Summary
Hier wordt een beschrijving gegeven van de eenvoudige en relatief snelle isolatie van Caenorhabditis elegans genomisch DNA van een of enkele dieren met behulp van een in de handel verkrijgbare weefselkit. Het resulterende gDNA-preparaat is een geschikt sjabloon voor PCR.
Abstract
Genomische DNA-extractie uit enkele of enkele Caenorhabditis elegans heeft veel downstream-toepassingen, waaronder PCR voor genotyperingslijnen, klonen en sequencing. De traditionele proteïnase K-gebaseerde methoden voor genomische DNA-extractie uit C. elegans duren enkele uren. Commerciële extractiekits die de C. elegans-cuticula effectief openbreken en genomisch DNA extraheren, zijn beperkt. Een eenvoudige, snellere (~ 15 min) en kostenefficiënte methode voor het extraheren van C. elegans genomisch DNA dat goed werkt voor klaslokalen en onderzoekstoepassingen wordt hier gerapporteerd. Deze DNA-extractiemethode is geoptimaliseerd om enkele of enkele laatlarven (L4) of volwassen nematoden te gebruiken als uitgangsmateriaal voor het verkrijgen van een betrouwbare sjabloon om PCR uit te voeren. De resultaten geven aan dat de DNA-kwaliteit geschikt is voor het versterken van gendoelen van verschillende grootte door PCR, waardoor genotypering van enkele of enkele dieren mogelijk is, zelfs bij verdunningen tot een vijftigste van het genomische DNA van een enkele volwassene per reactie. De gerapporteerde protocollen kunnen betrouwbaar worden gebruikt om snel DNA-sjablonen te produceren uit een enkele of een kleine steekproef van C. elegans voor PCR-gebaseerde toepassingen.
Introduction
Hier worden twee gerelateerde protocollen gepresenteerd voor de lysis van Caenorhabditis elegans om DNA toegankelijk te maken voor PCR-gebaseerde toepassingen. PCR is een veelgebruikte moleculaire techniek die voor veel toepassingen wordt gebruikt, waaronder genotypering en het versterken van DNA-fragmenten voor onder andere klonen en sequencing. De kleine (1 mm), vrijlevende rondworm C. elegans is een populair diersysteem voor biologisch onderzoek. Het verkrijgen van geschikt genomisch DNA van een enkel dier of een paar dieren is voldoende om de sequentie door PCR te versterken. Late L4-larven en volwassenen bevatten slechts ~ 1.000 somatische cellen (waaronder sommige multinucleaire, polyploïde cellen), geslachtscellen en (als het dier een gravid hermafrodiet is) nakomelingen in utero1. Deze dieren worden echter beschermd door een cuticula die moet worden verstoord om het genomische DNA2 te extraheren. Standaardmethoden om nematode genomische DNA-sjabloon voor PCR voor te bereiden, omvatten meerdere stappen en duren enkele uren. De dieren worden eerst ingevroren in een wormlysisbuffer met proteïnase K (−70 °C of lager) gedurende ten minste 15-45 minuten (langer wordt aanbevolen door sommige protocollen)3,4,5,6. Deze stap breekt de dieren open.
Na bevriezing worden de dieren gedurende 1 uur bij 60-65 ° C geïncubeerd om het proteïnase K te laten werken, waarna het enzym gedurende 15-30 minuten bij 95 ° C wordt geïnactiveerd. Het proteïnase K vernietigt de nucleasen die DNA afbreken. De inactivatie van proteïnase K vóór PCR is belangrijk om te voorkomen dat het proteïnase K het DNA-polymerase afbreekt. De twee kit-gebaseerde protocollen die hier worden beschreven, zijn snelle, betrouwbare en kosteneffectieve methoden om genomisch DNA te extraheren uit een enkel dier of een paar nematoden voor dagelijks onderzoek en het onderwijzen van laboratoriumtoepassingen. De gebruikte kit werd oorspronkelijk door de fabrikant geoptimaliseerd om DNA uit dierlijk weefsel, speeksel en haar te extraheren7. Het maakt gebruik van een gepatenteerde weefselpreparatieoplossing en extractieoplossing om cellen te lyseren en genomisch DNA toegankelijk te maken. Een gepatenteerde neutralisatieoplossing neutraliseert vervolgens de componenten die PCR kunnen remmen (bijv. Zouten, ionen en Mg2 + -bindende moleculen).
