Summary
Qui viene presentata una descrizione dell'isolamento semplice e relativamente rapido del DNA genomico di Caenorhabditis elegans da uno o pochi animali utilizzando un kit di tessuti disponibile in commercio. La preparazione del gDNA risultante è un modello adatto per la PCR.
Abstract
L'estrazione del DNA genomico da una o poche Caenorhabditis elegans ha molte applicazioni a valle, tra cui la PCR per linee di genotipizzazione, clonazione e sequenziamento. I metodi tradizionali a base di proteinasi K per l'estrazione del DNA genomico da C. elegans richiedono diverse ore. I kit di estrazione commerciali che rompono efficacemente la cuticola di C. elegans ed estraggono il DNA genomico sono limitati. Un metodo facile, più veloce (~ 15 minuti) ed economico per estrarre il DNA genomico di C. elegans che funziona bene per le applicazioni in classe e di ricerca è riportato qui. Questo metodo di estrazione del DNA è ottimizzato per utilizzare singoli o pochi nematodi tardo-larvali (L4) o adulti come materiale di partenza per ottenere un modello affidabile per eseguire la PCR. I risultati indicano che la qualità del DNA è adatta per amplificare bersagli genici di diverse dimensioni mediante PCR, consentendo la genotipizzazione di uno o pochi animali anche a diluizioni a un cinquantesimo del DNA genomico da un singolo adulto per reazione. I protocolli riportati possono essere utilizzati in modo affidabile per produrre rapidamente un modello di DNA da un singolo o un piccolo campione di C. elegans per applicazioni basate su PCR.
Introduction
Qui, vengono presentati due protocolli correlati per la lisi di Caenorhabditis elegans per rendere il DNA accessibile per le applicazioni basate sulla PCR. La PCR è una tecnica molecolare comunemente usata per molte applicazioni, tra cui la genotipizzazione e l'amplificazione di frammenti di DNA per la clonazione e il sequenziamento, tra gli altri. Il piccolo (1 mm), nematode a vita libera C. elegans è un sistema animale popolare per la ricerca biologica. Ottenere DNA genomico adeguato da un singolo animale o da pochi animali è sufficiente per amplificare la sequenza mediante PCR. Le larve tardive di L4 e gli adulti contengono solo ~ 1.000 cellule somatiche (comprese alcune cellule poliploidi multi-nucleari), cellule germinali e (se l'animale è un ermafrodita gravido) prole in utero1. Tuttavia, questi animali sono protetti da una cuticola che deve essere interrotta per estrarre il DNA genomico2. I metodi standard per preparare il modello di DNA genomico dei nematodi per la PCR comportano più passaggi e richiedono diverse ore. Gli animali vengono prima congelati in un tampone di lisi worm contenente proteinasi K (-70 °C o inferiore) per almeno 15-45 minuti (più a lungo è raccomandato da alcuni protocolli)3,4,5,6. Questo passaggio apre gli animali.
Dopo il congelamento, gli animali vengono incubati per 1 ora a 60-65 °C affinché la proteinasi K funzioni, quindi l'enzima viene inattivato per 15-30 minuti a 95 °C. La proteinasi K distrugge le nucleasi che degradano il DNA. L'inattivazione della proteinasi K prima della PCR è importante per evitare che la proteinasi K degradi la DNA polimerasi. I due protocolli basati su kit qui descritti sono metodi rapidi, affidabili ed economici per estrarre il DNA genomico da un singolo animale o da alcuni nematodi per la ricerca quotidiana e l'insegnamento delle applicazioni di laboratorio. Il kit utilizzato è stato originariamente ottimizzato dal produttore per estrarre il DNA da tessuti animali, saliva e capelli7. Utilizza una soluzione proprietaria di preparazione dei tessuti e una soluzione di estrazione per lisare le cellule e rendere accessibile il DNA genomico. Una soluzione di neutralizzazione proprietaria neutralizza quindi i componenti che possono inibire la PCR (ad esempio, sali, ioni e molecole leganti Mg2+).
Durante la genotipizzazione, un singolo animale può essere testato. Quando si determina se un ceppo è omozigote, testare sei o più figli di un singolo animale dà un'alta sicurezza che una linea sia omozigote o meno (c'è una probabilità dello 0,02% di scegliere casualmente sei progenie mutanti omozigoti da un genitore eterozigote [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Questo metodo 1) è semplice, con meno passaggi rispetto al metodo della proteinasi K, e 2) riduce il tempo di preparazione del modello a 15 minuti. I risultati di questo lavoro dimostrano che il protocollo sviluppato funziona in modo robusto nell'estrazione del DNA genomico da uno o pochi vermi, che possono essere utilizzati in modo affidabile per applicazioni a valle che non richiedono DNA altamente purificato, inclusa la PCR.
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Protocol
1. Manutenzione di C. elegans
NOTA: I ceppi N2 (wild type) e blmp-1(tm548) C. elegans sono stati mantenuti su piastre standard di nematodi (NGM) a 20 °C.
- Preparare le piastre NGM sciogliendo 23,005 g di polvere NGM in 973 ml di acqua in un pallone da 2 L. Coprire l'apertura del pallone con un foglio di alluminio (o tappo autoclavabile che consente lo sfiato) e fissare il rivestimento con nastro adesivo. Autoclave per sciogliere la polvere e sterilizzare il contenuto con un ciclo di sterilizzazione di almeno 30 min.
- Raffreddare il mezzo a 60 °C a bagnomaria.
- Al mezzo raffreddato, aggiungere 25 mL di tampone sterile fosfato 1 M (KH2PO4), pH 6,0; 1 mL di soluzione di cloruro di calcio 1 M; e 1 mL di 1 M di soluzione di solfato di magnesio.
- Mescolare il mezzo su una piastra magnetica per ottenere una miscela omogenea e per evitare raffreddamenti e solidificazioni irregolari (~ 5 min). Assicurarsi che la barra di agitazione giri abbastanza velocemente da creare un vortice ma non così velocemente da introdurre bolle (~ 250-300 giri / min).
- Versare ~ 25 ml del mezzo in ogni piastra di Petri da 10 cm (~ 40 piastre in totale). Asciugare le piastre a temperatura ambiente durante la notte (tipicamente 16-25 °C).
- Coltivare una colonia di Escherichia coli OP50 in 30-50 ml di brodo LB durante la notte a 37 °C.
- Seminare ogni piastra con 500 μL di coltura di E. coli OP50 e lasciarli asciugare a temperatura ambiente prima dell'uso (tipicamente 16-25 °C)8. Conservare i piatti a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
- Trasferire C. elegans in piastre seminate utilizzando un raccoglitore di filo o un altro metodo e lasciarli crescere fino allo stadio L4 o adulto alla temperatura richiesta per il ceppo (in genere 16-25 °C, 1-2 giorni se gli animali sono stati placcati affamati come dauers, 3-4 giorni se gli animali sono stati placcati come embrioni)8.
2. Estrazione del DNA a verme singolo
NOTA: Questo metodo è utile per estrarre il DNA da un singolo verme (un verme in 1,8 μL di volume totale). Un master mix può essere fatto se più worm saranno lisati contemporaneamente.
- Programmare un termociclatore per un ciclo a 55 °C per 10 minuti seguito da 95 °C per 3 minuti (programma di lisi).
- Aliquota 0,8 μL della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 mL su ghiaccio. Aggiungere 0,2 μL della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia della soluzione di estrazione. Mescolare per pipettaggio.
- Identificare un animale L4 o adulto sotto un microscopio di dissezione9. Per identificare gli ermafroditi L4, cerca una vulva caratteristica che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Identifica gli ermafroditi adulti cercando gli animali più grandi sulla piastra che possono avere embrioni ovali visibili nel loro utero.
- Utilizzando un plettro in filo di platino, trasferire l'animale selezionato nella soluzione10.
- Centrifugare brevemente il tubo (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g) a temperatura ambiente per raccogliere il contenuto sul fondo del tubo.
- Posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato al punto 2.1.
- Quando il programma è completo, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Aggiungere 0,8 μL della soluzione di neutralizzazione dal kit alla miscela. Mescolare per pipettaggio.
- Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).
- Utilizzare direttamente il lisato per la PCR o conservarlo a 4 °C o -20 °C per un uso futuro.
NOTA: Il DNA estratto è stabile a 4 °C o -20 °C per almeno 6 mesi7.
3. Estrazione del DNA di alcuni individui
NOTA: Questo metodo è utile per estrarre il DNA da alcuni vermi. Un mix master può essere preparato se più ceppi verranno lisati contemporaneamente.
- Programmare il termociclatore per un ciclo a 55 °C per 10 min seguito da 95 °C per 3 min (programma di lisi).
- Aliquota 2,0 μL della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 mL su ghiaccio. Aggiungere 0,5 μL della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia di soluzione di estrazione. Mescolare per pipettaggio.
- Identificare L4 o animali adulti sotto un microscopio di dissezione9. Gli ermafroditi L4 hanno una caratteristica vulva che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Gli ermafroditi adulti sono gli animali più grandi sul piatto e possono avere embrioni ovali visibili nel loro utero.
- Usando un plettro di platino, trasferisci alcuni animali nella soluzione: 9 animali producono 1 equivalente animale di DNA genomico per 0,5 μL di lisato e 16 animali producono ~ 1 equivalente animale di DNA genomico in 0,25 μL (3,5 nematodi / μL) 10.
NOTA: è difficile trasferire più di 16 animali in questo volume. - Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).
- Posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato al punto 3.1.
- Quando il programma è completo, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Aggiungere 2 μL della soluzione di neutralizzazione dal kit alla miscela. Mescolare per pipettaggio.
- Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).
- Utilizzare direttamente la lisi per la PCR o conservarla a 4 °C o -20 °C per un uso futuro.
NOTA: Il DNA estratto è stabile a 4 °C o -20 °C per almeno 6 mesi7.
4. Reazione PCR
NOTA: viene descritta un'applicazione a valle di questa tecnica di lisi del verme, che rileva una mutazione di delezione utilizzando una polimerasi veloce. Viene anche dimostrata l'efficacia dei due protocolli di lisi dei vermi nella produzione di DNA modello genomico per una PCR di successo a diluizioni a 1/50 di un verme per reazione.
- Estrarre il DNA da un singolo verme e 16 vermi utilizzando N2 wild-type e ceppi mutanti, come descritto sopra nella fase 2 e nella fase 3.
- Preparare diluizioni di 2, 10, 20 e 50 volte del DNA di un singolo verme da animali N2 selvatici.
- Impostare le reazioni PCR seguendo il protocollo del produttore utilizzando primer specifici per la sequenza di interesse e la miscela master PCR a caldo (Tabella 1 e Tabella 2). Utilizzare 1 μL di DNA non diluito o 2 μL di DNA diluito come modello in ogni reazione.
- Confermare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel e imaging11.
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Representative Results
Il DNA genomico di uno o pochi adulti wild-type è stato estratto utilizzando il kit commerciale o il protocollo di lisi tradizionale per confrontare l'efficacia di questi due metodi. Questi lisati sono stati poi utilizzati come modelli per la PCR per amplificare un target più grande di ~ 2.100 bp (codifica blmp-1) o un target più piccolo di ~ 500 bp (codificando una parte di sma-10). Entrambi i metodi hanno prodotto con successo prodotti PCR appropriati (Figura 1A).
Successivamente, è stata dimostrata la capacità del DNA genomico estratto da kit di fungere da modello per una varietà di DNA polimerasi. Il DNA genomico estratto è stato utilizzato come modello per amplificare un prodotto da 0,5 kb utilizzando quattro polimerasi che possiedono diverse capacità (tra cui velocità, fedeltà e dimensioni del prodotto). I prodotti di dimensioni previste sono stati generati da queste polimerasi utilizzando il modello di una lisi di un singolo adulto o di una lisi di nove adulti (Figura 1B). La sequenza del modello e la fedeltà delle polimerasi PCR per amplificare correttamente la sequenza del modello possono essere confermate dal sequenziamento (Figura supplementare S1). Questo risultato dimostra che il DNA genomico estratto dai protocolli del kit fornisce un modello adatto per una gamma di polimerasi.
L'efficacia della PCR è stata testata utilizzando diverse concentrazioni del DNA genomico estratto da un singolo animale utilizzando il kit commerciale. Il DNA è stato diluito di 2, 10, 20 o 50 volte, e l'equivalente di circa la metà, un decimo, un ventesimo e un cinquantesimo di un verme per reazione è stato utilizzato per le PCR. Queste concentrazioni di modelli di DNA supportavano l'amplificazione di un target più grande di ~2,1 kb o di un target più piccolo di ~0,5 kb (Figura 1C)12. Mentre è stata osservata una resa dipendente dalla concentrazione di DNA del prodotto PCR da 0,5 kb, la resa del prodotto PCR da 2,1 kb è apparsa equivalente in tutte le reazioni.
Per dimostrare che questi protocolli producono DNA genomico da C. elegans che è adatto per la genotipizzazione PCR, il DNA genomico è stato estratto da mutanti singoli e 16 wild-type e blmp-1 loss-of-function (blmp-1(tm548)). Il gene blmp-1 codifica per un fattore di trascrizione con ruoli importanti nella migrazione delle cellule della punta distale, nelle dimensioni corporee e nello sviluppo 12,13,14,15,16. Il mutante blmp-1 ha una delezione di 810 bp che rimuove parti dell'esone 3 e dell'introne 315. Sono stati progettati primer che si traducono in un prodotto da 2.134 bp quando viene utilizzato il modello di DNA wild-type e un prodotto da 1.324 bp se viene utilizzato il DNA blmp-1 (-). I prodotti PCR delle dimensioni appropriate sono stati rilevati utilizzando 1 μL di singolo verme (circa 0,5 vermi per reazione) o lisi a 16 vermi da animali in stadio L4 (3,5 vermi per reazione) (Figura 1D). Questo risultato mostra che il DNA genomico estratto da kit utilizzando entrambi i protocolli fornisce modelli altrettanto efficaci per la PCR alle linee di genotipo.
Questi risultati mostrano che i preparati di DNA genomico di C. elegans che utilizzano un kit commerciale di estrazione del DNA tissutale da animali singoli e multipli possono essere utilizzati in modo affidabile come modelli per la PCR.
Figura 1: I preparati di DNA che utilizzano un kit commerciale da singoli nematodi e più nematodi consentono una robusta amplificazione mediante PCR. I prodotti PCR sono stati caricati su gel di agarosio all'1% in 1x tampone TAE (5 μL (A, B) o 10 μL (C, D) e funzionano a 90-100 V per 30 minuti a 2 ore. Una scala del DNA a 2 tronchi è stata utilizzata per tutti i gel. (A) Confronto della lisi del DNA mediante kit con i metodi tradizionali della proteinasi K per creare un modello utilizzando due set di primer. Gli adulti selvatici sono stati lisati e l'equivalente di un animale è stato usato come modello per tutte le reazioni. Corsie 1-4, prodotto 2.1 kb. Corsia 1, PCR da lisi a singolo verme da proteinasi K. Lane 2, PCR da lisi a singolo verme con il metodo kit. Lane 3, PCR da lisi del verme a nove vermi dalla proteinasi K. Lane 4, PCR dalla lisi del verme a nove vermi con il metodo kit. Corsie 5-8, prodotto 0.5 kb. Lane 5, PCR da lisi a singolo verme da proteinasi K. Lane 6, PCR da lisi a verme singolo con il metodo kit. Lane 7, PCR da lisi del verme a nove vermi dalla proteinasi K. Lane 8, PCR dalla lisi del verme a nove vermi con il metodo kit. (B) Il metodo kit per la lisi del DNA fornisce un modello adatto per la PCR da più polimerasi. Gli adulti selvatici sono stati lisati usando il metodo del kit e l'equivalente della metà di un animale è stato usato come modello PCR per un prodotto da 0,5 kb. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli della polimerasi. Corsia 1, PCR da una lisi a verme singolo con una polimerasi ad alta velocità. Corsia 2, PCR da una lisi a nove vermi con una polimerasi ad alta velocità. Corsia 3, PCR da una lisi a verme singolo con una polimerasi Taq . Corsia 4, PCR da una lisi a nove vermi con una Taq polimerasi. Lane 5, PCR da una lisi a verme singolo con una polimerasi ad alta fedeltà. Lane 6, PCR da una lisi a nove vermi con una polimerasi ad alta fedeltà. Corsia 7, PCR da una lisi a verme singolo con una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà. Lane 8, PCR da una lisi a nove vermi con una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà. (C) Le diluizioni di una lisi del verme L4 wild-type forniscono un modello per la PCR. Corsie 1-5, prodotto 2.1 kb. Corsie 6-10, target 0.5 kb. Corsia 1 e corsia 6, DNA non diluito. Corsia 2 e corsia 7, DNA diluito 2 volte. Corsia 3 e corsia 8, DNA diluito 10 volte. Corsia 4 e corsia 9, DNA diluito 20 volte. Corsia 5 e corsia 10, DNA diluito 50 volte. (D) Genotipizzazione del locus blmp-1 mediante PCR utilizzando 1 μL di preparati di DNA a singolo e 16 vermi come modello. Corsia 1, PCR da lisi a verme singolo wild-type. Corsia 2, PCR da lisi a verme singolo blmp-1(- ). Corsia 3, PCR da lisi a 16 vermi wild-type. Corsia 4, PCR da lisi blmp-1(-) 16-worm. Abbreviazioni: prep = metodo di preparazione; kb = kilobase; st. = stadio di nematode; = diluizione del DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Bersaglio | Nome del primer | Sequenza | ||
| blmp-1 | inoltrare | GCGTCAGGTAAGTTGTGATA | ||
| inverso | CAGTTATTGCGGCTGTTGTT | |||
| sma-10 · | inoltrare | AATGTGTGGCAAGGAATCG | ||
| inverso | TGTCTGTCCAACGAGAAGTG | |||
| sequenziamento | 1 | CACATCCCGGACGCCTTAAT | ||
| 2 | CTAATTGTTTTCTACCTGGC | |||
Tabella 1: Elenco dei primer.
| Un. | Pol A, Pol B, Pol D | Pol E |
| PCR Master Mix | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Primer in avanti | 0,2 μM (concentrazione finale) | 0,5 μM (concentrazione finale) |
| Primer inverso | 0,2 μM (concentrazione finale) | 0,5 μM (concentrazione finale) |
| modello DNA | variabile | 1 μL |
| Acqua senza nucleasi | a 25 μL | a 25 μL |
| B. | Pol C |
| Buffer PCR 5x | 2,5 μL |
| 10 mM dNTPs | 2,0 μL |
| Primer in avanti | 0,2 μM (concentrazione finale) |
| Primer inverso | 0,2 μM (concentrazione finale) |
| modello DNA | variabile |
| polimerasi | 0,5 μL |
| Acqua senza nucleasi | a 25 μL |
| C. Programma PCR utilizzato per la Figura 1B | ||
| temperatura | Ore | Cicli |
| 98 °C | 2 minuti | 1 |
| 98 °C | 1 min | 30 |
| 55 °C | 1 min | |
| 72 °C | 1 min | |
| 72 °C | 1 min | 1 |
| 4 °C | tenere | |
| D. Programma PCR utilizzato per la Figura supplementare S1 | ||
| temperatura | Ore | Cicli |
| 98 °C | 30 anni | 1 |
| 98 °C | 10 s | 30 |
| 57 °C | 20 anni | |
| 72 °C | 50 anni | |
| 72 °C | 2 minuti | 1 |
| 4 °C | tenere | |
Tabella 2: Componenti di reazione PCR.
Figura supplementare S1: Sequenziamento per la conferma della qualità del DNA genomico preparato con un kit commerciale. I risultati di due reazioni di sequenziamento corrispondono completamente alla sequenza attesa di oltre 1.600 nucleotidi di DNA amplificati da una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà (Pol E) da una lisi a 16 vermi (Tabella 1, Tabella 2A e Tabella 2D). Le estremità di lettura di sequenziamento sono state tagliate per rimuovere le letture di base di bassa qualità. L'allineamento è stato eseguito utilizzando lo strumento di allineamento a sequenza multipla EMBL-EBI MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Determinare i genotipi di C. elegans è un passo importante durante l'esecuzione di incroci genetici per creare nuovi ceppi di C. elegans . L'estrazione del DNA genomico utilizzando una o poche C. elegans è un passo cruciale nella genotipizzazione di C. elegans. Questo protocollo descrive l'estrazione del DNA genomico da C. elegans utilizzando un kit commerciale. Questo metodo è veloce e funziona in modo robusto. Il DNA genomico estratto con questo metodo può essere utilizzato per applicazioni a valle, tra cui genotipizzazione, sequenziamento e clonazione. Il metodo di estrazione del DNA descritto è stato ottimizzato per la genotipizzazione di incroci genetici di C. elegans utilizzando singoli e pochi L4 o animali adulti come materiale di partenza per il modello di DNA. L'equivalente di un cinquantesimo di un animale (Figura 1C) a 3,5 animali (Figura 1D) ha fornito un modello adatto per amplificare le sequenze di DNA bersaglio mediante PCR. Questo protocollo (con diluizione) produce un modello sufficiente (a 2 μL/reazione) per un massimo di 45 reazioni da un singolo verme e per 100 reazioni da 16 animali. Anche utilizzando un verme per reazione, questi protocolli forniscono un modo economico per estrarre il DNA da C. elegans. Data la semplicità, la robustezza e la rapidità del protocollo, è adatto sia per la ricerca che per le applicazioni in classe.
Poiché il protocollo prevede il pipettaggio di piccoli volumi di reagenti, si raccomanda la preparazione di una miscela principale per reazioni multiple, una buona tecnica di pipettaggio e l'uso di pipette ben calibrate per garantire la coerenza. L'uso di 0,5-1 μL di modello di DNA non diluito da lise singole o 9-16 animali di solito funziona per una reazione PCR da 25 μL utilizzando un mix master PCR a caldo, ma potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione della concentrazione del modello. I reagenti devono essere mantenuti sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento. Per evitare ripetuti congelamenti delle soluzioni di estrazione del DNA, che possono ridurre le prestazioni enzimatiche, si raccomanda di aliquotare i reagenti e di conservarli a -20 °C.
Per le applicazioni a valle che richiedono pcr, l'uso di una miscela master PCR ad alta velocità ad avvio a caldo riduce ulteriormente il tempo totale rispetto alla miscela di reazione PCR fornita nel kit di tessuto commerciale. Le polimerasi ad alta velocità possono amplificare prodotti inferiori a 1 kb in 5-10 s (vedere la Tabella dei materiali e la Tabella 2 per le descrizioni della polimerasi), mentre la miscela di reazione PCR del kit utilizza una DNA polimerasi Taq con una velocità di amplificazione di ~ 1 kb / min7. I prodotti di alcune PCR possono essere caricati direttamente in un gel di agarosio per l'elettroforesi, riducendo ulteriormente i passaggi e i tempi. Questo tampone di reazione è anche compatibile con la digestione enzimatica di restrizione. Le DNA polimerasi ad alta fedeltà funzionano anche in modo robusto con il DNA estratto utilizzando questo protocollo (Figura 1B). Mentre le polimerasi utilizzate hanno lavorato costantemente utilizzando il modello estratto dal kit, l'uso di altre polimerasi può fornire risultati migliori a seconda del modello, delle proprietà del set di primer, delle dimensioni del prodotto e della fedeltà richiesta. Se si riscontrano problemi a seguito della PCR, come l'assenza di banda target amplificata o bande aggiuntive amplificate, potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di lavoro del primer o della concentrazione del modello di DNA. Si raccomanda vivamente di utilizzare controlli appropriati, tra cui il modello di DNA wild-type e l'uso di primer che hanno dimostrato di funzionare.
Questo metodo non sarà adatto per applicazioni che richiedono un modello altamente purificato o ad alta resa di DNA. Mentre il numero di animali preparati e il volume di reazione possono essere aumentati, il DNA preparato con questo metodo non è separato dai detriti dell'organismo e potrebbe non essere abbastanza puro per applicazioni altamente sensibili come il sequenziamento dell'intero genoma.
I principali vantaggi di questo metodo rispetto ai metodi tradizionali di estrazione del DNA genomico esistenti includono il tempo più breve e passaggi più semplici e facili. In futuro, questo metodo potrebbe essere scalato, adattato per estrarre il DNA genomico di C. elegans per altre applicazioni a valle e utilizzato per estrarre il DNA da altre specie di nematodi.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Il ceppo N2 e i batteri E. coli OP50 sono stati ottenuti dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Il ceppo blmp-1(tm548) è stato ottenuto dal National Bioresource Project, Giappone. Gli autori ringraziano WormBase. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01GM097591 a T.L.G., finanziamenti interni dalla Texas Woman's University a T.L.G e dal Center for Student Research di TWU a M.F.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
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