Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

מחקרים תרמוכימיים של קומפלקסים טרנריים Ni(II) ו-Zn(II) באמצעות ספקטרומטריית ניידות-מסה של יונים

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63722
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Texas A&M University-Commerce, 2Laboratoire de Chimie Théorique, Sorbonne Université

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול ניסיוני המשתמש בספקטרומטריית מסות-ניידות אלקטרו-יונים, חישובים קוונטיים אמפיריים למחצה ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות סף הנפתרת על-ידי אנרגיה, כדי למדוד את התרמוכימיה היחסית של הדיסוציאציה של קומפלקסים של מתכות טרנריות קשורות.

Abstract

מאמר זה מתאר פרוטוקול ניסיוני המשתמש בספקטרומטריית מסות-ניידות של יונים אלקטרוספריים (ES-IM-MS) ובדיסוציאציה הנגרמת על-ידי התנגשות באנרגיה (TCID) כדי למדוד את התרמוכימיה של הדיסוציאציה של [amb+M(II)+NTA]- קומפלקסים טרנריים לשני ערוצי מכפלה: [amb+M(II)] + NTA או [NTA+M(II)]-  + amb, כאשר M = Zn או Ni ו- NTA היא חומצה ניטרילוטריאצטית. הקומפלקסים מכילים את אחד מההפטפטפטידים החלופיים לקשירת מתכת (amb) עם המבנים הראשוניים אצטיל-שלו 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7 או אצטיל-Asp 1-Cys2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7, כאשר חומצות האמינו Aa 1,2,6,7 עמדות הן אתרי קשירת המתכת הפוטנציאליים. מצבים נייחים מותאמים לגיאומטריה של קומפלקסים טרנריים ומוצריהם נבחרו מחישובי כימיה קוונטית (כיום המילטוניאן החצי אמפירי PM6) על ידי השוואת האנרגיות האלקטרוניות שלהם וחתכי ההתנגשות שלהם (CCS) לאלה שנמדדו על ידי ES-IM-MS. מחישובי התדרים של PM6, הפרמטרים המולקולריים של הקומפלקס הטרנרי ותוצריו מדגימים את העוצמות התלויות באנרגיה של שני ערוצי המוצר באמצעות שיטת TCID תחרותית כדי לקבוע את אנרגיות הסף של התגובות המתייחסות לאנתלפיות 0 K של דיסוציאציה (ΔH0). מכניקה סטטיסטית תיקונים תרמיים ואנטרופיה באמצעות תדרי סיבוב ורטט PM6 מספקים את 298 K אנתלפיות של דיסוציאציה (ΔH298). שיטות אלה מתארות שגרת EI-IM-MS שיכולה לקבוע קבועי תרמוכימיה ושיווי משקל עבור מגוון קומפלקסים של יוני מתכת טרנריים.

Introduction

מחקר זה מתאר טכניקה חדשה המשתמשת בספקטרומטר ניידות-מסה של יונים הזמין באופן מסחרי, המאפשר לקבוע את התרמוכימיה היחסית לדיסוציאציה של קומפלקס מתכת חלופי (amb) של מתכת טרנרית [amb+M(II)+NTA], כאשר M = Zn או Ni ו-NTA = חומצה ניטרילוטריאלית (איור 1). תגובות אלה מדגימות את הדיסוציאציה של החלבון הרקומביננטי המתויג כ-amb המוצמד למתכת המשותקת על-ידי NTA במהלך כרומטוגרפיה של זיקת מתכת משותקת (IMAC)1,2. לדוגמה, שיטה זו מתוארת באמצעות תגי הפטפטפטיד amb של amb A ו- H (איור 2) (שנבחרו ממחקרים קודמים 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ) המציגים תכונות מחייבות Zn(II) ו- Ni(II), ולכן יש להם יישומים פוטנציאליים כתגי טיהור. עם זאת, התהליך המתואר יכול לשמש להערכת אנרגיות תרמוכימיות בכל מערכת אורגנומטלית. לפפטידים אמביים אלה יש אתרי קשירת מתכת בעמדות Aa1-Aa 2 ו-Aa6-Aa 7 המתחרים באתרי הקרבוקסילאט והאמין של ה-NTA. שלוש חומצות האמינו המרכזיות של אמב מספקות ספייסר (Gly3), ציר לשתי הזרועות (Pro4) ואינטראקציה בין קטיון π מתכות למרחקים ארוכים (Tyr5).

מצב המטען הכולל של 1− של קומפלקסי [amb+M(II)+NTA]- נקבע על ידי מצב הפרוטונציה של אתרי הקישור הפוטנציאליים שלהם. מכיוון שיש Ni(II) או Zn(II) עם מצב החמצון 2+, חייבת להיות רשת של שלושה אתרים טעונים שלילית. המידול המולקולרי של קומפלקסי [amb+M(II)+NTA]- מנבא שמדובר בשני פרוטונים מה-NTA ובפרוטון אחד מה-amb (כלומר, [amb-H+M(II)+NTA-2H]-). ערוצי המוצר מכילים מין יוני ומין נייטרלי (כלומר, [NTA-3H+M(II)]- + amb או [amb-3H+M(II)]- + NTA). בכתב היד, "-3H" אינו נכלל בשמות הקומפלקסים, אך הקורא צריך לדעת כי -3H משתמע. המכשיר מודד את העוצמות היחסיות של שני מיני המסה למטען היוניים (m/z). תכונה מרכזית של ניתוחי ES-IM-MS היא שהיא מאפשרת לבחון את התגובה של מין m/z מסוים, כפי שנעשה כאן ובמחקרים קודמים של amb 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

רכישת נתונים תרמוכימיים עבור קומפלקסים גדולים באמצעות דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות היא נושא בעל עניין משמעותי13,14. מתודולוגיות הכוללות את השיטה הקינטית אינן תורמות להתאמת נתונים על פני מגוון אנרגיות, והן גם אינן לוקחות בחשבון סביבות מרובות התנגשויות15,16,17,18. כאן, שיטת הסף CID (TCID), שפותחה באמצעות ספקטרומטריית מסה טנדם מונחית של קרן יונים על ידי ארמנטרוט, ארווין ורוג'רס, מיושמת19 על פלטפורמת מכשירים חדשה ES-IM-MS המשתמשת במדריכי יונים של גלים נעים. שיטת TCID מאפשרת אנליזה תרמוכימית יחסית של הדיסוציאציה של הקומפלקסים הטרנריים לשני ערוצי המכפלה שלהם וכוללת חוק סף המתאר את העברת אנרגיית ההתנגשות בין האנרגיה התרגומית של המגיב (קומפלקס טרנרי במחקר זה) לבין גז מטרה אינרטי (ארגון במקרה זה). השיטה כוללת אינטגרציה על התפלגות האנרגיה הפנימית של המגיב20, התפלגויות האנרגיה התרגומיות בין המגיב לגז המטרה 21, והתפלגות התנע הזוויתי הכוללת22,23. הסתברות דיסוציאציה ותיקון סטטיסטי של רייס-רמספרגר-קאסל-מרקוס (RRKM) של התזוזות הקינטיות הנובעות מחלון הזמן המוגבל לתצפית על התוצרים כלולים24. עבור שני ערוצי מוצרים עצמאיים, שיטת TCID התחרותית מאפשרת התאמה בו זמנית של שני ערוצי המוצרים המתחרים. דיסוציאציה של הקומפלקס היא באמצעות מצב מעבר מקיף, אשר יש את התכונות של המכפלות אבל מוחזק יחד על ידי דיפול נעול25. שיטת TCID משולבת בתוכנית CRUNCH26, ופעולת ממשק המשתמש מתוארת כאן כדי להעריך את התרמוכימיה של שני ערוצי הדיסוציאציה של הקומפלקסים הטרנריים [amb+M(II)+NTA]. תוכנית CRUNCH זמינה על פי בקשה מהמפתחים26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: איור 1 מציג סקירה כללית של הפרוטוקול.

1. הכנת ריאגנטים

  1. רכשו פפטידים אמביים מיובשים בהקפאה (טוהר >98%) ואחסנו אותם במקפיא של 80 מעלות צלזיוס.
  2. רכוש אבץ >99% טוהר(II) הקסהידרט חנקתי וניקל(II) חנקתי הקסהידרט.
    אזהרה: ניקל(II) חנקתי הקסהידרט מהווה סכנה סביבתית ובריאותית.
  3. רכשו את החומצה הניטרילוטריאצטית, פולימרים פולי-DL-אלנין, אמוניום אצטט באיכות מתכת אולטרה-טהורה/קורט, אמוניום הידרוקסיד, חומצה אצטית קרחונית ואצטוניטריל בדרגה HPLC.

2. הכנת פתרונות מלאי

  1. פתרון מלאי אמב פפטידי
    1. הכן תמיסה מימית של ריכוז 12.5 mM amb על ידי שקילת 10-20 מ"ג של פפטיד מיובש בהקפאה באמצעות לא פחות משלוש דמויות משמעותיות והצבתו בצינור מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן 1.7 מ"ל.
    2. הוסף את הנפח המתאים של מים שעברו דה-יוניזציה (>17.8 MΩ ס"מ) לצינור המיקרוצנטריפוגה. סוגרים את המכסה ומערבבים היטב עם לפחות 20 היפוכים.
    3. צור 50 μL aliquots מתמיסת amb 12.5 mM והכנס אותם לתוך צינורות microcentrifuge מסומן 1.7 מ"ל. אחסן את פתרונות המלאי של aliquot ב- −80 °C.
  2. פתרונות מלאי יוני מתכת
    1. הכן את תמיסות Zn(II) ו- Ni(II) המימיות של ריכוז 12.5 mM על ידי שקילת 10-30 מ"ג של הקסהידרט חנקתי מתכתי באמצעות לא פחות משלוש דמויות משמעותיות והצבתו בצינור מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן 1.7 מ"ל.
    2. הוסף את הכמות המתאימה של מי DI לצינור המיקרוצנטריפוגה. סוגרים את המכסה ומערבבים היטב עם לפחות 20 היפוכים. אחסן פתרונות מלאי של 50 μL aliquot בטמפרטורה של −80 °C.
  3. פתרונות מלאי יונים של נת"ע
    1. הכן תמיסת NTA מימית על ידי שקילת 10-30 מ"ג של NTA באמצעות לא פחות משלוש דמויות משמעותיות והצבתו בצינור microcentrifuge 1.7 מ"ל.
    2. הוסף את הכמות המתאימה של מי DI ל- NTA בצינור המיקרוצנטריפוגה כדי להשיג ריכוז סופי של 12.5 mM. סוגרים את המכסה ומערבבים היטב עם לפחות 20 היפוכים. אחסן פתרונות מלאי של 50 μL aliquot בטמפרטורה של −80 °C.
  4. תמיסות מלאי אמוניום אצטט: שקלו 30.8 מ"ג אמוניום אצטט והוסיפו ל-40 מ"ל של מי DI כדי להניב תמיסה של 10 מ"מ. התאם את ה- pH של תמיסת האמוניום אצטט ל- pH 7.7 עם אמוניום הידרוקסיד של 1 mM.
  5. תמיסת מלאי Poly-DL-אלנין: הכינו תמיסת מלאי פולי-DL-אלנין (PA) של 1 מ"ל, 1,000 ppm על-ידי המסת 1.0 מ"ג PA במי DI. מערבבים באופן מקיף. צור 50 μL aliquots והכנס אותם לתוך צינורות microcentrifuge מסומנים בנפרד. אחסן את הפתרון של 1,000 עמודים לדקה ב- −80 °C.

3. ספקטרומטריית ניידות אלקטרו-יון-מסה (ES-IM-MS) ניתוח דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID)

  1. הכן את המכשיר על ידי ניקוי צינורות כניסת ES ונימי מתכת על ידי הזרקת 500 μL של 0.1 M חומצה אצטית קרחונית, לאחר מכן 500 μL של 0.1 M אמוניום הידרוקסיד, ולבסוף 500 μL של pH 7.7 אמוניום אצטט.
  2. יש לנזול את תמיסת מלאי ה-amb של 12.5 mM על-ידי הבאתה לטמפרטורת החדר. צור ריכוז סופי של 0.125 mM amb על-ידי ביצוע שני דילולים רצופים עם מי DI. מערבבים באופן מקיף לאחר כל דילול.
  3. יש לנזול את תמיסת יוני המתכת בנפח 12.5 mM על-ידי הבאתה לטמפרטורת החדר. צור ריכוז סופי של 0.125 mM יון מתכת על ידי ביצוע שני דילולים רצופים עם מי DI. מערבבים באופן מקיף לאחר כל דילול.
  4. לנזול את תמיסת המניות של 12.5 mM NTA. צור ריכוז סופי של 0.125 mM NTA על ידי ביצוע שני דילולים רצופים עם מי DI. מערבבים באופן מקיף לאחר כל דילול.
  5. כדי ליצור דגימה של 2 מ"ל של הקומפלקס הטרנרי, הוסף 800 μL של תמיסת NTA של 0.125 mM ו- 400 μL של תמיסת יוני מתכת 0.125 לצינור microcentrifuge של 2 מ"ל, וערבב היטב עם לפחות 20 היפוכים. הוסף 400 μL של תמיסת אמוניום אצטט (pH 7.7) ו- 400 μL של תמיסת amb של 0.125 mM, ערבב היטב עם לפחות 20 היפוכים, ואפשר לדגימה שיווי משקל למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. טען את דגימת ה-2 מ"ל לתוך מזרק אף קהה של 2.5 מ"ל והזרק את הדגימה לתוך ה-ES של המכשיר באמצעות משאבת המזרק של המכשיר בזרימה של 10 μL/min.
  7. מקם את המכשיר במצב IM-MS שלילי. השתמש בתנאי ההפעלה האופייניים של המכשיר27 עבור ניסויים אלה כדלקמן.
    1. הזריקו את הדגימה בקצב זרימה של 10 μL/min לתוך נימי ES המוחזקים ב-−2 kV עם קצב זרימת ההמסה של 500 L/h של חנקן. הגדר את מקור ES ואת טמפרטורות ההשחתה ל 130 °C ו 263 °C, בהתאמה. הגדר את חרוטי הדגימה והמיצוי ל- 25 V ו- 3 V, בהתאמה.
    2. עבור ניסויי CID, השתמש במנתח המסה המרובעת כדי לבחור את התבנית האיזוטופית של [amb+M(II)+NTA]- קומפלקס טרנרי באמצעות m/z של השיא המונואיזוטופי עם הגדרות רזולוציה של מסה נמוכה = 4.5 ומסה גבוהה = 16.5.
      הערה: היונים [amb+M(II)+NTA]- מועברים לשלושת מדריכי היונים העוקבים של שלושת הגלים הנודדים (T-wave ).
    3. ודא שלגל המלכודת יש זרימת גז ארגון של 3 מ"ל/דקה ולחץ של 2.83 x 10-2 mbar. הגדר את אנרגיית ההתנגשות (CE) למלכודת ב-5 V כדי למנוע כל דיסוציאציה של הקומפלקס הטרנרי. תן למלכודת לאסוף את היונים המורכבים הטרנריים לפני שתשחרר אותם (זמן שחרור של 200 μs) למדריך היונים של ניידות יונים (IM) באמצעות הטיית DC מלכודת של 14 V, אשר שומרת על דיסוציאציה של הקומפלקס בכניסה ל- IM למינימום.
    4. ודא שלמדריך היונים המיידיים יש לחץ של 0.507 mbar באמצעות קצב זרימה של 20 מ"ל/דקה של גז חיץ N2 אולטרה-טהור. הגבר את גלי ה- T ב- IM עם גבהים של 7 V עד 30 V ועם מהירויות של 290 m/s עד 801 m/s עבור כל טאטוא התחלה וסיום של מדריך יוני ה- IM.
    5. הגדר את זרימת הארגון והלחץ של גל ההעברה T זהים לגל ה- T של המלכודת. גל ההעברה T שימש לדיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות של קומפלקס הטרנרי [amb+M(II)+NTA]- באמצעות ההעברה CE.
  8. בחר את תבנית האיזוטופים m/z של קומפלקס [amb+M(II)+NTA] הטעון שלילית באמצעות מרובע השידור במצב פתרון.
    1. זהה את תבנית האיזוטופים m/z על-ידי פתיחת תוכנית ספקטרומטריית המסות ובחירה בספקטרום. בחר כלים > מודל איזוטופ. בחלון המוקפץ, רשום את הנוסחה המולקולרית של המתחם, סמן את התיבה עבור הצג יון טעון, הזן 1 עבור המטען של אחד שלילי ולחץ על אישור.
    2. בתבנית האיזוטופים המוצגת של המתחם, שימו לב לשיא המסה הנמוך ביותר. בתוכנת המכשיר, בחר הגדרה > פרופיל מרובע. בחלון שנפתח, בחר ידני קבוע והזן את המסה של שיא התבנית האיזוטופית הנמוכה ביותר. לחץ על עדכן ולאחר מכן על סגור.
    3. בחר הגדרה שוב ולאחר מכן לחץ על פתרון מרובע. אסוף את היון השלילי ES-IM-MS SPECTRA בהדרגה על פני טווח של אנרגיות התנגשות העברה באמצעות משך ריצה של 5 דקות וזמן סריקה של 2 שניות.
      הערה: ניתן לבדוק אנרגיות העברה ראשוניות מ-26-60 וולט במרווחים של 2 וולט. הטווח הסופי של אנרגיות התנגשות העברה שנבחנו לא אמור להדגים דיסוציאציה של הקומפלקס הטרנרי באנרגיה הנמוכה ביותר ודיסוציאציה מלאה לתוצרים באנרגיה הגבוהה ביותר. עבור ניתוח סטטיסטי באיכות גבוהה, ניתוח ES-IM-MS זה צריך להתבצע עבור כל קומפלקס amb ternary לפחות 3x על ידי אנשים שונים ובימים שונים כדי לקבוע אמצעים וסטיות תקן.

4. ניתוח חתך התנגשות ES-IM-MS (CCS)

  1. נקו את צינורות הכניסה של ES ואת נימי המתכת עם 500 μL של 0.1 M חומצה אצטית קרחונית, לאחר מכן 500 μL של 0.1 M אמוניום הידרוקסיד, ולבסוף 500 μL של pH 7.7 אמוניום אצטט תמיסה.
  2. לנזול את תמיסת מלאי PA של 1,000 ppm לטמפרטורת החדר ולבצע שני דילולים סדרתיים; יש לדלל ל-PA של 100 ppm עם מי DI, ולאחר מכן לדלל לתמיסת PA של 10 ppm על-ידי דילול ביחס של 1:1 של מי DI ואצטוניטריל ברמת HPLC.
  3. אסוף את ספקטרום ה- IM-MS השלילי של דגימת PA של 10 ppm למשך 10 דקות באמצעות תנאי הפעלה אינסטרומנטליים.
    הערה: קצב זרימת ההזרקה ותנאי מקור ES היו זהים לאלה של ניסויי CID (שלב 3). לצורך מדידות של ה-CCS, מנתח המסה המרובעת היה במצב אי-פירוק והעביר את כל היונים לשלושת קווי העזר הרציפים של יוני גל T. פעולתם של מדריכי יוני גלי ה-T וה-IM T-wave הייתה זהה לזו של ניסויי ה-CID. אנרגיית ההתנגשות של תא גל ה-T ההעברה הייתה ב-4 וולט כדי לאפשר ליונים לעבור ללא דיסוציאציה.
  4. הכן כל אחד מהקומפלקסים הטרנריים כמתואר בשלבים 3.2.-3.6.
  5. אסוף את ספקטרום IM-MS של כל קומפלקס טרנרי למשך 5 דקות.
    הערה: השתמש באותם תנאים אינסטרומנטליים כמו בשלב 4.3.
  6. אסוף את ספקטרום היונים השליליים IM-MS של דגימת PA של 10 ppm למשך 10 דקות.
    הערה: ממוצע זמני ההגעה של כיולי הרשות הפלסטינית שנאספו לפני ואחרי מתחמי ה-amb ternary משמשים בקביעת CCS.

5. ניתוח נתוני ES-IM-MS CID

  1. זהה את המין על ידי התאמת תבניות האיזוטופים התיאורטיים m/z של הקומפלקס הטרנרי ותוצריו לספקטרום IM-MS הניסיוני.
    1. פתח את תוכנית ספקטרומטריית המסה ובחר Chromatogram כדי לפתוח חלון חדש.
    2. בחלון Chromatogram , לחץ על קובץ > לפתוח כדי למצוא ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS הרצוי.
    3. לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, גררו לרוחב הכרומטוגרמה ושחררו. ספקטרום MS יוצג בחלון ספקטרום נפרד.
    4. בחלון החדש המציג את הספקטרה, בחר כלים > מודל איזוטופ. חלון קטן יופיע. הזן את הנוסחה המולקולרית של מיני ה-amb, סמן את התיבה הצג יון טעון והזן את מצב המטען הרצוי. לחץ על OK.
    5. כדי להבחין בין כל המינים בספקטרום IM-MS, חזור על תהליך זה בחלון הספקטרום ותעד את טווח האיזוטופים m/z שלהם.
  2. עבור קומפלקס האמב הטרנרי ומוצריו, השתמש בטווח האיזוטופים m/z שלהם כדי לזהות אותם ולחלץ את התפלגויות זמן ההגעה שלהם (ATD).
    1. פתח את תוכנת הפרדת ניידות היונים ובחר קובץ > פתח כדי לחפש ולפתוח את קובץ הנתונים.
    2. לחץ לחיצה ימנית וגרור עם העכבר כדי להגדיל את טווח האיזוטופים m/z של הקומפלקס הטרנרי [amb+M(II)+NTA]-.
    3. בעזרת הכלי בחירה , לחצו לחיצה ימנית וגררו כדי לבחור את טווח האיזוטופים הספציפי עבור [amb+M(II)+NTA] - כפי שזוהה בשלב 5.1. לחץ על הלחצן קבל את הבחירה הנוכחית .
    4. כדי לסלק כל מין m/z מקרי או אות רקע, השתמש בכלי הבחירה כדי לבחור את ה- ATD המשויך לקומפלקס הטרנרי. לחץ על הלחצן קבל את הבחירה הנוכחית .
    5. כדי לייצא את קובץ ה- ATD לתוכנת ספקטרומטריית המסות, עבור אל ייצוא > קבצים ולאחר מכן לחץ על שמור על זמן סחף. שנה את שם הקובץ אם תרצה ושמור את הקובץ בתיקייה המתאימה.
  3. לקבוע על ידי אינטגרציה של האזור תחת עקומת ATD שחולצה את עוצמתו היחסית של המין.
    1. בחלון Chromatogram , פתח את הקובץ המיוצא שנשמר מתוכנת הפרדת ניידות היונים. בחר תהליך ולאחר מכן שלב. השתמש בהגדרת משרעת שיא לשיא של 20 ולחץ על אישור.
    2. הקלט את האזור המשולב כפי שמוצג בחלון הכרומטוגרמה. חזור על שלבים 5.2.2.-5.2.5. עבור שני המוצרים, כלומר [NTA+M(II)]- ו-[amb+M(II)]-.
    3. חזור על שלבים 5.2.1.-5.3.2. עבור כל אנרגיית התנגשות העברה שנרשמה.
  4. השתמש באזורי ה-ATD המשולבים עבור הקומפלקס הטרנרי [amb+M(II)+NTA]- ושני מוצרים [NTA+M(II)]- ו-[amb+M(II)]- בכל נקודת אנרגיה של התנגשות העברה כדי לנרמל לסולם אחוזים יחסי.
    1. צור גיליון אלקטרוני על-ידי הזנת הזהויות של הקומפלקס הטרנרי ומוצריו וה-ATD המשולב שלהם בכל אנרגיית התנגשות.
    2. עבור כל אנרגיית התנגשות, השתמש בסיכום של ה-ATDs המשולבים עבור [amb+M(II)+NTA]-, [NTA+M(II)]-, ו-[amb+M(II)]- כדי לנרמל את ה-ATDs הבודדים שלהם לסולם אחוזים יחסי.
    3. ממדידות TCID המשוכפלות, מצא את הממוצע ואת סטיות התקן של כל נקודת נתונים. המרת אנרגיית ההתנגשות של העברת מסגרת המעבדה (מעבדת E) לאנרגיית ההתנגשות במרכז המסה (E cm) באמצעות המסות הממוצעות של גז ההתנגשות ארגון (m Ar) והקומפלקס הטרנרי (קומפלקס m): Ecm = E lab (m Ar)/(mAr + mcomplex).
      הערה: Ecm מייצג את האנרגיה המרבית מההתנגשות עם גז הארגון, הזמינה לדיסוציאציה של הקומפלקס הטרנרי.
    4. שרטט את הממוצע ואת סטיית התקן של עוצמות האחוזים הבודדות של [amb+M(II)+NTA]-, [NTA+M(II)]-, ו-[amb+M(II)]- בגרף של עוצמה יחסית (%) לעומת אנרגיית התנגשות במרכז המסה (eV) כדי להציג כיצד עוצמות היחס של המין משתנות כפונקציה של אנרגיית התנגשות.

6. ניתוח זמני ההגעה הממוצעים לקביעת חתכי התנגשות (CCS)

  1. פתח את תוכנת הפרדת ניידות היונים ואת הקובץ המכיל את ספקטרום ה- IM-MS של דגימת PA של 10 ppm שנאספה עם אנרגיית התנגשות ההעברה שנקבעה ב- 4 V. חלץ את ה- ATD של כל אחד ממיני ה- PA הטעונים שלילית הבודדים וייצא את הקבצים לתוכנת ספקטרומטריית המסה באמצעות האפשרות שמור על זמן סחיפה (ראה שלב 5.2.5.). חזור על הפעולה עבור קובץ כיול PA השני.
  2. פתח את תוכנת הפרדת ניידות היונים. השתמש בקובץ > פתח כדי לפתוח אחד מהקבצים המכילים את ספקטרום IM-MS של קומפלקסים amb ternary שנרשמו בין כיולי PA. חלץ את ה- ATD של כל אחד מהקומפלקסים הטרנריים וייצא את הקבצים שלהם לתוכנת ספקטרומטריית המסה באמצעות האפשרות שמור על זמן סחיפה (ראה שלב 5.2.5.).
  3. השתמש בשיטת כיול חתך רוחב28 כדי לחשב את CCS של הקומפלקס הטרנרי ומוצריו.
    1. בגיליון אלקטרוני, חשב את ה-CCS המתוקן (Ω c) עבור כל אחד ממיני ה-PA הטעונים שלילית הבודדים מה-CCS שלהם (Ω)29,30 שנמדדו בגז מאגר הליום31 באמצעות משוואה 1, כאשר z = מטען של הקומפלקס הטרנרי, ec = 1.602 x 10−19 C; m N2 = מסת חנקן (u), ויון m = מסה של קומפלקס טרנרי28.
       Equation 1(1)
    2. מצא את זמני הסחיפה (tD) של כיולי PA ואת הקומפלקסים הטרנריים על ידי קבלת זמני ההגעה הממוצעים (tA) מהמקסימה של עקומות ה- ATD המתאימות ולאחר מכן החלת משוואה 2, כאשר c = מקדם עיכוב גלאי (1.41 אלפיות השנייה; בדוק את המכשיר מכיוון שזה יכול להשתנות בין מכשירים) ו- m/z = יחס מסה לטעינה של קומפלקס הכיול PA או ה- amb ternary.
      tD  = t AEquation 2 (2) 
    3. צור גרף על-ידי התוויית t D של כיול הרשות הפלסטינית לעומת Ωc. לאחר מכן, באמצעות משוואה 3, התאם את הנתונים לרגרסיה של פחות ריבועים כדי למצוא את הקבועים A' ו- B, כאשר A' מתקן עבור השדה החשמלי, הטמפרטורה והלחץ במכשיר ו- B מתקן עבור ההתנהגות הלא ליניארית של התקן ה - IM של גל T.
      Ωc = A' tDB (3)
    4. תוך שימוש בקבועי A' ו-B ובערך t D של קומפלקסים אמביים טרנריים, מחשבים אתΩ c שלהם באמצעות משוואה 3 ואת Ω שלהם באמצעות משוואה 1. ערכי CCS המוערכים בשיטה זו כוללים שגיאות מוחלטות של כ- 2%29.

7. שיטות חישוביות

  1. השתמש בשיטת PM632 האמפירית למחצה המיושמת במידול מבני ובתוכנה חישובית33 כדי לאתר קונפורמרים מותאמים לגיאומטריה של [amb+M(II)+NTA]- קומפלקסים טרנריים וזוגות היונים והמכפלות הנייטרליות: [amb+M(II)]- + NTA ו-[NTA+M(II)]- + amb שנצפו מניסויי CID. עיין בשימוש ברכיב המחשה של החישוב בקובץ המשלים לקבלת פרטים על אופן הפיתוח וההגשה של חישובים.
    הערה: עבור המערכות הנוכחיות, שיטת PM6 שיחזרה נכונה נתונים ניסיוניים, אך באופן כללי, ניתן להשתמש בכל שיטה בכימיה קוונטית שהיא אמינה וניתנת לביצוע חישובי.
  2. הפעל אופטימיזציות גיאומטריה וחישובי תדירות על מספר מבני התחלה שונים כדי לחקור קונפורמציות שונות, מצבי פרוטונציה ואתרי קישור פוטנציאליים. רשום את האנרגיות האלקטרוניות + נקודת האפס של כל אחת מהנקודות הנייחות הממוקמות עבור כל אחד מהמתחמים הטרנריים ומוצריהם.
    הערה: המבנים ההתחלתיים של אופטימיזציות הגיאומטריה צריכים לחקור שילובים אפשריים שונים של אתרי קשירה והסדרים קונפורמיים. המבנים ההתחלתיים התבססו על B3LYP34 [amb+M(II)]- קונפורמרים 3,4,6. עבור [amb+M(II)+NTA]-, NTA הוצבה כדי להתחרות באתרים החלופיים של ה-amb ב-Aa1-Aa 2-Aa 6-Aa 7 ובטרמינל הקרבוקסילאט עבור מצב הספין הסינגלט של Zn(II) או מצב הספין המשולש של Ni(II).
  3. השתמש בתוכנית שיכולה לבצע מדידות חתך התנגשות מדויקות כפי שנמדדו בגז חיץ הליום (CCSHe) באמצעות הקואורדינטות האטומיות מחישובים כימיים קוונטיים אלה35.
    הערה: תוכניות שפותחו לחישוב CCSמדויק He ממבנים פפטידיים הממוקמים על ידי חישובים כימיים קוונטיים כוללות את MobCal36 ו- HPCCS37,38.
  4. בחר את הקונפורמר בעל האנרגיה הנמוכה ביותר המציג את ה- CCS Lennard-Jonesהוא מסכים עם ה- CCS שנמדד על ידי IM-MSהוא לבחירת המבנים של קומפלקסים טרנריים ומוצרי דיסוציאציה לכלול במודלים של CRUNCH להלן.

8. דוגמנות קראנץ'

  1. צור קובץ טקסט בתבנית המתוארת בסעיף הדיון ("תבנית קובץ טקסט קלט CRUNCH").
    הערה: הקובץ כולל את העמודות הבאות: (−1) אנרגיית התנגשות במרכז המסה (Ecm), (1) ממוצע העוצמה היחסית של [amb+M(II)]- מכפלה, (2) סטיית תקן של [amb+M(II)]- עוצמה, (3) ממוצע העוצמה היחסית של [NTA+M(II)]- מכפלה, ו-(4) סטיית תקן של [NTA+M(II)]- עוצמה.
  2. דגמו את Eס מ-עוצמות תלויות של שני ערוצי התגובה [amb+M(II)+NTA]-אל [amb+M(II)]- + נת"ע ו[אמב+מ"ב)+נת"ע]- אל [NTA+M(II)]- + amb באמצעות טכניקת TCID בתוכנית CRUNCH.
    הערה: השתמש בתדרי הרטט והסיבוב PM6 עבור הקומפלקס הטרנרי ושני ערוצי היונים והמכפלה הנייטרליים. השתמש במסות ממוצעות של קומפלקס טרנרי, גז התנגשות ארגון, ותוצרי יונים וניטרליים. השתמש בערכים מחישובי PM6 או ממסד הנתונים NIST עבור יכולות הקיטוב (Å3) ומומנטי דיפול (דביי) למוצרים הנייטרליים.
    1. מהתפריט הראשי של CRUNCH, פתח את קובץ הטקסט (. GB5) המכיל את העוצמות היחסיות התלויות בס"מ E של המוצרים. השב לא לקריאת פרמטרים.
    2. מהתפריט הראשי של CRUNCH, בחר מידול > הגדר את כל הפרמטרים. מתוך אפשרויות מודל התגובה, בחר באפשרות ברירת המחדל של סף CID ואחריה RRKM עם אינטגרציה על התפלגות העברת האנרגיה של קומפלקס טרנרי20, הזן 2 עבור ערוצי מוצר עצמאיים במודל ובחר חשב חתכים. הזן לא כדי האם לכל שני ערוצי מוצרים יש את אותה מסת יונים?
    3. עבור ערוץ מוצר # 1, הזן עמודה [1] עבור הנתונים הניסיוניים של [amb+M(II)]- מוצר, עמודה [2] עבור סטיות התקן של [amb+M(II)]- מוצר, עמודה [5] עבור חתך המודל הלא מפותל, ועמודה [6] עבור חתך המודל המפותל. הזן 0 עבור שאריות של התאמה.
      הערה: מספרי עמודות אלה תואמים לעמודות בקובץ הקלט בשלב 8.1. כפי שתואר בדיון ("תבנית קובץ טקסט קלט CRUNCH").
    4. עבור ערוץ מוצר # 2, הזן עמודה [3] עבור נתוני הניסוי של המוצר [NTA+M(II)], עמודה [4] עבור סטיות התקן של [NTA+M(II)]- מוצר, עמודה [7] עבור חתך המודל הלא מפותל, ועמודה [8] עבור חתך המודל המפותל. הזן 0 עבור שאריות של התאמה.
    5. עבור סוג המודל הלא מפותל, בחר חתך רוחב 0 K (כולל הזזה קינטית), הכולל את תיקון RRKM הסטטיסטי של התזוזות הקינטיות עקב חלון הזמן של 50 μs מתא ההתנגשות לגלאי TOF18.
    6. עבור אפשרויות הקונבולוציה, בחר את האינטגרל הכפול של טירנן, הכולל את הקונבולוציה על פני התפלגויות אנרגיה תרגומיות בין יון הקומפלקס הטרנרי לבין גז התנגשות ארגון21.
    7. עבור שיטת האינטגרציה הנומרית, בחר ריבוע גאוס עם חתכים שנשמרו מראש, ואחריו מספר נקודות האינטגרציה = 32, מספר סטיות התקן = 3.0, ומספר סטיות התקן עבור האינטגרל השני = 3.0.
    8. המסה של יון קומפלקס טרנרי (u) נקראת באופן אוטומטי מ- . קובץ טקסט GB5, ואחריו המסה של גז ההתנגשות (39.948 עבור ארגון); השתמש בברירות המחדל של 0.20 eV עבור FWHM של קרן היונים ו- 298.15 K עבור טמפרטורת הגז. התוכנית קוראת באופן אוטומטי את אנרגיות ההתנגשות המינימליות והמקסימליות של מרכז המסה מ- . קובץ טקסט GB5; השתמש בערך ברירת המחדל עבור תוספת האנרגיה המינימלית.
    9. השתמש בערך ברירת המחדל עבור גורם שינוי קנה המידה Sig0, No עבור התרת שינוי קנה מידה של ערוצי מוצרים בודדים, וערכי ברירת המחדל עבור N ו - M. עבור השיטה לחישוב g(i), בחר אינטגרציה על פני צפיפות רו-ויברציונית של מצבים, הכוללת את חלוקת האנרגיה הפנימית20 של הקומפלקס הטרנרי [amb+M(II)+NTA]-.
    10. מתוך האפשרויות להזנת הפרמטרים המולקולריים, הזן G כדי לקרוא את קובץ המידול המבני33 עם תדרי הרטט והסיבוב PM6 של הקומפלקס הטרנרי. תשובה כן לשאלה האם אחד המגיבים אטומי? כתוב את המיקום והשם של קובץ המידול.
      הערה: האפשרויות האחרות להזנת תדרי הרטט והתדרים הסיבוביים כוללות קובץ פרמטר קריאה, אשר יקרא בפרמטרים מקובץ טקסט, או קבועי עריכה/הזנה, המאפשרים הזנה ידנית של כל פרמטר.
    11. שנה את קנה המידה של התדרים באמצעות גורם שינוי קנה המידה PM6 המומלץ על-ידי NIST (1.062). לפרטים נוספים על קנה מידה, ראו את הדיון ("גורמי קנה מידה לתדרי הרטט"). מספר האטומים בקומפלקס הטרנרי נקרא מתוך הקובץ. תשובה לא האם המולקולה ליניארית? הזן את תיאור המגיבים (לדוגמה, H+Zn+NTA- + Ar).
    12. הזן 1 עבור המטען על יון ו-1.664 עבור הקיטוב של גז הארגון39. המסה של יון ומסה של מטרה הם עבור קומפלקס טרנרי וארגון, בהתאמה, והם נקראים באופן אוטומטי מ- . קובץ טקסט GB5. הזן 0 לקבלת רטט הרמוני.
      הערה: האפשרויות הבאות מיועדות לבחירת גורמי שינוי קנה מידה שונים עבור תדרי רטט גבוהים או נמוכים. הזן 1.062 עבור תדרים גבוהים ו- 0.0 עבור תדרים נמוכים (ראה דיון: גורמי קנה מידה עבור תדרי הרטט). התדרים המוגדלים מוצגים. בחר 0 כדי לבחור ללא שינוי.
    13. לחץ על Enter כדי לקרוא את קבועי הסיבוב 1-D ו- 2-D מקובץ המידול המבני33 שהוזן בשלב 8.2.10. בחר ערכי ברירת מחדל של 0 עבור טיפולי הרוטור המעוכב ו- 1 עבור סימטריית המולקולות.
      הערה: התוכנית מציגה את הנתונים שהוזנו; מכה Enter ללא שינויים.
    14. בחר את ברירת המחדל של 300 K לטמפרטורת המגיב. בחר אינטגרציה עבור השיטה להפחתת צפיפות מערך המצבים. בחר כן כדי לחתוך את חלוקת האנרגיה. הזן 40000 ס"מ−1 לאנרגיה מרבית לחלוקה, 2.0 ס"מ−1 לגודל סל ו- 32 למספר נקודות בחלוקת אנרגיה.
      הערה: לחץ על Enter 2x ובדוק שלמערך החתוך של 32 נקודות יש אוכלוסייה >0.9. אם >0.9, הזן לא כדי לשנות את הפחים או את גורם העיבוי. אם <0.9, הזן כן ושנה את האנרגיה המרבית לחלוקה ו/או לגודל הסל.
    15. לקבלת פרמטרים עבור דגם TCID/RRKM, בחר כן לשינוי, הזן 0 עבור זמן קבוע ו- 0.000050 s עבור הגבול העליון של חלון הזיהוי. עבור המכשיר המנוצל, זהו הזמן שלוקח ליונים לנוע מתא התנגשות ההעברה לגלאי TOF והוא מחושב באמצעות משוואה 2.
    16. עבור מולקולה אנרגטית, הזן C כדי להעתיק ערכים מהמגיבים שכבר הוזנו. הזן −1 עבור מצב מעבר מקור (TS), 0 עבור יעד TS ו - P כדי להמשיך.
    17. עבור ערוץ מוצר 1, בחר 1 עבור מצב מעבר יחיד מאפשרויות ערוץ הדיסוציאציה ו- 0 עבור אף אחד עבור הדיסוציאציה הרציפה. עבור סוג מצב המעבר, בחר 1 למסלול.
    18. בחר G כדי לקרוא את קבצי תוכנית המידול המכילים את הפרמטרים הסיבוביים והרטטיים PM6 עבור המוצרים [amb+M(II)]- + NTA. הזן לא עבור האם אחד ממיני PSL TS אטומי? הזן את המיקום והשם של הקובץ [amb+M(II)]. השתמש ב - 1.062 עבור תדרי קנה מידה, לחץ על Enter עבור מספר האטומים, והזן לא עבור האם המולקולה ליניארית?
    19. הזן את המיקום והשם של קובץ המידול המכיל את תדרי הרטט והתדרים הסיבוביים עבור מוצר NTA. השתמש ב - 1.062 עבור תדרי קנה מידה, לחץ על Enter עבור מספר האטומים, והזן לא עבור האם המולקולה ליניארית? הזן את התיאור של ה- TS המקיף את המסלול, לדוגמה, H+Zn-... נת"ע.
    20. הזן 1 עבור טעינה של [amb+M(II)]-יון, והזן את הקיטוב (16.12 Å3) ואת מומנט הדיפול (4.6183 Debye) של NTA. בחר 0 K לטמפרטורת סיבוב ודיפול נעול לטיפול במצב המעבר המקיף. הזן את המסות הממוצעות (u) של [amb+M(II)]- יון ו-NTA.
    21. הזן 0 לקבלת רטט הרמוני. הזן 1.062 עבור תדרים גבוהים ו- 0.0 עבור תדרים נמוכים. עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים על שינוי קנה מידה; התדרים המוגדלים מוצגים. בחר 0 כדי לבחור ללא שינוי. מכה Enter כדי לקרוא את קבועי הסיבוב 1-D ו- 2-D מקבצי המידול. בחר 0 עבור רוטורים מעוכבים, 1 עבור סימטריה של מולקולות ו- 1 עבור ניוון תגובה. הזן את האפשרות ללא שינויים.
    22. עבור ערוץ מוצר 2, בחר 1 עבור מצב מעבר יחיד, 0 עבור ללא עבור הדיסוציאציה הרציפה ו- 1 עבור מסלול עבור סוג מצב המעבר.
    23. בחר G לקריאה בקובצי מידול המכילים את הפרמטרים הסיבוביים והרטטיים PM6 עבור המוצרים [NTA+M(II)] ו-amb. הזן לא עבור האם אחד ממיני PSL TS אטומי? כתוב את המיקום והשם של קובץ המידול [NTA+M(II)].
    24. השתמש ב - 1.062 עבור תדרי קנה מידה, לחץ על Enter כדי לקרוא את מספר האטומים, והזן N עבור האם המולקולה ליניארית? כתוב את המיקום והשם של קובץ המידול של amb. השתמש ב - 1.062 עבור תדרי קנה מידה, לחץ על Enter עבור מספר האטומים, והזן N עבור האם המולקולה ליניארית?
    25. הזן את התיאור של ה-TS המקיף (לדוגמה, NTA+Zn-... H). הזן 1.0 עבור המטען של [NTA+M(II)]- יון, והזן את הקוטביות (Å3) ואת מומנט הדיפול (Debye) של ה-amb. בחר 0.0 K לטמפרטורת סיבוב ודיפול נעול לטיפול במצב המעבר המקיף. הזן את המסות הממוצעות (u) של [NTA+M(II)]- ואת תוצרי ה-amb.
      הערה: קובץ הפלט מכיל את מומנטי הקיטוב והדיפול של ה-amb. הקיטוב הוא ביחידות של Bohr 3 ויש להמיר אותו ליחידות של Å3.
    26. הזן 0 לקבלת רטט הרמוני. הזן 1.062 עבור תדרים גבוהים ו- 0 עבור תדרים נמוכים. ראה את הדיון לקבלת פרטים נוספים על קנה מידה של תדרים. התדרים המוגדלים מוצגים. בחר 0 כדי לבחור ללא שינוי. מכה Enter כדי לקרוא את קבועי הסיבוב 1-D ו- 2-D מקבצי המידול. בחר 0 עבור רוטורים מעוכבים, 1 עבור סימטריה של מולקולות ו- 1 עבור ניוון תגובה. הזן ללא שינויים.
    27. כדי לטפל בסיבובים דו-ממדיים לא פעילים, בחר באפשרויות ברירת המחדל התפלגות תנע זוויתית סטטיסטית ושלב P(E,J) מעל התפלגות J. השתמש בערך ברירת המחדל של 32 במספר הנקודות באינטגרציה.
      הערה: בחירות אלה בוחרות את שיטת האינטגרציה על פני סך התנע הזוויתי J ברמות16,17. הפלט המתקבל מאפשר לחוקר לבדוק שכל הקלט נכון.
    28. בחר את אנרגיות השפעול ביחס לאפשרות המולקולה האנרגטית והזן אנרגיה יחסית (eV) עבור ערוץ מכפלה 1 הקרובה לאנרגיית הסף שנצפתה בגרף של העוצמה היחסית לעומת אנרגיית ההתנגשות במרכז המסה של המכפלה [amb+M(II)] (איור 4).
    29. עבור ערוץ מכפלה 2, הזן אנרגיה יחסית (eV) הקרובה לאנרגיית הסף שנצפתה בגרף של אנרגיית ההתנגשות בעוצמה לעומת מרכז המסה של המכפלה [NTA+M(II)]. כדי לחשב את מספר המצבים עבור כל ערוץ מוצר, השתמש בגודל סל של 2.0. הקש Enter ולאחר מכן על לא כדי להמשיך.
    30. מתפריט ' מודל ', בחרו ' מטב פרמטרים להתאמת נתונים', והזינו את האנרגיה המינימלית והאנרגיה המרבית כדי להתחיל ולסיים את התאמת הנתונים, בהתאמה.
      הערה: השתמש בטווח אנרגיה קטן הכולל את ערכי הסף של שני הערוצים. לפרטים נוספים, ראו דיון: טווח אנרגיה להתאמת מודל ה-TCID שנבחר לנתוני הניסוי.
    31. בחר -1 עבור מצבי שקלול סטיות תקן ניסיוניות. בהתבסס על הנתונים, בחר סטיית std. מינימלית מקובלת של בדרך כלל 0.01 עד 0.001. בחר לא לשינוי קנה מידה ממוטב של ערוצים בודדים ו - 0 למספר האיטרציות.
      הערה: חלופה לשימוש בסטיות תקן היא האפשרות הסטטיסטית .
    32. השתמש בערך ברירת המחדל עבור מגבלת ההתכנסות E0 ובחר לא כדי להחזיק פרמטר כלשהו בערך הנוכחי. הזן 0.5 ו- 2.0 eV עבור הגבולות התחתונים והעליונים כדי למנוע כשל באופטימיזציה ובחר הפרש סופי מרכזי עבור שיטת ההערכה הנגזרת. השתמש בערך ברירת המחדל לדיוק מספרי ובחר לא לשינוי גודלי צעדים נגזרים.
      הערה: שיטה חלופית היא לבחור כן כדי להחזיק פרמטר כלשהו בערך הנוכחי. שיטה זו מתוארת בהמשך הדיון: אופטימיזציה של פרמטרים.
    33. בתפריט ' מיטוב ', בחרו ' התחל במיטוב'. תוכנית CRUNCH תבצע אופטימיזציה של מודל TCID שנבחר לנתוני הניסוי.
      הערה: אם האופטימיזציה אינה מוצאת התאמות משביעות רצון, מתפריט השינויים , נסה לשנות את טווח האנרגיה כדי לכסות רק את העוצמות הראשונות העולות מהסף. כאשר נמצאה התאמה סבירה, הגדל את טווח האנרגיה והתאם שוב. אפשרויות אחרות שיכולות לסייע במציאת התאמות לנתונים כוללות בחירה להחזיק פרמטר כלשהו בערך הנוכחי בפרמטרים ממוטבים ושינוי אפשרויות שקלול במשקלים. ראה את הדיון עבור אפשרויות אלה.
    34. כאשר נמצא מודל המתאים לנתונים, לחץ על Enter עד להופעת תפריט הדגם . אם רק חלק מטווח האנרגיה של נתוני הניסוי מצויד במודל TCID, בחר חשב מודל מפותל כדי להרחיב את התאמת המודל לכל אנרגיות ההתנגשות הניסוייות.
    35. בתפריט ' דגם' , בחרו Delta H ו-S ב-T.
      הערה: מודל CRUNCH הלא מפותל מקשר את אנרגיות הסף של 0 K לאנתלפיות 0 K (ΔH0) של דיסוציאציה של הקומפלקס הטרנרי לשני ערוצי המכפלה הבלתי תלויים (טבלה 2). האנתלפיות 298 K (ΔH 298) והאנרגיות החופשיות של גיבס (ΔG298) של דיסוציאציה נגזרות גם עם מכניקה סטטיסטית של תיקונים תרמיים ואנטרופיים באמצעות תדרי הסיבוב והרטט PM6 של המגיב והמוצרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדיסוציאציה התחרותית הנגרמת על ידי התנגשות של [amb+M(II)+NTA]- קומפלקסים טרנריים של A ו-H לתוך [amb+M(II)]- + NTA או [NTA+M(II)]- + amb, מוצגת באיור 3. ה-amb מוצג כ-A או H וה-M = Zn או Ni. [A+Zn(II)+NTA]- קומפלקס טרנרי (איור 3A) מציג סף נראה לעין של כ-0.7 אנרגיית התנגשות eV (CE) כדי לייצר [A+Zn(II)]- וכ-0.9 eV כדי לייצר [NTA+Zn(II)]-. הדיסוציאציה של קומפלקס [A+Ni(II)+NTA]- (איור 3B) מציגה ערכי סף דומים (~1.1 eV) הן עבור המוצרים [NTA+Ni(II)]- והן עבור [A+Ni(II)], כאשר [NTA+Ni(II)]- גדלים לעוצמה יחסית של 90%, בעוד שהעוצמות של [A+Ni(II)]- אינן עולות מעל 18%. עבור [H+Zn(II)+NTA]- קומפלקס טרנרי (איור 3C), המוצר העיקרי הוא [H+Zn(II)]- עולה מסף של כ-0.6 eV לכ-85% עוצמה יחסית, ובאנרגיות מעל 1.0 eV, ה-[NTA+Zn(II)]- עולה לכ-30%. יש גם ערוץ לאובדן מים מ [H-H2O +Zn(II)]-. עבור [H+Ni(II)+NTA]- (איור 3D), ה-[H+Ni(II)]- עולה מסף של כ-0.9 eV לכ-40% עוצמה יחסית, בעוד ש-[NTA+Ni(II)]- עולה מ-~1.0 eV לכ-80%. בגרפים נכלל ה-CE שבו הקומפלקס הטרנרי מנותק ב-50%. הקומפלקסים הטרנריים Ni(II) דורשים CE גבוה יותר ב-0.31-0.37 eV מאשר עמיתיהם המורכבים הטרנריים Zn(II) להיות מנותקים ב-50%. זה מצביע על כך שמתחמי Ni(II) יציבים יותר ודורשים CE גבוה יותר כדי להתנתק, מה שנחקר עוד יותר באמצעות טכניקת TCID.

איור 4 ממחיש את שיטת ה-TCID התחרותית, המאפשרת התאמה סימולטנית של שני ערוצי המוצרים המתחרים.

[amb+M(II)+NTA] → [amb+M(II)]- + NTA (1)

[amb+M(II)+NTA] → [NTA+M(II)]- + amb (2)

משטח האנרגיה הפוטנציאלית (PES) ממחיש את הקומפלקס הטרנרי האנרגי המתנתק לערוצי המכפלה המתחרים ומראה את המינים המותאמים לגיאומטריה של PM6 המשמשים למודל הדיסוציאציה של [ambH+Zn(II)+NTA]-. כלולים ב- PES הם צפיפות המצבים של המתחם הטרנרי וסכום המצבים של המוצרים. אנרגיות הסף 0 K, E 1 ו- E 2, שוות ערך לשינוי האנתלפיה 0 K עבור תגובות 1 ו- 2.

איור 5 מראה את המבנים של שלושת הקומפלקסים האחרים המותאמים לגיאומטריה ששימשו במחקר זה. מינים אלה נבחרו על סמך האנרגיות האלקטרוניות ונקודת האפס החזויות שלהם והסכמתם עם חתכי ההתנגשות שנמדדו על ידי IM-MS (CCSHe). טבלה 1 מראה שיש הסכמה בין הקומפלקסים הטרנריים LJ CCSHe לבין הניסוי IM-MSCCS הוא מכיוון שהם מסכימים בתוך אי הוודאות ההדדית שלהם. ההתאמות של [amb+M(II)] ו-amb התבססו על הממצאים של מודלים קודמים של DFT 3,4,5,6. הפרמטרים המולקולריים של קונפורמיות PM6 אלה שימשו במידול TCID של הדיסוציאציות הפתורות אנרגיה של הקומפלקסים הטרנריים, כולל התדרים הרו-ויברציוניים שלהם לחישוב צפיפותם וסכום המצבים שלהם.

איור 6 מראה את סף ה-CRUNCH TCID המפותל שמתאים לעוצמות המוצר שנפתרו על-ידי אנרגיה. ההתאמות המפותלות כוללות את האנרגיה הזמינה ואת התפלגויות התנע הזוויתי של [amb+M(II)+NTA]- + מגיבי Ar. ההתאמות הלא מפותלות (לא מוצגות) חזו את השינוי של 0 K באנתלפיות (Δ H 0) עבור הדיסוציאציה של הקומפלקס הטרנרי, וטבלה 2 מציגה את Δ H 0 ו- Δ H298 (kJ/mol) עבור תגובות 1 ו-2. עבור הדיסוציאציה של הקומפלקסים הטרנריים Zn(II), גם A וגם H מציגים Δ H 0 עבור תגובה 1, שהם 31 kJ/mol ו-15 kJ/mol נמוך יותר מ-Δ H 0 עבור תגובה 2, בהתאמה, מה שמצביע על כך שגם ל-A וגם ל-H יש זיקה גדולה יותר ל-Zn(II) מאשר ל-NTA. הקומפלקס הטרנרי [A+Ni(II)+NTA]- מציג ΔH0 = 146 ו-148 kJ/mol עבור תגובות 1 ו-2, בהתאמה, מה שמצביע על כך של-A ול-NTA יש זיקות דומות ל-Ni(II). עם זאת, הדיסוציאציה של [H+Ni(II)+NTA]- מראה כי Δ H 0 עבור תגובה 1 נמוכה ב-36 kJ/mol מאשר עבור תגובה 2, מה שמצביע על כךשל-H יש זיקה גדולה יותר ל-Ni(II) מאשר ל-NTA. באופן כללי, הקומפלקסים [amb+Ni(II)+NTA]- מציגים אנתלפיות דיסוציאציה גבוהות יותר מאשר מקביליהם [amb+Zn(II)+NTA], למעט A שמתנתק ל-[NTA+Ni(II)]-. טבלה 3 מציגה את האנרגיות החופשיות של גיבס (ΔG298) של האסוציאציה ואת קבועי ההיווצרות (K) עבור התגובות ההפוכות:

[amb+M(II)] - + NTA → [amb+M(II)+NTA]- (3)

[NTA+M(II)] - + amb → [amb+M(II)+NTA]- (4)

טבלה 3 מדגימה כי היווצרות הקומפלקסים הטרנריים Ni(II) היא אקסרגונית יותר ומציגה קבועי היווצרות גדולים יותר K מאשר מתחמי Zn(II) בכל המקרים. תגובה 4 (כלומר, קשר תג amb עם קומפלקס יוני המתכת NTA) מעניינת במיוחד מכיוון שהיא מייצגת את החלבון הרקומביננטי המתויג כ-amb הנקשר ליון המתכת המשותק על-ידי NTA בתוך עמודת ה-IMAC. תגובה 4 להיווצרות [ambA+Ni(II)+NTA] מציגה את ΔG298 הספונטני ביותר = 53.1 kJ/mol ואת קבוע ההיווצרות הגבוה ביותר, K = 2.01 x 109.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של שיטת ES-IM-MS TCID. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: המבנים העיקריים של פפטידים מסוג Amb A ו-H. הצבע מדגיש את אתרי קשירת המתכת הפוטנציאליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הדיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות במרכז המסה, הנפתרת על-ידי אנרגיה (eV) של [amb+M(II)+NTA]-. התלות האנרגטית של יוני המכפלה [amb+M(II)]- [NTA+M(II)]- ו-[amb-H2O+Zn(II)]- מוצגת. אנרגיית ההתנגשות במרכז המסה, שבה יש 50% דיסוציאציה של [amb+M(II)+NTA]- קומפלקס טרנרי, נכללת בגרפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: המודל לשיטת TCID שנפתרה באמצעות אנרגיה. ההתנגשויות בין [amb H+Zn(II)+NTA]- + ארגון גורמות לדיסוציאציה ל-[ambH+Zn(II)]- + NTA או [NTA+Zn(II)]- + ambH מוצרים. אנרגיות הסף E 1 ו-E2 שוות ערך ל-0 K אנתלפיות של דיסוציאציה (Δ H 0) עבור התגובות [amb H+Zn(II)+NTA]- → [amb H+Zn(II)]- + NTA או [amb H+Zn(II)+NTA]- → [NTA+Zn(II)]- + ambH, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: הטרנרי הממוטב לגיאומטריה של PM6 [amb+M(II)+NTA] - קומפלקסים של A ו-H. קונפורמרים המשמשים במידול TCID של נתוני הניסוי. קונפורמטורים אלה נבחרו מתוך מבנים מועמדים אחרים על ידי השוואת האנרגיות האלקטרוניות של PM6 שלהם וכיצד חתכי התנגשות LJ שלהם (CCS He) בהשוואה ל- IM-MS נמדד CCSHe. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: הדיסוציאציה שנפתרה על-ידי אנרגיה, הנגרמת על-ידי התנגשות, של [amb+M(II)+NTA]-. עבור מינים A ו-H, יוני המכפלה של [amb+M(II)]- ו-[NTA+M(II)]- עם התאמות סף CRUNCH מפותלות. ערכי האנרגיה (eV) המוצגים הם האנתלפיות של דיסוציאציה ב-0 K עבור התגובות [amb+M(II)+NTA]- → [amb+M(II)]- + NTA או [amb+M(II)+NTA]- → [NTA+M(II)]- + amb. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: התבנית של קובץ קלט הטקסט CRUNCH. הקובץ מכיל את העוצמות היחסיות הממוצעות ואת סטיות התקן שלהן של יוני המכפלה שנוצרו כפונקציה של אנרגיית התנגשות במרכז המסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

אמב [amb+Zn(II)+NTA] - [amb+Ni(II)+NTA] -
PM6 הוצאה PM6 הוצאה
A 214±2 214 219±2 218
H 211±5 216 212±3 215
א ES-IM-MS CCSHE מדידות יש אי ודאות של ±4 Å2.

טבלה 1: השוואה בין חתכי התנגשות LJ של הקונפורמרים PM6 של [amb+M(II)+NTA]-. חתכים תיאורטיים של קונפורמרים PM6 מושווים עם CCS ניסיוניהוא נמדד עם ES-IM-MS.

[amb+Zn(II)+NTA] - → [amb+Ni(II)+NTA] - →
[amb+Zn(II)] - + נת"ע [NTA+Zn(II)] - + אמב [amb+Ni(II)] - + נת"ע [NTA+Ni(II)] - + אמב
אמב ΔH0 ΔH298 ΔH0 ΔH298 ΔH0 ΔH298 ΔH0 ΔH298
A 118 127 149 182 146 171 148 154
H 96.4 92.3 111 115 125 140 161 216
 

טבלה 2: תוצאות תרמוכימיות מניתוחי TCID. התגובות התלויות באנרגיה [amb+M(II)+NTA]- → [amb+M(II)]- + NTA או [amb+M(II)+NTA]- → [NTA+M(II)]- + amb, המציג את 0 K אנתלפיות של דיסוציאציה (Δ H 0) הנגזרות מהתאמת מודל TCID הלא מפותל, ו-298 K אנתלפיות של דיסוציאציה (Δ H 298) הנגזרות מ-Δ H 0 ותיקונים תרמיים מכניים סטטיסטיים באמצעות תדרי הסיבוב והרטט PM6. הערכים ניתנים ב- kJ/mol.

[amb+Zn(II)] - + → נת"ע [NTA+Zn(II)] - + אמב → [amb+Ni(II)] - + נת"ע → [NTA+Ni(II)] - + אמב →
[amb+Zn(II)+NTA] - [amb+Zn(II)+NTA] - [amb+Ni(II)+NTA] - [amb+Ni(II)+NTA] -
אמב מיקרוגרם298 K מיקרוגרם298 K מיקרוגרם298 K מיקרוגרם298 K
A -34.0 9.05 x 105 -21.8 6.59 x 103 -45.7 1.01 x 108 -53.1 2.01 x 109
H -29.3 1.36 x 105 -30.2 1.95 x 105 -47.0 1.71 x 108 -31.1 2.81 x 105
 

טבלה 3: אנרגיות חופשיות של גיבס של אסוציאציה (ΔG298) וקבועי היווצרות שיווי משקל (K). ΔG 298 ו-K ב-298 K עבור התגובות ההפוכות [amb+M(II)]- + NTA → [amb+M(II)+NTA]- ו-[NTA+M(II)]- + amb → [amb+M(II)+NTA]-. נגזר מ- ΔH298 וחישובי אנטרופיה של מכניקה סטטיסטית באמצעות תדרי הסיבוב והרטט PM6. הערכים עבור ΔG298 הם ב- kJ/mol.

קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים
ניתוחי דיסוציאציה הנגרמת על-ידי התנגשות (TCID) של סף ES-IM-MS. ה-TCID השתמש בתא גל ה-T ההעברה בנוכחות ארגון כתא ההתנגשות. לפני הדיסוציאציה, היונים המבשרים עוברים תרמית על ידי התנגשויות באנרגיה נמוכה עם גז חנקן כשהם עוברים דרך תא ניידות היונים (IM). התוצאה היא TCID הניתן לשחזור אנרגטי רב יותר מזה המושג על ידי שימוש במלכודת כתא ההתנגשות 6,40. התרמיזציה של [amb+M(II)+NTA]- לפני הדיסוציאציה מאפשרת גם לאפיין את האנרגיה הפנימית הזמינה של הקומפלקס הטרנרי באמצעות טמפרטורה של 298 K. הדיסוציאציה בתא ההעברה פירושה גם שלקומפלקס הטרנרי וליוני המוצר שלו יש את אותם זמני הגעה ממוצעים לגלאי, מה שהיה שימושי לזיהוי הדיסוציאציה של הקומפלקס הטרנרי שהתרחשה רק בתא ההעברה. אזורים אחרים שבהם דיסוציאציה יכולה להתרחש הם מקור ES (חרוט הדגימה נשמר ב-25 וולט כדי למנוע זאת) או בכניסה לתא ההודעות המיידיות. יוני המכפלה המיוצרים על ידי הדיסוציאציה של הקומפלקס הטרנרי באזורים אלה הם בעלי זמני סחיפה שונים מאלו המיוצרים בתא ההעברה מכיוון שליוני המכפלה מופרדים מהקומפלקס הטרנרי בתא ה-IM. יוני מוצר אלה לא נכללו בניתוח. בפרוטוקול זה, רק התפלגויות זמן ההגעה המשולבות של המבשר ויוני המוצר המיושרים יחד משמשות לקביעת עוצמותיהם. הגדרת הטיית המלכודת היא המתח השולט במתח ההזרקה לתא ה- IM, התורם ל- CID בכניסה לתא ה- IM. הטיית המלכודת נקבעה על 14 וולט, מה שצמצם את הדיסוציאציה ברקע למינימום מבלי להשפיע יתר על המידה על העוצמות הכוללות. מחקר קודם41 קבע את הטמפרטורה האפקטיבית (גבול עליון) של דימר הפפטיד של לאוצין אנקפלין להיות 449 K בכניסה של תא IM. עם זאת, הטמפרטורה האפקטיבית ירדה במהירות כאשר הדימר עבר במורד תא ההודעות המיידיות. זמני ההגעה של מתחמי ה-amb שנחקרו כאן הציגו התפלגויות גאוסיאניות, מה שמעיד על כך שהם עברו תרמית כשהם עברו את תא ה-IM.

ניתוחי חתך התנגשות ES-IM-MS (CCS). זמני סחיפה של CCS נמצאו בניסוי כתוצאה מהתנגשויות עם חנקן. ערכים אלה הומרו לזמני סחיפה של CCS שמקורם בהליום באמצעות עקומת כיול של תקנים ידועים. זה חיוני מכיוון שהתוכניות המשמשות למדידת CCS של הקונפורמרים PM6 דורשות את תקני ההליום הנפוצים יותר.

שינויים ופתרון בעיות של הטכניקה
תבנית קובץ טקסט קלט CRUNCH. קובץ טקסט הקלט המתאים לתוכנית CRUNCH מוצג באיור 7. הכותרות לפי הסדר מלמעלה למטה הן מיקום הקובץ והגרסה של CRUNCH; תמר; מספר האנרגיות; מספר סדרות הנתונים למעט עמודת האנרגיות הראשונה; קובץ מקור; מסה של קומפלקס מבשר; מסה של ארגון; טמפרטורה של ניסוי; תאריך היצירה; נתוני x המיועדים כ- −1 (אנרגיות ההתנגשות במרכז המסה); והרוחב המלא בחצי המקסימום (FWHM) של קרן היונים. יש לשנות ערכים אלה עבור כל ניסוי TCID. התפשטות האנרגיה FWHM של קרן היונים ואפס האנרגיה צריכה להיקבע על ידי עיכוב אנליזה פוטנציאלית (RPA) על ידי סריקת ה- CE דרך מתחים נמוכים וניטור זרם היונים הכולל. עם זאת, בתנאי ההפעלה של ה- IM במחקר הנוכחי, אות זרם היונים ירד רק בכ -50% כאשר ההעברה CE נקבעה לערך הנמוך ביותר שלה. ניתן היה למדוד את אנרגיית קרן היונים אפס ו- FWHM רק על פיגור נוסף על ידי הורדת עדשת ה- IM היוצאת. במקרה האחרון, ה- FWHM של הנגזרת של עקומת RPA נתן מרווח אנרגיית יונים טיפוסי של 1.5 V במסגרת המעבדה או 0.035 eV במסגרת מרכז המסה13.

שורת הלחצים מתייחסת ללחץ בתוך תא ההתנגשות אך אינה משמשת כאן. הלחצים של ארגון בתא ההתנגשות יכולים להיות מגוונים וניתן למדוד את נתוני ה-TCID בשלושה לחצים כדי לבצע אקסטרפולציה לתנאי התנגשות בודדים. עם זאת, רק לחץ אחד שימש במחקר זה, והלחץ גורם להתנגשויות מרובות. פיתוח הפלטפורמה החדשה להתנגשות בודדת הוא תחום מחקר מתמשך. המסות מתייחסות לשני יוני המכפלה שעוצמתם נמצאת בעמודות למטה. ניתן להשאיר את המגורים כברירת מחדל. חמשת העמודים הם אנרגיות ההתנגשות במרכז המסה (המיועדות ל-−1); הממוצע של עוצמות היונים של המין עם מסה 898.30 u; סטיות התקן של עוצמות היונים של מינים 898.30 u; ממוצע עוצמות היונים של המין בעל מסה 253.53 u; וסטיות התקן של עוצמות היונים של מינים 253.53 u.

מידול מולקולרי
מספר הקונפורמרים צומצם בתחילה על ידי שימוש במודלים שנגזרו ממחקרים קודמים 9,10,11,12,13. התאמת CRUNCH דורשת סינון קפדני של מגיבים, מולקולות מופעלות ומצבי מעבר כדי לקבל אנרגיות סף מדויקות. מחקר קודם 9,10,11,12,13 כלל סינון נרחב של קונפורמרים [amb+M(II)] כדי לקבל את המבנים עם הפרמטרים המשמשים במידול CRUNCH כאן. רק קומפלקסים עם קשרים טרנס פפטידיים שימשו כי רק הם מסכימים עם IM-MS נמדד CCSHe10. שיטות המידול המולקולרי B3LYP ו-PM6 מנבאות שתיהן את האנרגיה הנמוכה ביותר [amb+M(II)]- קונפורמר המציג Aa 1-Cys2-Cys 7 ותיאום קרבוקסילאט סופי של Zn(II) או Ni(II)10,11,12,13. היכרות עם ההתנהגויות של המודלים הידועים אפשרה לקבוע בצורה יעילה יותר את הקונפורמיסטים החדשים של [amb+M(II)+NTA. כדי לסייע בקביעת הקונפורמינג, מכיוון שקונפורמרים בעלי אנרגיה נמוכה יותר אותרו בשיטת PM6, הם סוננו והוערכו מחדש באופן שיטתי עד שנותרו הקונפורמרים בעלי האנרגיה הנמוכה ביותר.

דוגמנות CRUNCH
חלון זמן להתבוננות בדיסוציאציה. במחקר זה נעשה שימוש בחלון הזמן של 50 μs מתחילת תא ההעברה ועד לסוף מנתח TOF, שבו ממוקם גלאי הלוחות הרב-ערוצי. ייתכן שעדיף להשתמש בחלון הזמן הניסיוני שבין ההפעלה בתא ההעברה לבין הכניסה למנתח המסה TOF מכיוון שאם היון המופעל מתנתק במהלך זמנו ברפלקטרון TOF, דעיכה מטא-יציבה זו תימדד ב-m/z אחר. עם זאת, במחקר זה, יוני המכפלה שנצפו בספקטרום המסה היו כולם ניתנים לזיהוי כמיני m/z ללא שינוי המוצגים באיור 3. זה מצביע על כך שריקבון מטא-יציב לא היה בעיה. מחקר נוסף יכול לחקור זאת על ידי בחינת תגובה ידועה עם סף גבוה ובדיקה כי אנרגיית הסף הנכונה מתקבלת באמצעות חלון הזמן של 50 μs ומידול RRKM.

גורמי קנה מידה עבור תדרי הרטט. נעשה שימוש בגורמי קנה המידה המומלצים על ידי NIST עבור תדרי רטט PM6 (1.062). אלה היו משביעי רצון להתאמת הנתונים [A+Zn(II)+NTA]-, [A+Ni(II)+NTA]-, ו-[H+Zn(II)+NTA]- נתונים. במקרים מסוימים שבהם ערוץ האנרגיה הגבוה מועדף באופן אנטרופי על פני ערוץ האנרגיה הנמוך יותר, ייתכן שיהיה צורך בנוסף להגדיל את התדרים של הערוץ השני. גישה אחת היא להגדיל את התדרים מתחת ל-900 ס"מ−1 (מכיוון שהם הכי פחות מדויקים) כדי לשחרר את התדרים ולהפוך את ה-TS למועדף יותר מבחינה אנטרופית.

אופטימיזציה של פרמטרים. שימוש באפשרות כן כדי להחזיק פרמטר כלשהו בערך הנוכחי יכול להיות מועיל כדי להתאים את הנתונים בהצלחה. עבור ההתאמה הראשונה, E 0(2) מוחזק והדגם TCID מותאם לנתונים על ידי אופטימיזציה של המשתנים CONST, E0(1) ו- N. לאחר איתור התאמה טובה, ניתן להשתמש באפשרות הפרמטרים ובאפשרות Hold כל פרמטר בערך הנוכחי כדי להחזיק את CONST, E 0(1) ו- N, תוך מתן אפשרות ל- E0(2) למטב לנתונים. לבסוף, לאחר אופטימיזציה שלE 0(2), באפשרות הפרמטרים, יש לאפשר לכל ארבעת הפרמטרים CONST, E 0(1), E0(2) ו- N לבצע אופטימיזציה לנתונים.

טווח אנרגיה להתאמת מודל TCID שנבחר לנתוני הניסוי. טווח האנרגיה המשמש להתאמת נתוני הניסוי צריך לשחזר כמה שיותר מנתוני עוצמת הניסוי תוך שמירה על התאמה טובה באזור הסף. אפשר להתחיל בהתאמת מודל ה-TCID לטווח אנרגיה קטן בסף נתוני הניסוי. ניתן לבחור אנרגיה התחלתית המפגינה את עוצמת הרקע רגע לפני התנהגות סף העוצמה העולה. לאחר התאמת TCID ממוטבת לטווח הנתונים הניסיוני, יש להגדיל את הטווח ב-0.1 eV ולמטב את ההתאמה שוב. יש לחזור על הליך זה כך שיתאים ככל האפשר לטווח הנתונים תוך שמירה על ההתאמה של אזור הסף.

ניתוחים תרמוכימיים. יש להשוות את התוצאות התרמוכימיות של Delta H ו- S at T לסדרה של התאמות טווח אנרגיה שונות לנתונים כדי להעריך את סטיית התקן של התאמת מודל TCID. התאמות להשוואה צריכות לכלול טווחים קטנים יותר שמתאימים היטב לעוצמות הסף העולות הראשוניות עם אלה עם טווחים גדולים יותר הכוללים גם את האנרגיות הגבוהות יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

Acknowledgments

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת 1764436, תוכנית NSF REU (CHE-1659852), תמיכה במכשירי NSF (MRI-0821247), מלגת פיזיקה ואסטרונומיה להצלחה (PASS) פרויקט NSF (1643567), קרן וולש (T-0014), ומשאבי מחשוב ממחלקת האנרגיה (TX-W-20090427-0004-50) ותקשורת L3. המחברים מודים לקנט מ. ארווין (אוניברסיטת נבאדה - רינו) ופיטר ב. ארמנטרוט (אוניברסיטת יוטה) על שיתוף תוכנית CRUNCH ועל עצות לגבי התאמה מ- PBA. המחברים מודים לקבוצה של מייקל ט' באואר באוניברסיטת קליפורניה - סנטה ברברה על שיתוף תוכנית סיגמא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
Alternative metal binding (amb) peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Ammonium acetate (ultrapure) VWR 97061-014
Ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Gaussian 09 Gaussian Electronic Structure Modeling Software
GaussView Gaussian Graphical Interface to Visualize Computations
Glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Ion-scaled Lennard-Jones (LJ) method Sigma Michael T. Bowers’ group of University of California at Santa Barbara
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
Microcentrifuge Tubes VWR 87003-294 1.7 mL, polypropylene
Microcentrifuge Tubes VWR 87003-298 2.0 mL, polypropylene
Ni(II) nitrate hexahydrate (99% purity) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A15540
Poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com)  quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
Zn(II) nitrate hexahydrate (99%+ purity) Alfa Aesar (www.alfa.com) 12313

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y. -M., Chen, P. Ligand binding energy in [(bipy)Rh(PCH)]+ by collision-induced dissociation threshold measurements. International Journal of Mass Spectrometry. 202 (1-3), 1-3 (2000).
  2. Plattner, D. Electrospray mass spectrometry beyond analytical chemistry: Studies of organometallic catalysis in the gas phase. International Journal of Mass Spectrometry. 207 (3), 125-144 (2001).
  3. Narancic, S., Bach, A., Chen, P. Simple fitting of energy-resolved reactive cross sections in threshold collision-induced dissociation (T-CID) experiments. Journal of Physical Chemistry A. 111 (30), 7006-7013 (2007).
  4. Ervin, K., Armentrout, P. B. Systematic and random errors in ion affinities and activation entropies from the extended kinetic method. Journal of Mass Spectrometry. 39 (9), 1004-1015 (2004).
  5. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic method of making thermochemical determinations: Advances and applications. Accounts of Chemical Research. 31 (7), 379-386 (1998).
  6. Ervin, K. Microcanonical analysis of the kinetic method. The meaning of the "apparent entropy". Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 13 (5), 435-452 (2002).
  7. Amarasinghe, C., Jin, J. -P. The use of affinity tags to overcome obstacles in recombinant protein expression and purification. Protein & Peptide Letters. 22 (10), 885-892 (2015).
  8. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
  9. Yousef, E. N., Angel, L. A. Comparison of the pH-dependent formation of His and Cys heptapeptide complexes of nickel(II), copper(II), and zinc(II) as determined by ion mobility-mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 55 (3), 4489 (2020).
  10. Lin, Y. -F., et al. Weak acid-base interactions of histidine and cysteine affect the charge states, tertiary structure, and Zn(II)-binding of heptapeptides. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 30, 2068-2081 (2019).
  11. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrometry. 51 (12), 1120-1129 (2016).
  12. Flores, A. A., et al. Formation of Co(II), Ni(II), Zn(II) complexes of alternative metal binding heptapeptides and nitrilotriacetic acid: Discovering new potential affinity tags. International Journal of Mass Spectrometry. 463, 116554 (2021).
  13. Flores, A. A., et al. Thermochemical and conformational studies of Ni(II) and Zn(II) ternary complexes of alternative metal binding peptides with nitrilotriacetic acid. International Journal of Mass Spectrometry. 473, 116792 (2022).
  14. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
  15. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
  16. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying ion mobility-mass spectrometry techniques for explicitly identifying the products of Cu(II) reactions of 2His-2Cys motif peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
  17. Yousef, E. N., et al. Ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides. Journal of Visualized Experiments. (151), e60102 (2019).
  18. Ilesanmi, A. B., Moore, T. C., Angel, L. A. pH dependent chelation study of Zn(II) and Ni(II) by a series of hexapeptides using electrospray ionization - Ion mobility - Mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 455, 116369 (2020).
  19. Armentrout, P. B., Ervin, K. M., Rodgers, M. T. Statistical rate theory and kinetic energy-resolved ion chemistry: Theory and applications. Journal of Physical Chemistry A. 112 (41), 10071-10085 (2008).
  20. Dalleska, N. F., Honma, K., Sunderlin, L. S., Armentrout, P. B. Solvation of transition metal ions by water. Sequential binding energies of M+(H2O)x (x = 1-4) for M = Ti to Cu determined by collision-induced dissociation. Journal of the American Chemical Society. 116 (8), 3519-3528 (1994).
  21. Ervin, K. M., Armentrout, P. B. Translational energy dependence of Ar + XY → ArX+ + Y (XY = H2,D2,HD) from thermal to 30 eV c.m. Journal of Chemical Physics. 83, 166-189 (1985).
  22. DeTuri, V. F., Ervin, K. M. Competitive threshold collision-induced dissociation: Gas-phase acidities and bond dissociation energies for a series of alcohols. Journal of Physical Chemistry A. 103 (35), 6911-6920 (1999).
  23. Iceman, C., Armentrout, P. B. Collision-induced dissociation and theoretical studies of K+ complexes with ammonia: a test of theory for potassium ions. International Journal of Mass Spectrometry. 222 (1-3), 329-349 (2003).
  24. Rodgers, M. T., Ervin, K. M., Armentrout, P. B. Statistical modeling of collision-induced dissociation thresholds. Journal of Chemical Physics. 106, 4499-4508 (1997).
  25. Rodgers, M. T., Armentrout, P. B. Statistical modeling of competitive threshold collision-induced dissociation. Journal of Chemical Physics. 109, 1787-1800 (1998).
  26. Armentrout, P. B., Ervin, K. M. CRUNCH, Fortran program, version 5.2002. , (2016).
  27. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
  28. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
  29. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 140 (20), 6853-6861 (2015).
  30. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
  31. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  32. Stewart, J. J. P. Optimization of parameters for semiempirical methods V: Modification of NDDO approximations and application to 70 elements. Journal of Molecular Modeling. 13, 1173 (2007).
  33. Frisch, M. J., et al. Gaussian 09, Revision C.01. Wallingford CT: Gaussian, Inc. , (2012).
  34. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98, 5648-5652 (1993).
  35. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8, 275-282 (1997).
  36. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chemical Physics Letters. 261 (1-2), 86-91 (1996).
  37. Heerdt, G., Zanotto, L., Souza, P. C. T., Araujo, G., Skaf, M. S. Collision cross section calculations using HPCCS. Methods in Molecular Biology. 2084, 297-310 (2020).
  38. Zanotto, L., Heerdt, G., Souza, P. C. T., Araujo, G., Skaf, M. S. High performance collision cross section calculation-HPCCS. Journal of Computational Chemistry. 39 (21), 1675-1681 (2018).
  39. https://cccbdb.nist.gov/pollistx.asp. , Available from: https://cccbdb.nist.gov/pollistx.asp (2022).
  40. Raja, U. K. B., Injeti, S., Culver, T., McCabe, J. W., Angel, L. A. Probing the stability of insulin oligomers using electrospray ionization ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 21 (6), 759-774 (2015).
  41. Merenbloom, S. I., Flick, T. G., Williams, E. R. How hot are your ions in TWAVE ion mobility spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23 (3), 553-562 (2012).

Tags

כימיה גיליון 184
מחקרים תרמוכימיים של קומפלקסים טרנריים Ni(II) ו-Zn(II) באמצעות ספקטרומטריית ניידות-מסה של יונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corrales, A. J., Arredondo, A. V.,… More

Corrales, A. J., Arredondo, A. V., Flores, A. A., Duvak, C. L., Mitchell, C. L., Spezia, R., Angel, L. A. Thermochemical Studies of Ni(II) and Zn(II) Ternary Complexes Using Ion Mobility-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (184), e63722, doi:10.3791/63722 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter