Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA

Summary

Hier wird eine Beschreibung der einfachen und relativ schnellen Isolierung der genomischen DNA von Caenorhabditis elegans aus einem oder wenigen Tieren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gewebekits vorgestellt. Die resultierende gDNA-Präparation ist eine geeignete Vorlage für die PCR.

Abstract

Die genomische DNA-Extraktion aus einer oder wenigen Caenorhabditis elegans hat viele nachgelagerte Anwendungen, einschließlich PCR für Genotypisierungslinien, Klonen und Sequenzierung. Die traditionellen Proteinase-K-basierten Methoden zur genomischen DNA-Extraktion aus C. elegans dauern mehrere Stunden. Kommerzielle Extraktionskits, die die Cuticula von C. elegans effektiv aufbrechen und genomische DNA extrahieren, sind begrenzt. Eine einfache, schnellere (~ 15 min) und kostengünstige Methode zur Extraktion von C. elegans genomischer DNA, die sich gut für Unterrichts- und Forschungsanwendungen eignet, wird hier berichtet. Diese DNA-Extraktionsmethode ist optimiert, um einzelne oder einige spätlarven (L4) oder erwachsene Nematoden als Ausgangsmaterial für die Gewinnung einer zuverlässigen Vorlage für die Durchführung einer PCR zu verwenden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DNA-Qualität geeignet ist, Genziele unterschiedlicher Größe durch PCR zu amplifizieren, was die Genotypisierung einzelner oder weniger Tiere auch bei Verdünnungen auf ein Fünfzigstel der genomischen DNA von einem einzelnen Erwachsenen pro Reaktion ermöglicht. Die berichteten Protokolle können zuverlässig verwendet werden, um DNA-Template aus einer einzelnen oder einer kleinen Probe von C. elegans für PCR-basierte Anwendungen schnell herzustellen.

Introduction

Hier werden zwei verwandte Protokolle für die Lyse von Caenorhabditis elegans vorgestellt, um DNA für PCR-basierte Anwendungen zugänglich zu machen. PCR ist eine häufig verwendete molekulare Technik, die für viele Anwendungen verwendet wird, einschließlich der Genotypisierung und Amplifikation von DNA-Fragmenten zum Klonen und Sequenzieren, unter anderem. Der kleine (1 mm), freilebende Spulwurm C. elegans ist ein beliebtes Tiersystem für die biologische Forschung. Die Gewinnung geeigneter genomischer DNA von einem einzelnen Tier oder einigen wenigen Tieren reicht aus, um die Sequenz durch PCR zu amplifizieren. Späte L4-Larven und Erwachsene enthalten nur ~ 1.000 somatische Zellen (einschließlich einiger multinuklearer, polyploider Zellen), Keimzellen und (wenn das Tier ein gravider Hermaphrodit ist) Nachkommen in utero¹. Diese Tiere sind jedoch durch eine Kutikula geschützt, die gestört werden muss, um die genomische DNA² zu extrahieren. Standardmethoden zur Vorbereitung der genomischen DNA-Vorlage für Nematoden für die PCR umfassen mehrere Schritte und dauern mehrere Stunden. Die Tiere werden zunächst in Wurmlysepuffer eingefroren, der Proteinase K (−70 °C oder weniger) für mindestens 15-45 min enthält (längere wird von einigen Protokollen empfohlen⁾3,4,5,6. Dieser Schritt reißt die Tiere auf.

Nach dem Einfrieren werden die Tiere für 1 h bei 60-65 °C inkubiert, damit die Proteinase K funktioniert, dann wird das Enzym für 15-30 min bei 95 °C inaktiviert. Die Proteinase K zerstört die Nukleasen, die DNA abbauen. Die Inaktivierung der Proteinase K vor der PCR ist wichtig, um zu verhindern, dass die Proteinase K die DNA-Polymerase abbaut. Die beiden hier beschriebenen Kit-basierten Protokolle sind schnelle, zuverlässige und kostengünstige Methoden, um genomische DNA aus einem einzelnen Tier oder einigen Nematoden für alltägliche Forschungs- und Lehrlaboranwendungen zu extrahieren. Das verwendete Kit wurde ursprünglich vom Hersteller optimiert, um DNA aus tierischem Gewebe, Speichel und Haaren zu extrahieren⁷. Es verwendet eine proprietäre Gewebepräparationslösung und Extraktionslösung, um Zellen zu lysieren und genomische DNA zugänglich zu machen. Eine proprietäre Neutralisationslösung neutralisiert dann die Komponenten, die die PCR hemmen können (z. B. Salze, Ionen und Mg²⁺-bindende Moleküle).

Bei der Genotypisierung kann ein einzelnes Tier getestet werden. Bei der Bestimmung, ob ein Stamm homozygot ist, gibt das Testen von sechs oder mehr Nachkommen eines einzelnen Tieres eine hohe Sicherheit, dass eine Linie homozygot ist oder nicht (es besteht eine Wahrscheinlichkeit von 0,02%, dass zufällig sechs homozygote mutierte Nachkommen von einem heterozygoten Elternteil ausgewählt werden [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Diese Methode 1) ist einfach, mit weniger Schritten als die Proteinase K-Methode, und 2) verringert die Vorlagenvorbereitungszeit auf 15 min. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das entwickelte Protokoll robust bei der Extraktion genomischer DNA aus einzelnen oder wenigen Würmern funktioniert, die zuverlässig für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden kann, die keine hochgereinigte DNA benötigen, einschließlich PCR.

Protocol

1. C. elegans Wartung

HINWEIS: N2 (Wildtyp) und blmp-1(tm548) C. elegans Stämme wurden auf Standard-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) -Platten bei 20 ° C gehalten.

1. Bereiten Sie NGM-Platten vor, indem Sie 23,005 g NGM-Pulver in 973 ml Wasser in einem 2-Liter-Kolben auflösen. Decken Sie die Kolbenöffnung mit Aluminiumfolie (oder einer autoklavierbaren Kappe, die eine Belüftung ermöglicht) ab und sichern Sie die Abdeckung mit Autoklavband. Autoklav zum Auflösen des Pulvers und Sterilisieren des Inhalts mit einem Sterilisationszyklus von mindestens 30 min.
2. Das Medium in einem Wasserbad auf 60 °C abkühlen.
3. Zu dem abgekühlten Medium werden 25 ml steriler 1 M Phosphatpuffer (KH₂PO₄), pH 6,0, zugegeben; 1 ml 1 M Calciumchloridlösung; und 1 ml 1 M Magnesiumsulfatlösung.
4. Rühren Sie das Medium auf einer magnetischen Rührplatte um, um eine homogene Mischung zu erhalten und eine ungleichmäßige Abkühlung und Erstarrung zu verhindern (~5 min). Stellen Sie sicher, dass sich der Rührstab schnell genug dreht, um einen Wirbel zu erzeugen, aber nicht so schnell, dass Blasen eingeführt werden (~ 250-300 U / min).
5. Gießen Sie ~ 25 ml des Mediums in jede 10 cm Petriplatte (~ 40 Platten insgesamt). Trocknen Sie die Platten bei Raumtemperatur über Nacht (typischerweise 16-25 °C).
6. Züchten Sie eine Kolonie Escherichia coli OP50 in 30-50 ml LB-Brühe über Nacht bei 37 ° C.
7. Jede Platte mit 500 μL E. coli OP50-Kultur aussaat und vor Gebrauch bei Raumtemperatur trocknen lassen (typischerweise 16-25 °C)⁸. Lagern Sie die Platten bei 4 °C für bis zu 3 Wochen.
8. C. elegans mit einer Drahtpickel oder einer anderen Methode auf ausgesäte Platten übertragen und sie bei der für den Stamm erforderlichen Temperatur auf L4 oder das Erwachsenenstadium wachsen lassen (typischerweise 16-25 °C, 1-2 Tage, wenn Tiere als Dauers verhungert wurden, 3-4 Tage, wenn Tiere als Embryonen plattiert wurden)⁸.

2. Einzelwurm-DNA-Extraktion

HINWEIS: Diese Methode ist nützlich, um DNA aus einem einzelnen Wurm (ein Wurm in 1,8 μL Gesamtvolumen) zu extrahieren. Ein Master-Mix kann erstellt werden, wenn mehrere Würmer gleichzeitig lysiert werden.

1. Programmieren Sie einen Thermocycler für einen Zyklus bei 55 °C für 10 Minuten, gefolgt von 95 °C für 3 min (Lyseprogramm).
2. Aliquot 0,8 μL der Extraktionslösung aus dem Kit auf die Innenwand eines 0,2 mL PCR-Röhrchens auf Eis. 0,2 μL der Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung geben. Mischen durch Pipettieren.
3. Identifizieren Sie ein L4 oder ein erwachsenes Tier unter einem Seziermikroskop⁹. Um L4-Hermaphroditen zu identifizieren, suchen Sie nach einer charakteristischen Vulva, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Identifizieren Sie erwachsene Hermaphroditen, indem Sie nach den größten Tieren auf dem Teller suchen, die ovale Embryonen in ihrer Gebärmutter sichtbar haben können.
4. Übertragen Sie das ausgewählte Tier mit einem Platin-Drahtbesteck in die Lösung¹⁰.
5. Zentrieren Sie das Rohr kurz (2-3 s, ≤6.000 U / min / 2.000 × g) bei Raumtemperatur, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln.
6. Legen Sie das Rohr in den Thermocycler und führen Sie das in Schritt 2.1 eingestellte Lyseprogramm aus.
7. Wenn das Programm abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis. 0,8 μL der Neutralisationslösung aus dem Kit in die Mischung geben. Mischen durch Pipettieren.
8. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U/min/2.000 × g).
9. Verwenden Sie das Lysat direkt für die PCR oder lagern Sie es bei 4 °C oder -20 °C für die zukünftige Verwendung.
   HINWEIS: Die extrahierte DNA ist bei 4 °C oder -20 °C für mindestens 6 Monate stabil⁷.

3. DNA-Extraktion einiger weniger Individuen

HINWEIS: Diese Methode ist nützlich, um DNA aus einigen Würmern zu extrahieren. Ein Master-Mix kann hergestellt werden, wenn mehrere Stämme gleichzeitig lysiert werden.

1. Programmieren Sie den Thermocycler für einen Zyklus bei 55 °C für 10 Minuten, gefolgt von 95 °C für 3 min (Lyseprogramm).
2. Aliquot 2,0 μL der Extraktionslösung aus dem Kit auf die Innenwand eines 0,2 ml PCR-Röhrchens auf Eis. 0,5 μL der Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung geben. Mischen durch Pipettieren.
3. Identifizieren Sie L4 oder erwachsene Tiere unter einem Seziermikroskop⁹. L4-Hermaphroditen haben eine charakteristische Vulva, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Erwachsene Hermaphroditen sind die größten Tiere auf dem Teller und können ovale Embryonen in ihrer Gebärmutter sichtbar haben.
4. Übertragen Sie mit einem Platin-Drahtbecher einige Tiere in die Lösung: 9 Tiere ergeben 1 tierisches Äquivalent genomischer DNA pro 0,5 μL Lysat und 16 Tiere erhalten ~ 1 tierisches Äquivalent genomischer DNA in 0,25 μL (3,5 Nematoden/μL)¹⁰.
   HINWEIS: Es ist schwierig, mehr als 16 Tiere in diesen Band zu übertragen.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U / min / 2.000 × g).
6. Legen Sie das Rohr in den Thermocycler und führen Sie das Lyseprogramm aus, das in Schritt 3.1 eingestellt ist.
7. Wenn das Programm abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis. 2 μL der Neutralisationslösung aus dem Kit in die Mischung geben. Mischen durch Pipettieren.
8. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U/min/2.000 × g).
9. Verwenden Sie die Lyse direkt für die PCR oder lagern Sie sie bei 4 °C oder −20 °C für die zukünftige Verwendung.
   HINWEIS: Die extrahierte DNA ist bei 4 °C oder -20 °C für mindestens 6 Monate stabil⁷.

4. PCR-Reaktion

HINWEIS: Eine nachgelagerte Anwendung dieser Wurmlysetechnik, die eine Deletionsmutation mit einer schnellen Polymerase nachweist, wird beschrieben. Die Wirksamkeit der beiden Wurmlyseprotokolle bei der Herstellung genomischer Vorlagen-DNA für eine erfolgreiche PCR bei Verdünnungen auf 1/50^eines Wurms pro Reaktion ist ebenfalls nachgewiesen.

1. Extrahieren Sie DNA aus einem einzelnen Wurm und 16 Würmern unter Verwendung von Wildtyp-N2- und Mutantenstämmen, wie oben in Schritt 2 und Schritt 3 beschrieben.
2. Bereiten Sie 2-, 10-, 20- und 50-fache Verdünnungen von Single-Worm-DNA von Wildtyp-N2-Tieren vor.
3. Richten Sie PCR-Reaktionen nach dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung von Primern ein, die für die interessierende Sequenz und den Hot-Start-PCR-Master-Mix spezifisch sind (Tabelle 1 und Tabelle 2). Verwenden Sie 1 μL unverdünnte DNA oder 2 μL verdünnte DNA als Vorlage für jede Reaktion.
4. Bestätigen Sie die PCR-Produkte durch Gelelektrophorese und Bildgebung¹¹.

Representative Results

Genomische DNA von einem einzelnen oder wenigen Wildtyp-Erwachsenen wurde mit dem kommerziellen Kit oder dem traditionellen Lyseprotokoll extrahiert, um die Wirksamkeit dieser beiden Methoden zu vergleichen. Diese Lysate wurden dann als Vorlagen für die PCR verwendet, um entweder ein größeres Ziel von ~ 2.100 bp (Kodierung von blmp-1) oder ein kleineres Ziel von ~ 500 bp (Kodierung eines Teils von sma-10) zu verstärken. Beide Methoden lieferten erfolgreich geeignete PCR-Produkte (Abbildung 1A).

Als nächstes wurde die Fähigkeit der Kit-extrahierten genomischen DNA demonstriert, als Vorlage für eine Vielzahl von DNA-Polymerasen zu dienen. Die extrahierte genomische DNA wurde als Vorlage für die Amplifikation eines 0,5 kb-Produkts unter Verwendung von vier Polymerasen verwendet, die unterschiedliche Fähigkeiten besitzen (einschließlich Geschwindigkeit, Wiedergabetreue und Produktgröße). Produkte der erwarteten Größe wurden durch diese Polymerasen unter Verwendung von Schablonen aus einer Lyse bei Einzelerwachsenen oder einer Lyse bei neun Erwachsenen erzeugt (Abbildung 1B). Die Template-Sequenz und Treue der PCR-Polymerasen zur korrekten Amplifikation der Template-Sequenz kann durch Sequenzierung bestätigt werden (Supplemental Figure S1). Dieses Ergebnis zeigt, dass die aus den Kit-Protokollen extrahierte genomische DNA eine geeignete Vorlage für eine Reihe von Polymerasen liefert.

Die PCR-Wirksamkeit wurde unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der genomischen DNA getestet, die mit dem kommerziellen Kit von einem einzelnen Tier extrahiert wurden. Die DNA wurde um das 2-, 10-, 20- oder 50-fache verdünnt, und das Äquivalent von etwa der Hälfte, einem Zehntel, einem Zwanzigstel und einem Fünfzigstel eines Wurms pro Reaktion wurde für PCRs verwendet. Diese DNA-Template-Konzentrationen unterstützten die Amplifikation entweder eines größeren Targets von ~2,1 kb oder eines kleineren Targets von ~0,5 kb (Abbildung 1C)¹². Während eine DNA-konzentrationsabhängige Ausbeute des 0,5 kb PCR-Produkts beobachtet wurde, erschien die 2,1 kb PCR-Produktausbeute in allen Reaktionen äquivalent.

Um zu zeigen, dass diese Protokolle genomische DNA aus C. elegans produzieren, die für die PCR-Genotypisierung geeignet ist, wurde genomische DNA aus einzelnen und 16 Wildtyp- und blmp-1-Funktionsverlustmutanten extrahiert (blmp-1 (tm548)). Das blmp-1-Gen kodiert für einen Transkriptionsfaktor mit wichtigen Rollen bei der Migration von distalen Spitzenzellen, der Körpergröße und der Entwicklung 12,13,14,15,16. Die blmp-1-Mutante hat eine 810-bp-Löschung, die Teile von Exon 3 und Intron 3¹⁵ entfernt. Es wurden Primer entwickelt, die zu einem 2.134-bp-Produkt führen, wenn die Wildtyp-DNA-Vorlage verwendet wird, und zu einem 1.324-bp-Produkt, wenn blmp-1 (-) DNA verwendet wird. PCR-Produkte der entsprechenden Größen wurden unter Verwendung von 1 μL entweder Einzelwurm (etwa 0,5 Würmer pro Reaktion) oder 16-Wurm-Lyse von L4-stapierten Tieren (3,5 Würmer pro Reaktion) nachgewiesen (Abbildung 1D). Dieses Ergebnis zeigt, dass Kit-extrahierte genomische DNA, die eines der beiden Protokolle verwendet, gleichermaßen wirksame Vorlagen für die PCR wie für Genotyplinien liefert.

Diese Ergebnisse zeigen, dass C. elegans genomische DNA-Präparate mit einem kommerziellen Gewebe-DNA-Extraktionskit von einzelnen und mehreren Tieren zuverlässig als Vorlagen für die PCR verwendet werden können.

Abbildung 1: DNA-Präparate mit einem kommerziellen Kit aus einzelnen Nematoden und mehreren Nematoden ermöglichen eine robuste Amplifikation durch PCR. PCR-Produkte wurden auf 1% Agarosegel in 1x TAE-Puffer (5 μL (A,B) oder 10 μL (C,D) geladen und mit 90-100 V für 30 min bis 2 h betrieben. Für alle Gele wurde eine 2-log-DNA-Leiter verwendet. (A) Vergleich der DNA-Lyse nach Kit mit traditionellen Proteinase-K-Methoden, um eine Vorlage unter Verwendung von zwei Primer-Sets zu erstellen. Wildtyp-Erwachsene wurden lysiert, und das Äquivalent eines Tieres wurde als Vorlage für alle Reaktionen verwendet. Bahnen 1-4, 2.1 kb Produkt. Lane 1, PCR aus Einzelwurmlyse durch Proteinase K. Lane 2, PCR aus Einzelwurmlyse nach der Kit-Methode. Lane 3, PCR aus Neun-Wurm-Wurmlyse durch Proteinase K. Lane 4, PCR aus Neun-Wurm-Wurmlyse nach der Kit-Methode. Bahnen 5-8, 0,5 kb Produkt. Lane 5, PCR aus Einzelwurmlyse durch Proteinase K. Lane 6, PCR aus Einzelwurmlyse nach der Kit-Methode. Lane 7, PCR aus Neun-Wurm-Wurmlyse durch Proteinase K. Lane 8, PCR aus Neun-Wurm-Wurmlyse nach der Kit-Methode. (B) Die Kit-Methode für die DNA-Lyse bietet eine geeignete Vorlage für die PCR durch mehrere Polymerasen. Wildtyp-Erwachsene wurden mit der Kit-Methode lysiert, und das Äquivalent einer Hälfte eines Tieres wurde als PCR-Vorlage für ein 0,5 kb-Produkt verwendet. Einzelheiten zur Polymerase finden Sie in der Materialtabelle . Lane 1, PCR aus einer Single-Worm-Lyse mit einer Hochgeschwindigkeitspolymerase. Lane 2, PCR aus einer Neun-Wurm-Lyse mit einer Hochgeschwindigkeitspolymerase. Lane 3, PCR aus einer Single-Worm-Lyse mit einer Taq-Polymerase . Lane 4, PCR aus einer Neun-Wurm-Lyse mit einer Taq-Polymerase . Lane 5, PCR aus einer Single-Worm-Lyse mit einer High-Fidelity-Polymerase. Lane 6, PCR aus einer Neun-Wurm-Lyse mit einer High-Fidelity-Polymerase. Lane 7, PCR aus einer Single-Worm-Lyse mit einer Hochgeschwindigkeits-High-Fidelity-Polymerase. Lane 8, PCR aus einer Neun-Wurm-Lyse mit einer Hochgeschwindigkeits-High-Fidelity-Polymerase. (C) Verdünnungen einer Wildtyp-L4-Wurmlyse liefern eine Vorlage für die PCR. Bahnen 1-5, 2.1 kb Produkt. Bahnen 6-10, 0,5 kb Ziel. Bahn 1 und Bahn 6, unverdünnte DNA. Bahn 2 und Bahn 7, 2-fach verdünnte DNA. Bahn 3 und Bahn 8, 10-fach verdünnte DNA. Bahn 4 und Bahn 9, 20-fach verdünnte DNA. Bahn 5 und Bahn 10, 50-fach verdünnte DNA. (D) Genotypisierung des blmp-1-Locus mittels PCR unter Verwendung von 1 μL Einzel- und 16-Wurm-DNA-Präparaten als Vorlage. Lane 1, PCR aus Wildtyp-Single-Worm-Lyse. Lane 2, PCR aus blmp-1(-) Single-Worm-Lyse . Lane 3, PCR aus Wildtyp-16-Wurm-Lyse. Lane 4, PCR von blmp-1(-) 16-worm lysis. Abkürzungen: prep = Zubereitungsmethode; kb = Kilobasis; St. = Nematodenstadium; dil. = Verdünnung der DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ziel	Name der Grundierung	Reihenfolge
BLMP-1	vorwärts	GCGTCAGGTAAGTTGTGATA
	Rückwärts	CAGTTATTGCGGCTGTTGTT
SMA-10	vorwärts	AATGTGTGGCAAGGAATCG
	Rückwärts	TGTCTGTCCAACGAGAAGTG
Sequenzierung	1	CACATCCCGGACGCCTTAAT
	2	CTAATTTTTTTCTACCTGGC

Tabelle 1: Liste der Primer

Ein.	Pol A, Pol B, Pol D	Pol E
PCR Master Mix	12,5 μL	12,5 μL
Vorwärts-Primer	0,2 μM (Endkonzentration)	0,5 μM (Endkonzentration)
Reverse Primer	0,2 μM (Endkonzentration)	0,5 μM (Endkonzentration)
Template-DNA	Variable	1 μL
Nukleasefreies Wasser	bis 25 μL	bis 25 μL

B.	Pol C
PCR 5x Puffer	2,5 μL
10 mM dNTPs	2,0 μL
Vorwärts-Primer	0,2 μM (Endkonzentration)
Reverse Primer	0,2 μM (Endkonzentration)
Template-DNA	Variable
Polymerase	0,5 μL
Nukleasefreies Wasser	bis 25 μL

C. Für Abbildung 1B verwendetes PCR-Programm
Temperatur	Zeit	Zyklen
98 °C	2 min	1
98 °C	1 min	30
55 °C	1 min
72 °C	1 min
72 °C	1 min	1
4 °C	halten

D. PCR-Programm für Supplemental Figure S1
Temperatur	Zeit	Zyklen
98 °C	30 Sek.	1
98 °C	10 s	30
57 °C	20 s
72 °C	50 s
72 °C	2 min	1
4 °C	halten

Tabelle 2: PCR-Reaktionskomponenten.

Ergänzende Abbildung S1: Sequenzierung zur Bestätigung der Qualität genomischer DNA, die mit einem kommerziellen Kit hergestellt wurde. Die Ergebnisse von zwei Sequenzierungsreaktionen stimmen vollständig mit der erwarteten Sequenz von über 1.600 DNA-Nukleotiden überein, die durch eine Hochgeschwindigkeits-High-Fidelity-Polymerase (Pol E) aus einer 16-Wurm-Lyse amplifiziert wurden (Tabelle 1, Tabelle 2A und Tabelle 2D). Sequenzierungsleseenden wurden getrimmt, um Basislesevorgänge von geringer Qualität zu entfernen. Die Ausrichtung erfolgte mit dem EMBL-EBI Multiple Sequence Alignment Tool MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)¹⁷. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Bestimmung der Genotypen von C. elegans ist ein wichtiger Schritt bei der Durchführung genetischer Kreuzungen, um neue C. elegans-Stämme zu erzeugen. Die genomische DNA-Extraktion mit einem oder wenigen C. elegans ist ein entscheidender Schritt bei der Genotypisierung von C. elegans. Dieses Protokoll beschreibt die genomische DNA-Extraktion aus C. elegans mit einem kommerziellen Kit. Diese Methode ist schnell und funktioniert robust. Die mit dieser Methode extrahierte genomische DNA kann für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, einschließlich Genotypisierung, Sequenzierung und Klonierung. Das beschriebene DNA-Extraktionsverfahren wurde für die Genotypisierung von genetischen Kreuzungen von C. elegans unter Verwendung einiger weniger L4 oder erwachsener Tiere als Ausgangsmaterial für die DNA-Vorlage optimiert. Das Äquivalent von einem Fünfzigstel eines Tieres (Abbildung 1C) zu 3,5 Tieren (Abbildung 1D) lieferte eine geeignete Vorlage für die Amplifikation von Ziel-DNA-Sequenzen durch PCR. Dieses Protokoll (mit Verdünnung) liefert genügend Vorlage (bei 2 μL/Reaktion) für maximal 45 Reaktionen von einem einzelnen Wurm und für 100 Reaktionen von 16 Tieren. Selbst mit einem Wurm pro Reaktion bieten diese Protokolle eine kostengünstige Möglichkeit, DNA aus C. elegans zu extrahieren. Aufgrund der Einfachheit, Robustheit und Schnelligkeit des Protokolls eignet es sich sowohl für Forschungs- als auch für Unterrichtsanwendungen.

Da das Protokoll das Pipettieren kleiner Mengen von Reagenzien beinhaltet, wird die Herstellung einer Mastermischung für mehrere Reaktionen, eine gute Pipettiertechnik und die Verwendung gut kalibrierter Pipetten empfohlen, um die Konsistenz sicherzustellen. Die Verwendung von 0,5-1 μL unverdünnter DNA-Vorlage aus Einzel- oder 9-16-Tierlysen funktioniert normalerweise für eine 25-μL-PCR-Reaktion unter Verwendung eines Hot-Start-PCR-Master-Mixes, aber eine Optimierung der Template-Konzentration kann erforderlich sein. Die Reagenzien müssen für die Dauer des Experiments auf Eis gehalten werden. Um ein wiederholtes Auftauen der DNA-Extraktionslösungen zu vermeiden, das die Enzymleistung verringern kann, wird empfohlen, die Reagenzien aliquotiert und bei −20 °C zu lagern.

Für nachgelagerte Anwendungen, die eine PCR erfordern, reduziert die Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-PCR-Mastermixes mit Heißstart die Gesamtzeit im Vergleich zum PCR-Reaktionsmix, der im kommerziellen Tissue-Kit bereitgestellt wird, weiter. Hochgeschwindigkeitspolymerasen können Produkte von weniger als 1 kb in 5-10 s amplifizieren (siehe Materialtabelle und Tabelle 2 für Polymerasebeschreibungen), während die PCR-Reaktionsmischung des Kits eine Taq-DNA-Polymerase mit einer Amplifikationsrate von ~ 1 kb / min⁷ verwendet. Produkte aus einigen PCRs können direkt in ein Agarosegel für die Elektrophorese geladen werden, wodurch die Schritte und die Zeit weiter reduziert werden. Dieser Reaktionspuffer ist auch mit der Restriktionsenzymverdauung kompatibel. High-Fidelity-DNA-Polymerasen arbeiten auch robust mit DNA, die mit diesem Protokoll extrahiert wurde (Abbildung 1B). Während die verwendeten Polymerasen konsequent mit einer Kit-extrahierten Vorlage arbeiteten, kann die Verwendung anderer Polymerasen je nach Vorlage, Primersatzeigenschaften, Produktgröße und erforderlicher Genauigkeit bessere Ergebnisse liefern. Wenn nach der PCR Probleme auftreten, z. B. keine Targetband-Amplifikation oder zusätzliche Banden amplifiziert, kann eine weitere Optimierung der Primer-Arbeitsbedingungen oder der DNA-Template-Konzentration erforderlich sein. Es wird dringend empfohlen, geeignete Kontrollen, einschließlich Wildtyp-DNA-Vorlage und der Verwendung von Primern, die nachweislich funktionieren, zu verwenden.

Diese Methode eignet sich nicht für Anwendungen, die eine hochreine oder eine hohe Ausbeute an DNA-Vorlagen erfordern. Während die Anzahl der vorbereiteten Tiere und das Reaktionsvolumen vergrößert werden können, ist die mit dieser Methode hergestellte DNA nicht von den Trümmern des Organismus getrennt und möglicherweise nicht rein genug für hochempfindliche Anwendungen wie die Sequenzierung des gesamten Genoms.

Zu den Hauptvorteilen dieser Methode im Vergleich zu den bestehenden traditionellen genomischen DNA-Extraktionsmethoden gehören die kürzere Zeit und einfachere, einfachere Schritte. In Zukunft könnte diese Methode ausgeweitet, angepasst werden, um C. elegans genomische DNA für andere nachgelagerte Anwendungen zu extrahieren und DNA von anderen Nematodenarten zu extrahieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP