Summary
Burada, bir renk reaksiyonuna dayalı bakteriyel motiliteyi tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemin temel avantajları, değerlendirilmesi kolay ve daha doğru olması ve özel ekipman gerektirmemesidir.
Abstract
Bakteriyel motilite, bakteriyel patojenite, biyofilm oluşumu ve ilaç direnci için çok önemlidir. Bakteriyel motilite, birçok patojenik türün istilası ve / veya yayılması için çok önemlidir. Bu nedenle, bakteriyel motiliteyi tespit etmek önemlidir. Oksijen, pH ve sıcaklık gibi bakteriyel büyüme koşulları, bakteriyel büyümeyi ve bakteriyel flagella ekspresyonunu etkileyebilir. Bu, hareketliliğin azalmasına ve hatta motilitenin kaybına neden olabilir, bu da bakteriyel motilitenin yanlış değerlendirilmesine neden olabilir. Canlı bakterilerin hücre içi dehidrojenazları ile 2,3,5-trifenil tetrazolyum klorürün (TTC) renk reaksiyonuna dayanarak, TTC, bakteriyel motilitenin tespiti için geleneksel yarı katı agar'a eklenmiştir. Sonuçlar, bakteriyel hareketliliğin tespiti için bu TTC yarı katı agar yönteminin basit, kullanımı kolay ve büyük ve pahalı aletler içermediğini göstermiştir. Sonuçlar ayrıca en yüksek hareketliliğin% 0.3 agar ile hazırlanan yarı katı ortamda gözlendiğini göstermiştir. Geleneksel yarı katı ortam ile karşılaştırıldığında, sonuçların değerlendirilmesi daha kolay ve daha doğrudur.
Introduction
Bakteriyel motilite, bakteriyel patojenite, biyofilm oluşumu ve ilaç direncinde kritik bir rol oynar1. Bakteriyel motilite, patojenite ile yakından ilişkilidir ve konakçı hücrelerin erken enfeksiyonu sırasında bakteriyel kolonizasyon için gereklidir2. Biyofilm oluşumu, bakterilerin katı ortamın yüzeyine motiliteyle yapıştığı bakteriyel motiliteyle yakından ilişkilidir. Bakteriyel motilitenin uzun zamandır biyofilm oluşumu ile pozitif ilişkili olduğu düşünülmektedir. Biyofilme bağlı yüksek derecede bakteriyel ilaç direnci, insan sağlığı için tehdit oluşturan kalıcı enfeksiyonlara yol açabilir 3,4,5. Bu nedenle, bakteriyel motiliteyi tespit etmek önemlidir. Bakteriyel motilite, esas olarak, canlı haldeki farklı bakteri formlarının hareketliliğini incelemek için kullanılır, bu da dolaylı olarak flagella'nın varlığını veya yokluğunu belirleyebilir ve bu nedenle bakterilerin tanımlanmasında önemli bir role sahiptir.
Bakteriyel motiliteyi tespit etmek için doğrudan ve dolaylı yöntemler vardır6. Flagellalı bakteriler motiliteyi gösterdiğinden, flagella'nın varlığını veya yokluğunu tespit ederek bakterilerin dolaylı olarak hareketli olup olmadığını tespit etmek mümkündür. Örneğin, bakterilerin hareketli olduğunu göstermek için elektron mikroskobu ve flagellar boyama ile hareketliliği dolaylı olarak tespit etmek mümkündür. Süspansiyon düşürme ve yarı katı delinme yöntemleri gibi doğrudan yöntemlerle tespit etmek de mümkündür.
Lisans mikrobiyoloji laboratuvarlarında bakteriyel motiliteyi tespit etmek için yaygın olarak kullanılan yarı katı delinme yöntemi, bakterilerin üreme yönüne göre, bakterileri% 0.4-0.8 agar içeren yarı katı agar ortamındaki delinmeye aşılar. Bakteriler etrafa yayılmak için delinme çizgisi boyunca büyürse, flagella'nın varlığını ve dolayısıyla hareketliliği gösteren bulut benzeri (fırça benzeri) büyüme izleri ortaya çıkar. Delinme çizgisi büyüme izleri yoksa, bakteri ne kamçılanır ne de hareketlidir.
Bununla birlikte, bu yöntemin dezavantajları vardır: bakteriler renksiz ve şeffaftır, kamçı aktivitesi canlı bakterilerin fizyolojik özelliklerinden ve diğer faktörlerden ve agar konsantrasyonundan ve test tüpünün küçük çapından etkilenir. Dahası, aerobik bakteriler sadece agar yüzeyinde büyüme için uygundur ve bakteriyel hareketliliğin gözlemlenmesini etkiler. Bu nedenle, bu deneyi geliştirmek için, TTC7,8,9,10'un kırmızı bir ürününün oluşumunu katalize etmek için hücre içi dehidrojenazlar kullanan mevcut doğrudan delinme yönteminden daha güvenilir ve sezgisel bir bakteri hareketliliğini belirlemek için ortama 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) (renksiz) eklenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yarı katı ortamın hazırlanması
- Geleneksel yarı katı agar
- Geleneksel yarı katı agarı, temel bileşenleri kullanarak bakteriyel motilite, test ortamı tarifine göre hazırlayın11. 10 g Triptoz, 15 g NaCl, 4 g agar'ı yeterince damıtılmış suda çözün, pH'ı 7.2 ± 0.2'ye ayarlayın ve nihai hacmi 1.000 mL'ye ayarlayın.
- Agar'ı 121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın ve 3 cm yüksekliğinde yarı katı bir ortam olarak 10 mL test tüplerine dağıtın.
- TTC'li geleneksel yarı katı agar
- Geleneksel yarı katı ortamı otoklavladıktan sonra, 50 ° C'ye soğutun, 100 mL ortama 5 mL steril% 1 TTC çözeltisi ekleyin, karıştırın ve 3 cm yüksekliğinde bir yarı katı ortam oluşturmak için 10 mL test tüplerine dağıtın.
2. Bakteri suşları
NOT: Seksen suş su ortamından izole edilmiş ve Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae ve Aeromonas hydrophila dahil olmak üzere otomatik bir bakteri tanımlama cihazı (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak tanımlanmıştır (Tablo 1). Staphylococcus aureus (Malzeme Tablosuna bakınız) negatif hareketsiz bir kontrol olarak kullanılmıştır; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ve Salmonella typhimurium (Malzeme Tablosuna bakınız) pozitif kontrol suşları olarak kullanılmıştır.
- Motilitenin analizi için kullanılacak test bakteri suşlarını tanımlayın.
- Negatif hareketsiz kontrolleri ve hareketli pozitif kontrol suşlarını dahil edin.
3. TTC ile güçlendirilmiş bakteriyel motilitenin gözlemlenmesi
- Agar plakalarından tek test bakteri kolonilerini seçin ve aşılama iğneleri kullanarak delinerek yukarıdaki iki yarı katı ortama (adım 1.1.2 ve 1.2.1) aşılayın.
- Sonuçları gözlemlemek için tüpleri inkübatörde 37 ° C'de 24-48 saat boyunca kültürleyin.
- Büyüme durumunu gözlemleyin: sadece delinme çizgisi kırmızıysa, bakterileri hareketsiz (-) olarak karakterize edin. Kırmızı renk delinme çizgisi12 boyunca hafifçe dışa doğru yayılırsa, bakterileri hareketli (+) olarak karakterize edin.
4. Farklı agar konsantrasyonlarının bakteriyel motiliteye etkisi
- % 0.3,% 0.5 ve% 0.8 agar içeren yarı katı ortamlar hazırlayın ve yukarıda açıklandığı gibi delinerek aşılayın. 24-48 saatlik inkübasyondan sonra sonuçları gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Motilitenin tespiti için hem standart suşlar hem de izole suşlar karşılaştırılmış ve sonuçlar Tablo 1'de gösterilmiştir. Flagella'nın yokluğu nedeniyle, Staphylococcus aureus ve Klebsiella pneumoniae , hem geleneksel hem de TTC yarı katı ortamlarda aşılanmış çizgi boyunca büyüdü. Buna karşılık, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli ve Salmonella typhimurium , TTC yarı katı ortamda 24 saat boyunca kültürlendikten sonra aşılanmış çizginin etrafında her yönde büyüme gösterdi. Bu, 48 saatlik kültürden sonra daha da belirgindi (Şekil 1). Bakteriler geleneksel yarı katı ortamda her yönde büyümüş olsalar da, aşılanmış çizginin dış tarafındaki az sayıda bakteri nedeniyle görselleştirmek TTC ortamından çok daha zordu.
Şekil 1: TTC yarı katı ortam kullanılarak yapılan motilite testi sonuçları. Solda Staphylococcus aureus, sağda Escherichia coli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Soy | % 0.4 agar ile yarı katı ortam | % 0.4 agar ve% 0.005 TTC ile yarı katı ortam | |||
| 24 saat | 48 saat | 24 saat | 48 saat | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| E. coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium ATCC14028 | + | + | + | + | |
| S. aureus · ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hidrofila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio sayfa (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Sayılar, pozitif suşların (+) ve negatif lekelerin (-) sayılarını gösterir. | |||||
Tablo 1: Bakteriyel motilitenin karşılaştırılması.
Şekil 2: Farklı agar konsantrasyonlarında Escherichia coli motilitesinin gözlenmesi. Soldan sağa: %0,3, %0,5, %0,8 agar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Agar konsantrasyonunun bakteriyel motiliteye etkisi Şekil 2'de gösterilmiştir. En yüksek motilitenin %0.3 agar ile hazırlanan yarı katı ortamda gözlendiğini bulduk. Tüpteki orta renk neredeyse tamamen kırmızıya döndü. Buna karşılık, kırmızı difüzyon alanı azaldı ve difüzyon artan agar konsantrasyonu ile uzadı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriyel motilitenin semisolid medium yöntemi ile saptanması birçok faktörden etkilenmektedir13,14. Oksijen (agar yüzeyinde aerobik, yarı katı ortam ile tüpün dibinde aerobik olmayan), pH ve sıcaklık gibi bakteriyel büyüme koşulları, bakteriyel flagella'nın canlılığını etkileyebilir, bu da hareketliliğin azalmasına ve hatta hareketlilik kaybına neden olabilir15. Ek olarak, hareketlilikleri olarak bazı mukus tipi bakteriler, podokonjugatların üretiminden etkilenebilir.
TTC'nin yarı katı ortama eklenmesi, hareketliliğin gözlemlenmesine yardımcı olur. Yönlendirici güce sahip fermentatif bakteriler, inkübasyondan sonra delinme çizgisi boyunca her yönde büyüyebilir. Bu nedenle, delinme çizgisinin etrafındaki ortam kırmızı olur. Yönlendirici güce sahip fermentatif olmayan bakteriler, ortamın alt kısmında düşük oksijen içeriğine sahiptir. Bu nedenle, bu bakteriler zayıf büyür, böylece ortamın sadece üst tabakası kırmızıdır. İtici gücü olmayan bakteriler sadece aşılama hattında büyüyebilir ve sadece delinme çizgisi kırmızı görünür.
TTC-yarı katı ortam ile bakteriyel motiliteyi tespit ederken, kültür süresi ne kadar uzun olursa, özellikle düşük agar konsantrasyonlarında sonuçlar o kadar belirgin olur. Sonucun yorumlanması zorsa, kültür süresi uygun şekilde uzatılmalıdır. Bu, yarı katı ortamın agar konsantrasyonu, bakteri sayısı ve hareketlilikleri16 ile ilgili olabilir. Ek olarak, bu yöntem, E. coli ve P. aeruginosa'nın bazı suşlarının geleneksel yarı katı agar ortamında büyüyemediğini ve TTC yarı katı agar ortamında ortamın yüzeyinde sadece soluk kırmızı bir renk gösterdiğini ortaya koymuştur. Bu, bu tür suşlar tarafından kapsüllerin üretilmesinden kaynaklanabilir ve bu da hareketliliklerini etkiler17. Bu fenomen ayrıca kapsülü nedeniyle Neisseria meningitidis18'de de görülür. Sonuç olarak, TTC içeren kromojenik bir yarı katı ortam kullanılarak bakteriyel motilitenin tespiti, bakteriyel faktörlerin test sonuçları üzerindeki etkisini azaltır ve sonuçların çıplak gözle gözlemlenmesini kolaylaştırır. Yüksek algılama oranının avantajı, bunu bakteriyel hareketliliği tespit etmek için geleneksel yarı katı ortamın yerini alabilecek etkili bir yöntem haline getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) ve Çin İlaç Üniversitesi Öğretim Reformu Araştırma Projesi (2019XJYB18) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D.
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W.
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
