Summary
我们提出了一种用于实现干涉反射显微镜和全内反射荧光显微镜的方案，用于动态微管和荧光标记的微管相关蛋白的同时成像。
Abstract
已经采用了几种技术来直接可视化细胞骨架细丝及其相关蛋白质。全内反射荧光（TIRF）显微镜具有很高的信背景比，但它受到荧光蛋白的光漂白和光损伤。干涉反射显微镜（IRM）和干涉散射显微镜（iSCAT）等无标记技术可以避免光漂白问题，但不能轻易地可视化单个分子。本文提出了一种将IRM与商用TIRF显微镜相结合的方案，用于在体外同时对微管相关蛋白（MAPs）和动态微管进行成像。该协议允许高速观察与动态微管相互作用的MAP。这改进了现有的双色TIRF设置，既不需要微管标记，又不需要几个额外的光学元件，例如第二个激发激光器。两个通道在同一相机芯片上成像，以避免图像配准和帧同步问题。这种设置是通过可视化在动态微管上行走的单个驱动蛋白分子来证明的。
Introduction
全内反射荧光（TIRF）显微镜通常用于单个荧光分子的可视化。与落射荧光成像相比，TIRF实现了出色的背景抑制，允许对单个荧光团进行高分辨率定位和跟踪。因此，TIRF是可视化荧光标记的微管相关蛋白的首选方法，并且经常用于对微管1，2进行成像。
为了研究MAP对微管动力学的调节，通常需要同时对微管和MAP进行成像。用于此目的的大多数现有方法都很昂贵或存在技术缺陷。例如，同时使用双色TIRF需要两个激励激光器和两个摄像头。除了高成本之外，对单独相机的需求还带来了帧同步和图像配准问题。如果使用旋转滤波立方体在连续帧3中的激发激光器之间进行物理切换，则可以避免这种需求。在这样的设置中，可以使用单个相机芯片，并且帧在微管和MAP的图像之间交替。但是，此技术受滤镜更改速度的限制，这通常会将帧速率限制为小于 0.5 帧/秒3 （fps）。这样的帧速率不足以解决快速动态过程，例如以高达500 nm / s的速度发生的微管收缩，运动蛋白以大约800 nm / s的速度行走，或以超过0.3μm2 / s4的速度发生的MAP的扩散。当跟踪每个通道中两个移动目标的相对位置时，这尤其成问题，例如MAP相对于移动微管尖端5的位置。
除了这些光学限制之外，双色TIRF显微镜还要求MAPs和微管用不同的荧光团标记，其发射光谱充分分离。微管蛋白的荧光标记可以改变微管动力学6，荧光团的光漂白限制了成像速度7。由于这些问题，已经开发了无标记成像技术来可视化微管。其中包括干涉散射显微镜（iSCAT）8，9，旋转相干散射显微镜（ROCS）10，空间光干涉显微镜（SLIM）11和干涉反射显微镜（IRM）12，13。这些技术允许微管的快速无标记成像，而没有荧光成像的缺点，但它们不能用于可视化单个MAP。
在这些无标签技术中，IRM 以其低成本和对仪器的适度要求而著称。我们最近提出了一种将IRM与商用TIRF显微镜相结合的方案，允许在交替的帧3，13中对微管和荧光MAP进行成像。本文介绍了一种用于修改此设置的协议，以便在单个相机芯片上同时捕获TIRF和IRM图像。这涉及在激发路径中添加一个廉价的分束器，以同时用TIRF激光器和IRM LED光源照亮样品。改进的商用图像分配器用于以光谱方式分离TIRF和IRM信号，并将它们投影到同一相机芯片的单独一半上。我们还采用微流体系统，允许在成像过程中快速交换试剂。该协议描述了如何使用此设置对动态微管和MAP进行成像。通过呈现在收缩的微管上行走的驱动蛋白-1蛋白的第一次可视化来证明该装置的能力，该微管以10 s-1的帧速率捕获。
Protocol
1. 流动室的制备
注意：微流体流动室将通过将聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道粘附到清洁和功能化的盖玻片上来构建。微通道将在主模具中铸造。
-
准备 PDMS 通道
- 准备清洁和/或功能化的盖玻片，表面化学成分适合于所成像的特定测定。
注意：对于运动蛋白运动性测定，使用食人鱼清洁的硅烷化盖板玻璃。这些准备如盖尔等人所述。或者，更简单的程序是在异丙醇中超声处理盖玻片，然后用甲醇超声处理3x 20分钟循环。 - 为了制备母模，将单面固定胶带的条切割成所需的流道尺寸。将条带粘在10厘米培养皿的底部，将它们并排排列，条带之间至少有1厘米的间距。
注：如果需要精确的通道尺寸，可以使用光刻在硅晶圆上制造模具14。 - 为了制备PDMS聚合物，以1：10的质量比将固化剂和基弹性体混合。混合 2 分钟。
注意：可以改变该混合比以调节聚合物的刚度。较高的碱与固化剂的比例导致更柔软的聚合物。 - 在真空室中对混合物进行脱气，直到所有气泡消失。
- 将混合物倒在主模具上，形成约0.5厘米厚的一层，注意避免产生气泡。
- 将混合物在预热的烤箱中以70°C烘烤40分钟。
注意：如果 PDMS 块较厚（>1 cm），则可能需要更长的固化时间。继续以5分钟为增量加热，直到完全固化。 - 切除聚合物的结构区域。使用 PDMS 打孔机在通道的每一端打孔。
注意：在此协议中，孔径设置为0.75 mm，可以根据所需的流速进行调整。PDMS通道可以在干燥的环境中长时间储存，但应在使用前清洁。 - 清洁 PDMS 块的结构化侧。使用固定胶带去除大颗粒。用异丙醇冲洗，然后用甲醇冲洗。重复这些冲洗3次，用超纯水冲洗，然后吹干表面。
- 等离子体使用氧气或空气等离子体清洁PDMS。
注意：在此协议中，使用18 W空气等离子体。 - 将等离子体清洁的PDMS放在适当清洁的盖板玻璃上，并在80°C的热板上加热15分钟。
注：环氧树脂可以应用于PDMS模块的侧面，以更好地将其粘附在盖板玻璃上。 - 将适当尺寸的低密度聚乙烯 （LDPE） 管插入孔中。将出口管连接到 0.5 mL 注射器。
注意：在该协议中，内径为0.023英寸的管子通过外径为0.025英寸的金属适配器连接到PDMS。 - 通过将入口管浸入溶液中并用注射器拉出所需的体积，将溶液流入微通道。
- 准备清洁和/或功能化的盖玻片，表面化学成分适合于所成像的特定测定。
2. 光学设置
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显微镜的修改（图1）
- 修改TIRF显微镜以启用IRM成像13。将显微镜滤光轮中使用的50/50（反射率（R）/透射（T））分束器更换为10/90（R/T）分束器。
- 在相机和显微镜之间插入图像分离器。
- 在图像分离器的滤波立方体中，插入一个 10/90 （R/T） 分束器。在反射光束前面放置一个600nm长通滤光片，在透射光束前面放置一个适当的荧光发射滤光片。
注意：具有不同 R/T 比的分束器可用于调整收集的 IRM 和 TIRF 发射光的分数。 - 根据制造商的规格对齐图像分配器，以在空间上分离相机芯片上的TIRF和IRM信号。
注意：信号的空间分离是必需的，因为典型荧光团的TIRF信号比微管的IRM信号弱得多，如果两个信号叠加在一起，则无法检测到。
3. 动态微管和单个驱动蛋白分子成像
- 表面功能化和钝化
- 将BRB80缓冲液（80 mM钠管，1 mM EGTA，1 mM MgCl2，用NaOH滴定至pH 7.8）放入反应室中。
- 流动在BRB80中稀释至0.025mg / mL的抗菌素溶液，并在室温下孵育10分钟。
- 用 BRB80 清洗通道。
- 在F-127溶液（1%Pluronic F-127（w / v）溶解在BRB80中过夜）中的流动，并孵育至少20分钟以进行表面钝化。
注意：如果使用易于清洁的盖玻片代替硅烷化的盖板玻璃，请在室温下使用BRB80中的2mg / mL酪蛋白钝化>20分钟。 - 用 BRB80 清洗通道。
- 成像准备
- 如果需要温度控制，请使用客观加热器并将其设置为正确的温度。
注意：在该协议中，所有实验均在28°C下进行。 - 将样品放在显微镜载物台上，并打开会发光光源（>600nm）进行IRM成像。
注：在此协议中，白色LED光源与600 nm长通滤光片一起使用。 - 将显微镜聚焦在样品表面上。在 PDMS 解决方案接口附近查找正确的焦平面。
注意：在IRM中，通道的水性内部应比PDMS聚合物亮得多。 - 选取通道中心附近的视野。
- 在BRB80中制备0.1μm荧光微珠的溶液（密度：109珠/ mL，对应于该方案中使用的微球的200倍稀释度）。
- 在至少一个通道体积的微珠溶液中流动。
- 通过 IRM 监视反应。等待微珠逐渐“降落”到表面上。当达到所需的微珠密度时，用BRB80洗掉多余的微珠。
- 如果需要温度控制，请使用客观加热器并将其设置为正确的温度。
- 生长生物素化胍基5'-α，β-亚甲基二膦酸盐（GMPCPP）稳定的微管种子
- 在0.6mL离心管中，在BRB80中制备50μL含有1mM GMPCPP，1mMMgCl2和2μM生物素化微管蛋白（5-10%标记化学计量）的溶液。
注意：通过将高密度生物素化微管蛋白与未标记的牛微管蛋白以正确的比例组合在一起，可以实现正确的标记化学计量。 - 将溶液在冰上孵育5分钟，然后在37°C下孵育12.5分钟。
注意：种子的长度可以通过调整聚合时间来控制。 - 通过加入100μL室温BRB80停止聚合。
- 在室温（126，000× g，5分钟）下在超速离心机中旋转溶液。通过使用移液管除去未聚合的微管蛋白来丢弃上清液。
注意：在此协议中，使用气动超速离心机。 - 向沉淀中加入200μL室温BRB80。通过轻轻但彻底地移液来重悬沉淀。使用带有切割尖端的200μL移液器，以减少微管的剪切。
- 在0.6mL离心管中，在BRB80中制备50μL含有1mM GMPCPP，1mMMgCl2和2μM生物素化微管蛋白（5-10%标记化学计量）的溶液。
- 不断增长的动态鸟苷二磷酸（GDP）-微管蛋白“延伸”
注意：种子将被固定在流道的抗菌素表面上。动态GTP/GDP“扩展”将从固定种子的末端生长。- 将种子在BRB80中稀释20倍。将稀释的种子流入反应室。
- 通过 IRM 监视反应。等待种子逐渐“降落”到表面上并附着在地上。当达到所需的种子密度时，用BRB80洗掉多余的种子。
- 制备微管延伸混合物：12μM未标记的微管蛋白，1mM GTP，5mM二硫舒糖醇（DTT）在BRB80缓冲液中。
- 在至少一个通道体积的延伸混合物中流动。确保反应温度为28°C。
- 等待微管延伸随着时间的推移从种子中生长出来。
注意：稳态长度通常在不到20分钟的时间内实现。 - 使用动态微管进行成像。在微管上添加并可视化荧光MAPs，如动作蛋白-1的步骤3.5中所述。
注意：由于微管是表面结合的，因此TIRF很容易看到它们。
- 运动蛋白动力测定
注意：此步骤描述了一种方案，用于在收缩的微管上可视化运动绿色荧光蛋白（GFP）标记的驱动蛋白-1。将融合到eGFP（rKin430-eGFP）的截断大鼠驱动蛋白-1构建体表达并纯化，如前所述15，16。- 准备动力缓冲液：BRB80中的1mM ATP和0.2mg / mL酪蛋白。
- 将运动缓冲液中的驱动蛋白-eGFP稀释至10nM。
- 准备2x除氧剂溶液以抵消氧化光漂白（80 mM葡萄糖，80mg / mL葡萄糖氧化酶，32mg / mL过氧化氢酶，0.2mg / mL酪蛋白，20mM DTT），并补充2mM ATP。
- 将 10 份除氧剂、9 份 BRB80 和 1 份 10 nM 激动蛋白-eGFP 混合，最终驱动蛋白浓度为 0.5 nM。
注：总音量应至少比通道音量大 1.5 倍。 - 在显微镜软件上设置成像设置。
注意：在此协议中，视频以10 fps录制，曝光时间为100毫秒。激光强度约为0.05 kW/cm2。 - 开始成像并将驱动蛋白溶液流入腔室。
- 测量完成后，录制一个短（约5秒）视频，其中载物台以圆形或横向运动缓慢平移。将此视频的中位数投影用作背景图像，并从原始测量值中减去它。
4. 图像处理与分析
注意：图像处理是使用NIH ImageJ2（imagej.nih.gov/ij/）进行的。开发了一个宏来自动拆分和对齐 TIRF 和 IRM 通道。此宏需要安装GaussFit_OnSpot插件（可在 ImageJ 插件存储库中找到）。
- 在后台录制中，通过单击“图像|在 ImageJ 中创建中位数投影 堆栈|Z 项目。
- 通过单击“处理”|从原始图像数据中减去中值背景投影 图像计算器。
注意：请确保选中“32 位（浮点型）结果”选项。 - 对于图像配准，选择感兴趣的微管附近的微珠集合，并使用它们来对齐TIRF和IRM图像。
- 对于此集合中的每个磁珠，使用 多点 选择工具标记 TIRF 通道中的近似位置，然后在 IRM 通道中标记相应的位置。
注意：例如，如果有两个磁珠（1 和 2），则多点选择将按以下顺序具有四个点：（1） TIRF 中的磁珠 1，（2） IRM 中的磁珠 1，（3） TIRF 中的磁珠 2，IRM 中的 （4） 磁珠 2。 - 运行提供的 ImageJ 宏 （ImageSplitterRegistration.ijm）。
注意：这自动执行以下步骤：i）通过拟合到高斯来估计每个珠子的中心位置;ii）对于每个珠子，计算将TIRF通道中的中心与IRM通道中的中心分开的位移矢量;iii）在所有珠子上平均该位移矢量;iv） 将TIRF和IRM通道拆分为单独的图像;v）通过iii中计算的平均位移向量平移TIRF图像;vi） 将 TIRF 和 IRM 映像叠加在多通道.tiff文件中。
Representative Results
图 1 中对光学设置进行了架构化。IRM照明和TIRF激发光都通过10/90（R/ T）分束器（BS1）定向到物镜的后孔径（100x，NA：1.49）。发射的信号通过相同的分束器（BS1），并通过镜子（M1）反射到分束器。图像分配器的组件（图1中用虚线包围）通过90/10 （R/T）分束器（BS2）以及适当的频谱滤波器将IRM和TIRF信号分开。最后，将分割的图像投影到相机芯片上进行可视化。镜像分离器的对准使得TIRF和IRM信号投射到芯片的两半上。
在对齐良好的显微镜中，相机图像应显示半分割图像，如图 2所示。表面结合的微管在 IRM 通道13 中应易于可见，荧光驱动蛋白在 TIRF 通道中应可见。
用于对齐和配准两个通道的微珠在TIRF图像中显示为亮点，在IRM图像中显示为暗点。虽然珠子在原始数据中是可见的，但背景减法显著改善了对比度（图2）。用于减法的背景图像是用移动舞台录制的视频的时间中位数。如协议中所述，通过选择感兴趣区域附近的珠子集合并执行提供的宏（imageSplitterRegistration.ijm）来执行图像对齐。宏将点拟合到高斯，并通过最小化每个通道中拟合中心点之间的平均距离来对齐图像。该过程如图 2所示，它显示了荧光微珠的良好对齐（TIRF通道为绿色，IRM通道为黑色）。
最后，通过观察单个驱动蛋白分子走向微管的收缩末端来证明这种同步成像设置的功能。 图3 显示了eGFP标记的驱动蛋白分子（绿色）在收缩的微管（灰色）上行走的kymograph。还展示了一系列来自生成kymograph的记录的快照。
图 1：用于同时对运动蛋白运动进行 IRM 和 TIRF 成像的光学设置示意图。 来自LED光源的表合发光穿过孔径光阑并到达10/90（R / T）分束器（BS1）。分束器将红色IRM照明光和488 nm TIRF激发光反射到物镜以照亮样品。来自样品的信号由同一物镜收集并定向到图像分割组件，其中IRM和TIRF图像由90/10（R / T）分束器（BS2）在空间上分开。然后，信号在到达相机芯片之前经过光谱过滤。缩写：IRM =干涉反射显微镜;TIRF = 全内反射荧光;LED = 发光二极管;ITIRF = TIRF照明;IGFP = GFP 荧光;Iinc = IRM 照明;Iref = 玻璃/水界面处的散射光;Iscat = 来自微管的散射光;IIRM = IRM 信号（Iref 和 Iscat 的干扰）;R/T = 反射/透射;LP600： 长通滤波器 （600 nm）;DM = 二向色镜;BS1 和 BS2 = 分束器 1 和 2;M1， M2， M3， M4 = 镜子;BP535/50 = 带通 （535/50 nm）;GFP = 绿色荧光蛋白;GMPCPP = 5'-α，β-亚甲基二膦酸胍基;GDP = 鸟苷二磷酸。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：背景减法和图像对齐。 TIRF（左半部分）和IRM（右半部分）图像同时出现在同一相机芯片（相机图像）的两半上。时间中值背景减法增加了磁珠（背景减去图像）的对比度，珠子在 IRM 中显示为深色，在 TIRF 图像中显示为亮。IRM 和 TIRF 图像根据所选珠子（白色矩形）的定位通过平移（右）对齐。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：在微管收缩期间Kinesins运动的Kymograph和快照。 扩增管仪（左）显示eGFP-kinesin-1（绿色）向微管的加端（深灰色）走去。将显示相应时间序列的快照（右图）。白色箭头显示单个驱动蛋白-1分子。 请点击此处查看此图的大图。
图像拆分器注册表文件：请单击此处下载此文件。
Discussion
研究微管相关蛋白（MAP）对微管动力学的调节通常需要同时对微管和MAP进行成像。荧光显微镜技术（如TIRF）通常用于此目的。然而，它们受到荧光成像缺点的限制，其中包括光漂白，光损伤和对荧光团标记的需求。无标记方法（如 IRM）适用于微管的可视化，但不能对单个荧光团进行成像。该协议结合了无标记的IRM成像和TIRF显微镜，可同时对动态微管和MAP进行成像。
IRM 设置采用滤波至 >600 nm 的 LED 照明源，而 TIRF 设置采用 488 nm 激光器。我们使用廉价的板式分束器将照明光反射到样品上，并将收集的信号传输到检测器（图1）。选择具有10%反射率和90%透射率的分束器，以最大限度地减少单分子信号的损失。通过增加照明激光器和LED的功率来补偿照明光强度的90%损失。
使用90/10（R/T）分束器和两个光谱滤波器（IRM为长通600 nm，TIRF为带通535/50 nm）实现了信号的频谱分离。光谱分离的IRM和TIRF信号使用图像分配器组件投射到单个相机芯片的两半上。使用90/10分束器会牺牲90%的IRM信号，但这可以通过增加LED照明源的强度来补偿。这里还可以使用二向色镜来更有效地分离IRM和TIRF信号。检测中包含的荧光微珠能够精确对准TIRF和IRM图像，并作为聚焦物镜的参考。
该协议中最关键的光学元件是高数值孔径（NA）物镜。这不仅对于实现全内反射至关重要，而且对于最大限度地提高收集效率和图像对比度也至关重要。获得的图像的质量还取决于玻璃表面的清洁度和获得清晰的背景图像，以校正不均匀的照明并消除静态特征。对于 IRM 成像，我们建议使用长波长照明 （>600 nm） 以最大限度地减少微管和蛋白质的光损伤。如果使用白色LED光源，这一点尤其重要，在这种情况下，应包括长通滤光片以去除任何紫外线。
该协议允许对动态微管进行无标记，高速成像，并同时对荧光MAPs17进行高分辨率可视化。与在捕获微管和MAP图像之间交替的滤波立方体切换技术相比，此设置能够实现更高的帧速率，因为它不依赖于滤波立方体的物理旋转。与双色TIRF成像技术相比，该技术采用的光学设置要求较低，并且无需对微管的荧光团标记。此设置的主要限制是由于MAP的TIRF成像;帧速率受荧光团曝光时间的限制，荧光团的光漂白仍然是可能的。尽管如此，该协议改进了现有技术，因为它仅在必要时使用TIRF（即可视化MAP而不是微管），并在TIRF的范围内实现最高速度。只有当微管和MAPs都通过干涉技术可视化时，才有可能进一步改进，但这需要用金属纳米颗粒标记MAP，这有其局限性和实验挑战。
为了证明这项技术的能力，我们通过IRM和TIRF同时可视化了两个快速动力学过程：微管的收缩和荧光驱动蛋白分子的行走。该技术以前已被用于可视化痉挛素在收缩的微管上的快速扩散5。除了应用于MAPs和微管之外，该协议还可用于同时可视化单个荧光分子，其质量足以通过IRM可视化的任何大分子结构，例如细胞膜或肌动蛋白丝。
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢Thierry Emonet的实验室共享洁净室设备。我们感谢郭银伟制备了本研究中使用的纯化eGFP-驱动蛋白。Y.T.感谢亚历山大·冯·洪堡基金会通过费奥多尔·林宁研究奖学金提供的支持。这项工作得到了NIH Grant R01 GM139337（给J.H.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
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