Nous présentons un protocole pour la mise en œuvre de la microscopie interférence-réflexion et de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale pour l’imagerie simultanée de microtubules dynamiques et de protéines associées à des microtubules marquées par fluorescence.
Plusieurs techniques ont été utilisées pour la visualisation directe des filaments du cytosquelette et de leurs protéines associées. La microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) a un rapport signal/fond élevé, mais elle souffre de photoblanchiment et de photodommages des protéines fluorescentes. Les techniques sans étiquette telles que la microscopie par réflexion par interférence (IRM) et la microscopie à diffusion interférométrique (iSCAT) contournent le problème du photoblanchiment mais ne peuvent pas facilement visualiser des molécules uniques. Cet article présente un protocole pour combiner l’IRM avec un microscope TIRF commercial pour l’imagerie simultanée de protéines associées aux microtubules (MAP) et de microtubules dynamiques in vitro. Ce protocole permet l’observation à grande vitesse des MAP interagissant avec les microtubules dynamiques. Cela améliore les configurations TIRF bicolores existantes en éliminant à la fois le besoin d’étiquetage de microtubules et le besoin de plusieurs composants optiques supplémentaires, tels qu’un deuxième laser d’excitation. Les deux canaux sont imagés sur la même puce de caméra pour éviter les problèmes d’enregistrement d’image et de synchronisation d’images. Cette configuration est démontrée en visualisant des molécules de kinésine unique marchant sur des microtubules dynamiques.
La microscopie TIRF (Total-internal-reflection-fluorescence) est couramment utilisée pour la visualisation de molécules fluorescentes uniques. Par rapport à l’imagerie par épifluorescence, le TIRF permet une suppression supérieure de l’arrière-plan, permettant une localisation et un suivi à haute résolution des fluorophores uniques. Pour cette raison, le TIRF est la méthode préférée pour visualiser les protéines associées aux microtubules marquées par fluorescence et est fréquemment utilisé pour imager les microtubules 1,2.
Pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules par les MAP, il est souvent nécessaire d’imager simultanément les microtubules et les MAP. La plupart des méthodes existantes à cet effet sont coûteuses ou souffrent d’inconvénients techniques. Le TIRF bicolore simultané, par exemple, nécessite deux lasers d’excitation et deux caméras. En plus du coût élevé, le besoin de caméras séparées pose des problèmes de synchronisation des images et d’enregistrement des images. Ce besoin peut être contourné si un cube filtrant rotatif est utilisé pour basculer physiquement entre les lasers d’excitation dans des images consécutives3. Dans une telle configuration, une seule puce de caméra peut être utilisée et les images alternent entre des images de microtubules et de MAP. Cette technique, cependant, est limitée par la vitesse du changement de filtre, qui limite généralement la fréquence d’images à moins de 0,5 image par seconde3 (fps). Une telle fréquence d’images est insuffisante pour résoudre des processus dynamiques rapides, tels que le retrait d’un microtubule se produisant à une vitesse allant jusqu’à 500 nm/s, la marche d’une kinésine à une vitesse de l’ordre de 800 nm/s, ou la diffusion d’une MAP se produisant avec des coefficients de diffusion supérieurs à 0,3 μm2/s4. Ceci est particulièrement problématique lors du suivi des positions relatives de deux cibles en mouvement dans chaque canal, comme la position d’un MAP par rapport à la position d’une pointe de microtubule en mouvement5.
En plus de ces contraintes optiques, la microscopie TIRF bicolore exige que les MAP et les microtubules soient marqués avec différents fluorophores dont les spectres d’émission sont suffisamment séparés. Le marquage fluorescent de la tubuline peut altérer la dynamique des microtubules6, et le photoblanchiment des fluorophores limite la vitesse d’imagerie7. En raison de ces problèmes, des techniques d’imagerie sans étiquette ont été développées pour visualiser les microtubules. Il s’agit notamment de la microscopie à diffusion interférométrique (iSCAT)8,9, de la microscopie rotative-cohérente-diffusion (ROCS)10, de la microscopie spatiale à interférence lumineuse (SLIM)11 et de la microscopie par réflexion d’interférence (IRM)12,13. Ces techniques permettent une imagerie rapide sans étiquette des microtubules sans les inconvénients de l’imagerie par fluorescence, mais elles ne peuvent pas être utilisées pour visualiser des MAP uniques.
Parmi ces techniques sans étiquette, IRM se distingue par son faible coût et ses exigences modestes en matière d’instrumentation. Nous avons récemment présenté un protocole pour combiner l’IRM avec un microscope TIRF commercial, permettant d’imager des microtubules et des MAP fluorescents dans des images alternées 3,13. Ce document présente un protocole permettant de modifier cette configuration pour capturer simultanément des images TIRF et IRM sur une seule puce de caméra. Cela implique l’ajout d’un séparateur de faisceau peu coûteux dans le chemin d’excitation pour éclairer simultanément l’échantillon avec un laser TIRF et une source de lumière IRM LED. Un séparateur d’images commercial modifié est utilisé pour séparer spectralement les signaux TIRF et IRM et les projeter sur des moitiés distinctes de la même puce de caméra. Nous utilisons également un système microfluidique qui permet l’échange rapide de réactifs lors de l’imagerie. Ce protocole décrit comment cette configuration peut être utilisée pour imager des microtubules dynamiques et des MAP. La capacité de l’appareil est démontrée en présentant la première visualisation de protéines de kinésine-1 marchant sur des microtubules rétrécissants, qui est capturé à une fréquence d’images de 10 s-1.
L’étude de la régulation de la dynamique des microtubules par les protéines associées aux microtubules (MAP) nécessite souvent une imagerie simultanée des microtubules et des MAP. Les techniques de microscopie à fluorescence telles que le TIRF sont généralement utilisées à cette fin. Cependant, ils sont limités par les inconvénients de l’imagerie par fluorescence, qui comprennent le photoblanchiment, les photodommages et la nécessité d’un marquage fluorophore. Les méthodes sans étiquette, telles que l’IRM, conviennent à la visualisation de microtubules, mais ne sont pas capables d’imager des fluorophores uniques. Ce protocole combine l’imagerie IRM sans étiquette et la microscopie TIRF pour l’imagerie simultanée de microtubules dynamiques et de MAP.
La configuration IRM utilise une source d’éclairage LED filtrée à >600 nm, tandis que la configuration TIRF utilise un laser 488 nm. Nous avons utilisé un séparateur de faisceau de plaques peu coûteux pour réfléchir la lumière d’éclairage sur l’échantillon et transmettre le signal collecté au détecteur (Figure 1). Un séparateur de faisceau avec une réflectance de 10% et une transmission de 90% a été choisi pour minimiser la perte du signal à molécule unique. La perte de 90% de l’intensité lumineuse de l’éclairage est compensée par l’augmentation de la puissance du laser d’éclairage et de la LED.
La séparation spectrale des signaux a été réalisée à l’aide d’un séparateur de faisceau 90/10 (R/T) et de deux filtres spectraux (passe-long 600 nm pour IRM et passe-bande 535/50 nm pour TIRF). Les signaux IRM et TIRF séparés spectralement sont projetés sur deux moitiés d’une seule puce de caméra à l’aide d’un ensemble de séparateurs d’images. L’utilisation d’un séparateur de faisceau 90/10 sacrifie 90% du signal IRM, mais cela est compensé par l’augmentation de l’intensité de la source d’éclairage LED. Un miroir dichroïque pourrait également être utilisé ici pour séparer plus efficacement les signaux IRM et TIRF. Les microbilles fluorescentes incluses dans les essais permettent un alignement précis des images TIRF et IRM et servent de référence pour la mise au point de l’objectif.
L’élément optique le plus critique de ce protocole est l’objectif à grande ouverture numérique (NA). Ceci est essentiel non seulement pour obtenir une réflexion interne totale, mais aussi pour maximiser l’efficacité de la collection et le contraste de l’image. La qualité des images obtenues dépend également de la propreté de la surface du verre et de l’acquisition d’une image de fond claire pour corriger l’éclairage non uniforme et supprimer les caractéristiques statiques. Pour l’imagerie IRM, nous recommandons d’utiliser un éclairage de longue longueur d’onde (>600 nm) pour minimiser les photodommages des microtubules et des protéines. Ceci est particulièrement important si une source de lumière LED blanche est utilisée, auquel cas un filtre passe-long doit être inclus pour éliminer toute lumière UV.
Ce protocole permet une imagerie haute vitesse sans étiquette de microtubules dynamiques et une visualisation simultanée à haute résolution des MAP fluorescents17. Par rapport à la technique de commutation du cube filtrant, qui alterne entre la capture d’images de microtubules et de MAP, cette configuration est capable de fréquences d’images beaucoup plus élevées car elle ne dépend pas de la rotation physique d’un cube filtrant. Par rapport aux techniques d’imagerie TIRF bicolores, cette technique utilise une configuration optique moins exigeante et contourne le besoin de marquage fluorophore des microtubules. Les principales limites de cette configuration sont dues à l’imagerie TIRF des MAP; la fréquence d’images est limitée par le temps d’exposition d’un fluorophore, et le photoblanchiment des fluorophores reste une possibilité. Néanmoins, ce protocole améliore les techniques existantes car il n’utilise le TIRF que lorsque cela est nécessaire (c’est-à-dire pour visualiser les MAP mais pas les microtubules) et atteint la vitesse la plus élevée possible dans les limites du TIRF. D’autres améliorations ne sont possibles que si les microtubules et les MAP sont visualisés via une technique interférométrique, mais cela nécessite de marquer les MAP avec des nanoparticules métalliques, ce qui présente ses limites et ses défis expérimentaux.
Pour démontrer les capacités de cette technique, nous avons visualisé simultanément deux processus dynamiques rapides via IRM et TIRF : le retrait d’un microtubule et la marche d’une molécule de kinésine fluorescente. Cette technique a déjà été utilisée pour visualiser la diffusion rapide de la spastine sur des microtubules rétractables5. Au-delà de cette application aux MAP et aux microtubules, ce protocole peut être utilisé pour visualiser simultanément des molécules fluorescentes uniques avec n’importe quelle structure macromoléculaire suffisamment massive pour être visualisée via IRM, telle qu’une membrane cellulaire ou un filament d’actine.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le laboratoire de Thierry Emonet d’avoir partagé les équipements des salles blanches. Nous remercions Yin-Wei Kuo d’avoir préparé l’eGFP-kinésine purifiée utilisée dans cette étude. Y.T. reconnaît le soutien de la Fondation Alexander von Humboldt par le biais de la bourse de recherche Feodor Lynen. Ce travail a été soutenu par NIH Grant R01 GM139337 (à J.H.).
10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |