Hier wird eine Beschreibung der einfachen und relativ schnellen Isolierung der genomischen DNA von Caenorhabditis elegans aus einem oder wenigen Tieren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gewebekits vorgestellt. Die resultierende gDNA-Präparation ist eine geeignete Vorlage für die PCR.
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Methodenartikel
Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die genomische DNA-Extraktion aus einer oder wenigen Caenorhabditis elegans hat viele nachgelagerte Anwendungen, einschließlich PCR für Genotypisierungslinien, Klonen und Sequenzierung. Die traditionellen Proteinase-K-basierten Methoden zur genomischen DNA-Extraktion aus C. elegans dauern mehrere Stunden. Kommerzielle Extraktionskits, die die Cuticula von C. elegans effektiv aufbrechen und genomische DNA extrahieren, sind begrenzt. Eine einfache, schnellere (~ 15 min) und kostengünstige Methode zur Extraktion von C. elegans genomischer DNA, die sich gut für Unterrichts- und Forschungsanwendungen eignet, wird hier berichtet. Diese DNA-Extraktionsmethode ist optimiert, um einzelne oder einige spätlarven (L4) oder erwachsene Nematoden als Ausgangsmaterial für die Gewinnung einer zuverlässigen Vorlage für die Durchführung einer PCR zu verwenden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DNA-Qualität geeignet ist, Genziele unterschiedlicher Größe durch PCR zu amplifizieren, was die Genotypisierung einzelner oder weniger Tiere auch bei Verdünnungen auf ein Fünfzigstel der genomischen DNA von einem einzelnen Erwachsenen pro Reaktion ermöglicht. Die berichteten Protokolle können zuverlässig verwendet werden, um DNA-Template aus einer einzelnen oder einer kleinen Probe von C. elegans für PCR-basierte Anwendungen schnell herzustellen.
Einleitung
Hier werden zwei verwandte Protokolle für die Lyse von Caenorhabditis elegans vorgestellt, um DNA für PCR-basierte Anwendungen zugänglich zu machen. PCR ist eine häufig verwendete molekulare Technik, die für viele Anwendungen verwendet wird, einschließlich der Genotypisierung und Amplifikation von DNA-Fragmenten zum Klonen und Sequenzieren, unter anderem. Der kleine (1 mm), freilebende Spulwurm C. elegans ist ein beliebtes Tiersystem für die biologische Forschung. Die Gewinnung geeigneter genomischer DNA von einem einzelnen Tier oder einigen wenigen Tieren reicht aus, um die Sequenz durch PCR zu amplifizieren. Späte L4-Larven un....
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Protokoll
1. C. elegans Wartung
HINWEIS: N2 (Wildtyp) und blmp-1(tm548) C. elegans Stämme wurden auf Standard-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) -Platten bei 20 ° C gehalten.
- Bereiten Sie NGM-Platten vor, indem Sie 23,005 g NGM-Pulver in 973 ml Wasser in einem 2-Liter-Kolben auflösen. Decken Sie die Kolbenöffnung mit Aluminiumfolie (oder einer autoklavierbaren Kappe, die eine Belüftung ermöglicht) ab und sichern Sie die Abdeckung mit Autoklavband. Autoklav zum Auflösen des Pulvers und Sterilisieren des Inhalts mit einem Sterilisationszyklus von mindestens 30 min.
- Das Medium in einem Wasserbad auf 60....
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Ergebnisse
Genomische DNA von einem einzelnen oder wenigen Wildtyp-Erwachsenen wurde mit dem kommerziellen Kit oder dem traditionellen Lyseprotokoll extrahiert, um die Wirksamkeit dieser beiden Methoden zu vergleichen. Diese Lysate wurden dann als Vorlagen für die PCR verwendet, um entweder ein größeres Ziel von ~ 2.100 bp (Kodierung von blmp-1) oder ein kleineres Ziel von ~ 500 bp (Kodierung eines Teils von sma-10) zu verstärken. Beide Methoden lieferten erfolgreich geeignete PCR-Produkte (Ab.......
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Diskussion
Die Bestimmung der Genotypen von C. elegans ist ein wichtiger Schritt bei der Durchführung genetischer Kreuzungen, um neue C. elegans-Stämme zu erzeugen. Die genomische DNA-Extraktion mit einem oder wenigen C. elegans ist ein entscheidender Schritt bei der Genotypisierung von C. elegans. Dieses Protokoll beschreibt die genomische DNA-Extraktion aus C. elegans mit einem kommerziellen Kit. Diese Methode ist schnell und funktioniert robust. Die mit dieser Methode extrahierte gen.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Der N2-Stamm und E. coli OP50-Bakterien wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) bezogen, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Der Stamm blmp-1(tm548) wurde vom National Bioresource Project, Japan, bezogen. Die Autoren danken WormBase. Diese Arbeit wurde von NIH R01GM097591 an T.L.G., interne Finanzierung durch die Texas Woman's University an T.L.G. und TWU's Center for Student Research an M.F.L. unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Autoklavenband | Defend | 43237-2 | |
| Aluminiumfolie, | strapazierfähiges Reynolds Wrap | 2182934 | |
| Calciumchlorid | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp Kit (enthält Gewebevorbereitungslösung, Extraktionslösung und Neutralisationslösung) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp Heizplatte/Rührer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB Medien, Lennox, Kapseln | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| Magnesiumsulfat, 97% rein, wasserfrei | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| Mikrozentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Heißstart High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E", verwendet in Supplemental Figure S1, eine Hochgeschwindigkeitspolymerase mit hoher Genauigkeit (20– 30 s/kb) |
| NGM-Medienpulver | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Abbildung 1B, eine Hochgeschwindigkeitspolymerase mit hoher Genauigkeit (15– 30 s/kb) |
| primer | Integrated DNA Technologies | kundenspezifische DNA-Oligos | |
| PrimeSTAR GXL Polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Abbildung 1B, eine High-Fidelity-Polymerase (1 min/kb) für GC-reiche Templates und Templates bis zu 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0,1– 10,0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Schnelle PCR-Mastermischung | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Abbildung 1B, Polymerase in Abbildung 1A, C, D, eine Hochgeschwindigkeits-Polymerase (10 s/kb) für Ziele bis zu 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR-Reaktionsmix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Abbildung 1B, eine Polymerase (1 min/kb) für Ziele bis zu 7 kb |
| SimpliAmp Thermocycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| Rührstab | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| Wirbelmischer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Wurmpicker | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Referenzen
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H.
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Nachdrucke und Genehmigungen