Bij genotypering kan een enkel dier worden getest. Bij het bepalen of een stam homozygoot is, geeft het testen van zes of meer nakomelingen van een enkel dier een hoge mate van vertrouwen dat een lijn homozygoot is of niet (er is een kans van 0,02% om willekeurig zes homozygote mutante nakomelingen te kiezen van een heterozygote ouder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Deze methode 1) is eenvoudig, met minder stappen dan de proteïnase K-methode, en 2) vermindert de voorbereidingstijd van de sjabloon tot 15 minuten. De resultaten in dit werk tonen aan dat het ontwikkelde protocol robuust werkt bij het extraheren van genomisch DNA uit enkele of enkele wormen, die betrouwbaar kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen die geen sterk gezuiverd DNA vereisen, inclusief PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Onderhoud van C. elegans
OPMERKING: N2 (wild type) en blmp-1(tm548) C. elegans stammen werden gehandhaafd op standaard nematode groeimedia (NGM) platen bij 20 °C.
- Bereid NGM-platen door 23,005 g NGM-poeder op te lossen in 973 ml water in een kolf van 2 L. Dek de opening van de kolf af met aluminiumfolie (of autoclaveerbare dop die ontluchting mogelijk maakt) en bevestig de bekleding met autoclaaftape. Autoclaaf om het poeder op te lossen en de inhoud te steriliseren met een sterilisatiecyclus van ten minste 30 minuten.
- Koel het medium af tot 60 °C in een waterbad.
- Voeg aan het afgekoelde medium 25 ml steriele 1 M fosfaatbuffer (KH2PO4), pH 6,0, toe; 1 ml calciumchlorideoplossing van 1 m; en 1 ml magnesiumsulfaatoplossing van 1 M.
- Roer het medium op een magneetroerplaat om een homogeen mengsel te verkrijgen en om ongelijke afkoeling en stolling te voorkomen (~5 min). Zorg ervoor dat de roerstaaf snel genoeg draait om een vortex te creëren, maar niet zo snel dat er bellen worden geïntroduceerd (~ 250-300 rpm).
- Giet ~ 25 ml van het medium in elke petriplaat van 10 cm (~ 40 platen in totaal). Droog de platen 's nachts bij kamertemperatuur (meestal 16-25 °C).
- Kweek een kolonie Escherichia coli OP50 in 30-50 ml LB bouillon gedurende de nacht bij 37 °C.
- Zaai elke plaat met 500 μL E. coli OP50-cultuur en laat ze voor gebruik bij kamertemperatuur drogen (meestal 16-25 °C)8. Bewaar de platen bij 4 °C gedurende maximaal 3 weken.
- Breng C. elegans over op gezaaide platen met behulp van een draadprikker of een andere methode en laat ze uitgroeien tot L4 of volwassen stadium bij de temperatuur die nodig is voor de stam (meestal 16-25 °C, 1-2 dagen als dieren uitgehongerd als dauers, 3-4 dagen als dieren als embryo's zijn verguld)8.
2. DNA-extractie met één worm
OPMERKING: Deze methode is nuttig voor het extraheren van DNA uit een enkele worm (één worm in 1,8 μL van het totale volume). Een mastermix kan worden gemaakt als er meerdere wormen tegelijk worden gelyseerd.
- Programmeer een thermocycler voor één cyclus bij 55 °C gedurende 10 minuten gevolgd door 95 °C gedurende 3 minuten (lysisprogramma).
- Aliquot 0,8 μL van de extractieoplossing uit de kit op de binnenwand van een 0,2 ml PCR-buis op ijs. Voeg 0,2 μL van de weefselpreparaatoplossing uit de kit toe aan de druppel van de extractieoplossing. Mix door te pipetteren.
- Identificeer een L4 of volwassen dier onder een ontleedmicroscoop9. Om L4-hermafrodieten te identificeren, zoekt u naar een karakteristieke vulva die zichtbaar is als een bleke halve cirkel in het midden van het dier. Identificeer volwassen hermafrodieten door te zoeken naar de grootste dieren op de plaat die ovale embryo's zichtbaar kunnen hebben in hun baarmoeder.
- Breng met behulp van een platina draadprikker het geselecteerde dier over in de oplossing10.
- Centrifugeer de buis kort (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g) bij kamertemperatuur om de inhoud aan de onderkant van de buis op te vangen.
- Plaats de buis in de thermocycler en voer het lysisprogramma uit dat is ingesteld bij stap 2.1.
- Wanneer het programma is voltooid, centrifugeer je de buis kort en plaats je deze op ijs. Voeg 0,8 μL van de neutralisatieoplossing uit de kit toe aan het mengsel. Mix door te pipetteren.
- Centrifugeer de buis kort bij kamertemperatuur (2-3 s, ≤6.000 tpm/2.000 × g).
- Gebruik het lysaat direct voor PCR of bewaar het bij 4 °C of −20 °C voor toekomstig gebruik.
OPMERKING: Geëxtraheerd DNA is stabiel bij 4 °C of −20 °C gedurende ten minste 6 maanden7.
3. DNA-extractie van enkele individuen
OPMERKING: Deze methode is handig voor het extraheren van DNA uit een paar wormen. Een mastermix kan worden bereid als er meerdere soorten tegelijk worden gelyseerd.
- Programmeer de thermocycler gedurende één cyclus bij 55 °C gedurende 10 minuten gevolgd door 95 °C gedurende 3 minuten (lysisprogramma).
- Aliquot 2,0 μL van de extractieoplossing uit de kit op de binnenwand van een 0,2 ml PCR-buis op ijs. Voeg 0,5 μL van de weefselpreparaatoplossing uit de kit toe aan de druppel extractieoplossing. Mix door te pipetteren.
- Identificeer L4 of volwassen dieren onder een ontleedmicroscoop9. L4 hermafrodieten hebben een karakteristieke vulva die zichtbaar is als een bleke halve cirkel in het midden van het dier. Volwassen hermafrodieten zijn de grootste dieren op de plaat en kunnen ovale embryo's zichtbaar hebben in hun baarmoeder.
- Breng met behulp van een platinadraadpluk een paar dieren over in de oplossing: 9 dieren leveren 1 dierlijk equivalent van genomisch DNA op per 0,5 μL lysaat en 16 dieren leveren ~1 dierlijk equivalent van genomisch DNA op in 0,25 μL (3,5 nematoden/μL)10.
OPMERKING: Het is moeilijk om meer dan 16 dieren in dit volume over te brengen. - Centrifugeer de buis kort bij kamertemperatuur (2-3 s, ≤6.000 tpm / 2.000 × g).
- Plaats de buis in de thermocycler en voer het lysisprogramma uit dat is ingesteld bij stap 3.1.
- Wanneer het programma is voltooid, centrifugeer je de buis kort en plaats je deze op ijs. Voeg 2 μL van de neutralisatieoplossing uit de kit toe aan het mengsel. Mix door te pipetteren.
- Centrifugeer de buis kort bij kamertemperatuur (2-3 s, ≤6.000 tpm/2.000 × g).
- Gebruik de lysis direct voor PCR of bewaar deze bij 4 °C of −20 °C voor toekomstig gebruik.
OPMERKING: Geëxtraheerd DNA is stabiel bij 4 °C of −20 °C gedurende ten minste 6 maanden7.
4. PCR-reactie
OPMERKING: Een downstream-toepassing van deze wormlysistechniek, het detecteren van een deletiemutatie met behulp van een snel polymerase, wordt beschreven. De effectiviteit van de twee wormlysisprotocollen bij het produceren van genomisch sjabloon-DNA voor succesvolle PCR bij verdunningen tot 1/50e van een worm per reactie wordt ook aangetoond.
- Extraheer DNA van een enkele worm en 16 wormen met behulp van wild-type N2 en mutante stammen, zoals hierboven beschreven in stap 2 en stap 3.
- Bereid 2-, 10-, 20- en 50-voudige verdunningen van single-worm DNA van wild-type N2-dieren.
- Stel PCR-reacties in volgens het protocol van de fabrikant met behulp van primers die specifiek zijn voor de volgorde van interesse en hot-start PCR-mastermix (tabel 1 en tabel 2). Gebruik 1 μL onverdund DNA of 2 μL verdund DNA als sjabloon in elke reactie.
- Bevestig de PCR-producten door gel-elektroforese en beeldvorming11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genomisch DNA van een enkele of enkele wild-type volwassenen werd geëxtraheerd met behulp van de commerciële kit of het traditionele lysisprotocol om de werkzaamheid van deze twee methoden te vergelijken. Deze lysaten werden vervolgens gebruikt als sjablonen voor PCR om ofwel een groter doel van ~ 2.100 bp (codering blmp-1) of een kleiner doel van ~ 500 bp (coderend voor een deel van sma-10) te versterken. Beide methoden leverden met succes geschikte PCR-producten op (figuur 1A).
Vervolgens werd het vermogen van kit-geëxtraheerd genomisch DNA om te dienen als sjabloon voor een verscheidenheid aan DNA-polymerasen aangetoond. Geëxtraheerd genomisch DNA werd gebruikt als sjabloon voor het versterken van een product van 0,5 kb met behulp van vier polymerasen die verschillende mogelijkheden hebben (waaronder snelheid, getrouwheid en productgrootte). Producten van verwachte grootte werden gegenereerd door deze polymerasen met behulp van een sjabloon van een single-adult lysis of een negen-volwassen lysis (Figuur 1B). De sjabloonvolgorde en getrouwheid van de PCR-polymerasen om de sjabloonvolgorde correct te versterken, kan worden bevestigd door sequencing (aanvullende figuur S1). Dit resultaat toont aan dat het genomische DNA dat uit de kitprotocollen wordt geëxtraheerd, een geschikt sjabloon biedt voor een reeks polymerasen.
De werkzaamheid van PCR werd getest met behulp van verschillende concentraties van het genomische DNA geëxtraheerd uit een enkel dier met behulp van de commerciële kit. DNA werd verdund met een 2-, 10-, 20- of 50-voudige, en het equivalent van ongeveer de helft, een tiende, een twintigste en een vijftigste van een worm per reactie werd gebruikt voor PCR's. Deze DNA-sjabloonconcentraties ondersteunden de amplificatie van een groter doelwit van ~2,1 kb of een kleiner doelwit van ~0,5 kb (Figuur 1C)12. Terwijl een DNA-concentratieafhankelijke opbrengst van het 0,5 kb PCR-product werd waargenomen, leek de PCR-productopbrengst van 2,1 kb in alle reacties gelijkwaardig.
Om aan te tonen dat deze protocollen genomisch DNA produceren van C. elegans dat geschikt is voor PCR genotypering, werd genomisch DNA geëxtraheerd uit enkele en 16 wild-type en blmp-1 verlies-van-functie mutanten (blmp-1 (tm548)). Het blmp-1-gen codeert voor een transcriptiefactor met belangrijke rollen in distale tipcelmigratie, lichaamsgrootte en ontwikkeling 12,13,14,15,16. De blmp-1 mutant heeft een 810 bp deletie die delen van exon 3 en intron 315 verwijdert. Primers zijn ontworpen die resulteren in een 2.134 bp-product wanneer het wild-type DNA-sjabloon wordt gebruikt en een 1.324 bp-product als blmp-1 (-) DNA wordt gebruikt. PCR-producten van de juiste grootte werden gedetecteerd met behulp van 1 μL van ofwel enkele worm (ongeveer 0,5 wormen per reactie) of 16-wormlysis van L4-geënsceneerde dieren (3,5 wormen per reactie) (figuur 1D). Dit resultaat toont aan dat kit-geëxtraheerd genomisch DNA met behulp van beide protocollen even effectieve sjablonen biedt voor PCR tot genotypelijnen.
Deze resultaten tonen aan dat C. elegans genomische DNA-preparaten met behulp van een commerciële weefsel-DNA-extractiekit van enkele en meerdere dieren betrouwbaar kunnen worden gebruikt als sjablonen voor PCR.
Figuur 1: DNA-preparaten met behulp van een commerciële kit van enkele nematoden en meerdere nematoden maken robuuste versterking door PCR mogelijk. PCR-producten werden geladen op 1% agarosegel in 1x TAE-buffer (5 μL (A, B) of 10 μL (C, D) en draaien op 90-100 V gedurende 30 minuten tot 2 uur. Voor alle gels werd een 2-log DNA ladder gebruikt. (A) Vergelijking van DNA-lysis per kit met traditionele proteïnase K-methoden om een sjabloon te maken met behulp van twee primersets. Wild-type volwassenen werden gelyseerd en het equivalent van één dier werd gebruikt als sjabloon voor alle reacties. Lanes 1-4, 2.1 kb product. Lane 1, PCR van single-worm lysis door proteinase K. Lane 2, PCR van single-worm lysis door de kit methode. Lane 3, PCR van negenwormwormlysis door proteïnase K. Lane 4, PCR van negenwormwormlysis volgens de kitmethode. Lanes 5-8, 0.5 kb product. Lane 5, PCR van single-worm lysis door proteinase K. Lane 6, PCR van single-worm lysis door de kit methode. Lane 7, PCR van negenwormwormlysis door proteïnase K. Lane 8, PCR van negenwormwormlysis volgens de kitmethode. (B) De kitmethode voor DNA-lysis biedt een geschikt sjabloon voor PCR door meerdere polymerasen. Wild-type volwassenen werden gelyseerd met behulp van de kitmethode en het equivalent van de helft van een dier werd gebruikt als PCR-sjabloon voor een product van 0,5 kb. Zie de tabel met materialen voor polymerasedetails. Lane 1, PCR van een single-worm lysis met een high-speed polymerase. Lane 2, PCR van een negen-worm lysis met een high-speed polymerase. Lane 3, PCR van een single-worm lysis met een Taq polymerase. Lane 4, PCR van een negenwormlysis met een Taq polymerase. Lane 5, PCR van een single-worm lysis met een high-fidelity polymerase. Lane 6, PCR van een negenwormlysis met een high-fidelity polymerase. Lane 7, PCR van een single-worm lysis met een high-speed, high-fidelity polymerase. Lane 8, PCR van een negen-worm lysis met een high-speed, high-fidelity polymerase. (C) Verdunningen van één wildtype L4-wormlysis vormen een sjabloon voor PCR. Lanes 1-5, 2.1 kb product. Rijstroken 6-10, 0,5 kb doel. Baan 1 en rijstrook 6, onverdund DNA. Lane 2 en lane 7, 2-voudig verdund DNA. Lane 3 en lane 8, 10-voudig verdund DNA. Lane 4 en lane 9, 20-voudig verdund DNA. Lane 5 en lane 10, 50-voudig verdund DNA. (D) Genotypering van de blmp-1 locus door PCR met behulp van 1 μL single- en 16-worm DNA-preparaten als sjabloon. Lane 1, PCR van wild-type single-worm lysis. Lane 2, PCR van blmp-1(-) single-worm lysis. Lane 3, PCR van wild-type 16-worm lysis. Lane 4, PCR van blmp-1(-) 16-worm lysis. Afkortingen: prep = bereidingswijze; kb = kilobase; st. = nematodenstadium; dil. = verdunning van DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Doel | Primer naam | Volgorde | ||
| Blmp-1 | voorwaarts | GCGTCAGGTAAGTTGTGATA | ||
| omkeren | CAGTTATTGCGGCTGTTGTT | |||
| SMA-10 | voorwaarts | AATGTGTGGCAAGGAATCG | ||
| omkeren | TGTCTGTCCAACGAGAAGTG | |||
| Sequencing | 1 | CACATCCCGGACGCCTTAAT | ||
| 2 | CTAATTGTTTTCTACCTGGC | |||
Tabel 1: Lijst van primers.
| Een. | Pol A, Pol B, Pol D | Pol E |
| PCR-mastermix | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Voorwaartse primer | 0,2 μM (eindconcentratie) | 0,5 μM (eindconcentratie) |
| Omgekeerde primer | 0,2 μM (eindconcentratie) | 0,5 μM (eindconcentratie) |
| sjabloon DNA | veranderlijk | 1 μl |
| Nucleasevrij water | tot 25 μL | tot 25 μL |
| B. | Pol C |
| PCR 5x buffer | 2,5 μL |
| 10 mM dNTPs | 2,0 μL |
| Voorwaartse primer | 0,2 μM (eindconcentratie) |
| Omgekeerde primer | 0,2 μM (eindconcentratie) |
| sjabloon DNA | veranderlijk |
| polymerase | 0,5 μL |
| Nucleasevrij water | tot 25 μL |
| C. PCR-programma gebruikt voor Figuur 1B | ||
| temperatuur | Tijd | Cycli |
| 98 °C | 2 min. | 1 |
| 98 °C | 1 min. | 30 |
| 55 °C | 1 min. | |
| 72 °C | 1 min. | |
| 72 °C | 1 min. | 1 |
| 4 °C | houden | |
| D. PCR-programma gebruikt voor Supplemental Figure S1 | ||
| temperatuur | Tijd | Cycli |
| 98 °C | 30 s | 1 |
| 98 °C | 10 s | 30 |
| 57 °C | 20 s | |
| 72 °C | 50 s | |
| 72 °C | 2 min. | 1 |
| 4 °C | houden | |
Tabel 2: PCR-reactiecomponenten.
Aanvullende figuur S1: Sequencing voor bevestiging van de kwaliteit van genomisch DNA bereid met een commerciële kit. De resultaten van twee sequencingreacties komen volledig overeen met de verwachte sequentie van meer dan 1.600 nucleotiden van DNA versterkt door een high-speed, high-fidelity polymerase (Pol E) van een 16-wormlysis (tabel 1, tabel 2A en tabel 2D). Sequencing leeseinden werden bijgesneden om basislezingen van lage kwaliteit te verwijderen. De uitlijning werd uitgevoerd met behulp van de EMBL-EBI multiple sequence alignment tool MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bepalen van de genotypen van C. elegans is een belangrijke stap bij het uitvoeren van genetische kruisingen om nieuwe C. elegans-stammen te creëren. Genomische DNA-extractie met behulp van een enkele of enkele C. elegans is een cruciale stap in het genotyperen van C. elegans. Dit protocol beschrijft genomische DNA-extractie van C. elegans met behulp van een commerciële kit. Deze methode is snel en werkt robuust. Het genomische DNA dat met deze methode wordt geëxtraheerd, kan worden gebruikt voor downstream-toepassingen, waaronder genotypering, sequencing en klonen. De beschreven DNA-extractiemethode is geoptimaliseerd voor genotypering van C. elegans genetische kruisingen met behulp van enkele en enkele L4 of volwassen dieren als uitgangsmateriaal voor het DNA-sjabloon. Het equivalent van een vijftigste van een dier (figuur 1C) tot 3,5 dieren (figuur 1D) bood een geschikt sjabloon voor het versterken van doel-DNA-sequenties door PCR. Dit protocol (met verdunning) levert voldoende template (bij 2 μL/reactie) op voor maximaal 45 reacties van een enkele worm en voor 100 reacties van 16 dieren. Zelfs met behulp van één worm per reactie bieden deze protocollen een kostenefficiënte manier om DNA uit C. elegans te extraheren. Gezien de eenvoud, robuustheid en snelheid van het protocol, is het zeer geschikt voor zowel onderzoeks- als klastoepassingen.
Aangezien het protocol het pipetteren van kleine hoeveelheden reagentia omvat, wordt de voorbereiding van een mastermix voor meerdere reacties, een goede pipetteertechniek en het gebruik van goed gekalibreerde pipetten aanbevolen om de consistentie te garanderen. Het gebruik van 0,5-1 μL onverdunde DNA-sjabloon van lyses met één of 9-16 dieren werkt meestal voor een PCR-reactie van 25 μL met behulp van een hot-start PCR-mastermix, maar optimalisatie van de sjabloonconcentratie kan nodig zijn. De reagentia moeten gedurende de duur van het experiment op ijs worden bewaard. Om te voorkomen dat de DNA-extractieoplossingen herhaaldelijk bevriezen en ontdooien, wat de enzymprestaties kan verminderen, wordt aanbevolen de reagentia te aliquoteren en op te slaan bij −20 °C.
Voor downstream-toepassingen die PCR vereisen, vermindert het gebruik van een hot-start, high-speed PCR-mastermix de totale tijd verder in vergelijking met de PCR-reactiemix in de commerciële weefselkit. Snelle polymerasen kunnen producten van minder dan 1 kb in 5-10 s versterken (zie de tabel met materialen en tabel 2 voor polymerasebeschrijvingen), terwijl de PCR-reactiemix van de kit een Taq DNA-polymerase gebruikt met een amplificatiesnelheid van ~ 1 kb / min7. Producten van sommige PCR's kunnen direct in een agarosegel worden geladen voor elektroforese, waardoor de stappen en tijd verder worden verminderd. Deze reactiebuffer is ook compatibel met restrictie-enzymvertering. High-fidelity DNA-polymerasen werken ook robuust met DNA geëxtraheerd met behulp van dit protocol (figuur 1B). Hoewel de gebruikte polymerasen consistent werkten met behulp van kit-geëxtraheerde sjabloon, kan het gebruik van andere polymerasen betere resultaten opleveren, afhankelijk van de sjabloon, primerseteigenschappen, productgrootte en vereiste betrouwbaarheid. Als er problemen optreden na PCR, zoals geen versterkte doelband of extra versterkte banden, kan verdere optimalisatie van de werkomstandigheden van de primer of de dna-sjabloonconcentratie nodig zijn. Het wordt ten zeerste aanbevolen om geschikte controles te gebruiken, waaronder een wild-type DNA-sjabloon en het gebruik van primers waarvan is bewezen dat ze werken.
Deze methode is niet geschikt voor toepassingen die een sterk gezuiverd of hoog rendement van DNA vereisen. Hoewel het aantal bereide dieren en het reactievolume kunnen worden opgeschaald, is het DNA dat met deze methode is bereid niet gescheiden van organismaal puin en is het mogelijk niet zuiver genoeg voor zeer gevoelige toepassingen zoals sequencing van het hele genoom.
De grote voordelen van deze methode ten opzichte van de bestaande traditionele genomische DNA-extractiemethoden zijn de kortere tijd en eenvoudigere, eenvoudigere stappen. In de toekomst zou deze methode kunnen worden opgeschaald, aangepast om C. elegans genomisch DNA te extraheren voor andere downstream-toepassingen, en gebruikt om DNA van andere nematodensoorten te extraheren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De N2-stam en E. coli OP50-bacteriën werden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). De blmp-1 (tm548) stam werd verkregen van het National Bioresource Project, Japan. De auteurs bedanken WormBase. Dit werk werd ondersteund door NIH R01GM097591 aan T.L.G., interne financiering door Texas Woman's University aan T.L.G. en TWU's Center for Student Research aan M.F.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L.
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
- Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
- Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
