилением TTC
- Отбирают отдельные колонии исследуемых бактерий из агаровых пластин и инокулируют их в две вышеуказанные полутвердые среды (этапы 1.1.2 и 1.2.1) путем прокола с помощью инокуляционных игл.
- Культивируют пробирки при 37 °C в инкубаторе в течение 24-48 ч, чтобы наблюдать за результатами.
- Наблюдайте за состоянием роста: характеризуйте бактерии как неподвижные (-), если только линия прокола красная. Охарактеризуйте бактерии как подвижные (+), если красный цвет слегка распространяется наружу вдоль линиипрокола 12.
4. Влияние различных концентраций агара на подвижность бактерий
- Готовят полутвердые среды, содержащие 0,3%, 0,5% и 0,8% агара, и инокулируют их путем пункции, как описано выше. Наблюдайте за результатами через 24-48 ч инкубации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как стандартные, так и изолированные штаммы сравнивали для определения подвижности, и результаты приведены в таблице 1. Из-за отсутствия жгутиков Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae росли только вдоль инокулированной линии как на традиционных, так и на полутвердых средах TTC. Напротив, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Salmonella typhimurium показали рост во всех направлениях вокруг инокулированной линии после культивирования в течение 24 ч на полутвердой среде TTC. Это было еще более очевидно после 48-часовой культуры (рис. 1). Хотя бактерии росли во всех направлениях в традиционной полутвердой среде, это было гораздо труднее визуализировать, чем в среде TTC, из-за небольшого количества бактерий на внешней стороне инокулированной линии.
Рисунок 1: Результаты теста на подвижность с использованием полутвердой среды TTC. Золотистый стафилококк слева, кишечная палочка справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Напряжение | Полутвердая среда с 0,4% агаром | Полутвердая среда с 0,4% агара и 0,005% TTC | |||
| 24 ч | 48 ч | 24 ч | 48 ч | ||
| P. aeruginosa АТСС27853 | + | + | + | + | |
| Кишечная палочка АТСС25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium АТСС14028 | + | + | + | + | |
| Золотистый стафилококк (S. aureus) АТСС25923 | - | - | - | - | |
| Кишечная палочка (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hydrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| К. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Цифры обозначают количество положительных штаммов (+) и отрицательных пятен (-). | |||||
Таблица 1: Сравнение подвижности бактерий.
Рисунок 2: Наблюдение активности подвижности Escherichia coli при различных концентрациях агара. Слева направо: 0,3%, 0,5%, 0,8% агара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Влияние концентрации агара на подвижность бактерий показано на рисунке 2. Мы обнаружили, что наибольшая подвижность наблюдалась в полутвердой среде, приготовленной с 0,3% агаром. Средний цвет в трубке стал почти полностью красным. Напротив, площадь красной диффузии уменьшалась, и диффузия увеличивалась с увеличением концентрации агара.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На выявление подвижности бактерий методом полутвердой среды влияет множество факторов13,14. Условия роста бактерий, такие как кислород (аэробный на поверхности агара, неаэробный на дне пробирки с полутвердой средой), рН и температура, могут влиять на жизнеспособность бактериальных жгутиков, что может привести к снижению подвижности или даже потере подвижности15. Кроме того, на некоторые бактерии слизистого типа по мере их подвижности может влиять выработка подоконъюгатов.
Добавление TTC к полутвердой среде помогает наблюдению за подвижностью. Ферментативные бактерии, обладающие движущей силой, могут расти во всех направлениях вдоль линии пункции после инкубации. Следовательно, среда вокруг линии прокола становится красной. Неферментативные бактерии, обладающие движущей силой, имеют низкое содержание кислорода в нижней части среды. Следовательно, эти бактерии плохо растут, так что только верхний слой среды красный. Бактерии, не имеющие движущей силы, могут расти только на линии инокуляции, и только линия прокола кажется красной.
При обнаружении подвижности бактерий с ТТС-полутвердой средой, чем дольше время культивирования, тем более очевидны результаты, особенно при более низких концентрациях агара. Если результат трудно интерпретировать, время культивирования следует соответствующим образом продлить. Это может быть связано с концентрацией агара в полутвердой среде, количеством бактерий и их подвижностью16. Кроме того, этот метод показал, что некоторые штаммы E. coli и P. aeruginosa не могли расти на обычной полутвердой агаровой среде и показали только слабый красный цвет на поверхности среды на полутвердой агаровой среде TTC. Это может быть связано с выработкой капсул такими штаммами, что влияет на их подвижность17. Это явление также встречается у Neisseria meningitidis18 из-за его капсулы. В заключение следует отметить, что обнаружение подвижности бактерий с помощью хромогенной полутвердой среды, содержащей ТТС, снижает влияние бактериальных факторов на результаты испытаний и облегчает наблюдение результатов невооруженным глазом. Преимущество высокой скорости обнаружения делает этот метод эффективным, который может заменить традиционную полутвердую среду для обнаружения подвижности бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD) и Исследовательским проектом по реформе преподавания Китайского фармацевтического университета (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D.
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W.
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
