Summary
我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。
Abstract
細胞骨格フィラメントおよびそれらに関連するタンパク質の直接可視化のために、いくつかの技術が採用されてきた。全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡は、高いシグナル対バックグラウンド比を有するが、蛍光タンパク質のフォトブリーチングおよび光損傷に苦しむ。干渉反射顕微鏡(IRM)や干渉散乱顕微鏡(iSCAT)などのラベルフリー技術は、フォトブリーチングの問題を回避しますが、単一分子を容易に視覚化することはできません。この論文は、IRMと市販のTIRF顕微鏡を組み合わせて、微小管関連タンパク質(MAP)と動的微小管をインビトロで同時にイメージングするためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、動的微小管と相互作用するMAPの高速観察を可能にする。これにより、微小管標識の必要性と、第2励起レーザーなどのいくつかの追加の光学部品の必要性の両方が排除され、既存の2色TIRFセットアップが改善されます。両方のチャンネルが同じカメラチップに画像化され、画像登録とフレーム同期の問題を回避します。このセットアップは、動的な微小管上を歩く単一のキネシン分子を視覚化することによって実証される。
Introduction
全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡は、単一の蛍光分子の可視化に一般的に使用されます。落射蛍光イメージングと比較して、TIRFは優れたバックグラウンド抑制を達成し、単一蛍光色素の高分解能局在化および追跡を可能にします。このため、TIRFは蛍光標識された微小管関連タンパク質を可視化するための好ましい方法であり、微小管1,2を画像化するために頻繁に使用される。
MAPによる微小管ダイナミクスの調節を調べるには、微小管とMAPの両方を同時にイメージングすることがしばしば必要である。この目的のための既存の方法のほとんどは高価であるか、または技術的な欠点に苦しんでいる。例えば、2色同時TIRFには、2つの励起レーザーと2台のカメラが必要です。高コストに加えて、別々のカメラの必要性は、フレーム同期と画像登録の問題を引き起こします。この必要性は、回転フィルタ立方体を使用して連続フレーム3内の励起レーザを物理的に切り替える場合、回避することができる。このようなセットアップでは、単一のカメラチップを使用することができ、フレームは微小管とMAPの画像間で交互に行われる。ただし、この手法はフィルタ変更の速度によって制限され、通常はフレームレートを0.5フレーム/秒3(fps)未満に制限します。このようなフレームレートは、最大500nm/sの速度で起こる微小管の収縮、800nm/s程度の速度でのキネシンの歩行、または0.3μm2/s4を超える拡散係数で起こるMAPの拡散などの高速動的プロセスを解決するには不十分である。これは、移動する微小管先端部5の位置に対するMAPの位置など、各チャネル内の2つの移動標的の相対位置を追跡する場合に特に問題となる。
これらの光学的制約に加えて、2色TIRF顕微鏡では、発光スペクトルが十分に分離された異なる蛍光色素でMAPおよび微小管を標識する必要があります。チューブリンの蛍光標識は微小管ダイナミクス6を変化させる可能性があり、蛍光色素のフォトブリーチングはイメージング速度7を制限します。これらの問題のために、微小管を視覚化するためのラベルフリーイメージング技術が開発されている。これらには、干渉散乱顕微鏡(iSCAT)8,9、回転コヒーレント散乱顕微鏡(ROCS)10、空間光干渉顕微鏡(SLIM)11、および干渉反射顕微鏡(IRM)12,13が含まれる。これらの技術は、蛍光イメージングの欠点なしに微小管の高速ラベルフリーイメージングを可能にしますが、単一のMAPを視覚化するために使用することはできません。
これらのラベルフリー技術の中で、IRMは低コストと計装に対する控えめな要求で際立っています。我々は最近、IRMを市販のTIRF顕微鏡と組み合わせるためのプロトコルを提示し、微小管と蛍光MAPを交互のフレームで画像化できるようにした3,13。このホワイトペーパーでは、この設定を変更して、TIRF画像とIRM画像を1つのカメラチップで同時にキャプチャするためのプロトコルを紹介します。これには、TIRFレーザーとIRM LED光源でサンプルを同時に照らすために、励起経路に安価なビームスプリッターを追加することが含まれます。改造された市販の画像スプリッタは、TIRF信号とIRM信号をスペクトル的に分離し、同じカメラチップの別々の半分に投影するために使用されます。また、イメージング中に試薬を迅速に交換できるマイクロ流体システムを採用しています。このプロトコルでは、この設定を使用して動的な微小管と MAP をイメージ化する方法について説明します。この装置の能力は、10s-1のフレームレートで捕捉された、収縮する微小管上を歩くキネシン-1タンパク質の最初の視覚化を提示することによって実証される。
Protocol
1. フローチャンバーの準備
注:マイクロ流体フローチャンバは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロチャネルを洗浄および機能化されたカバーガラスに接着することによって構築されます。マイクロチャンネルはマスターモールドに鋳造されます。
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PDMSチャネルの準備
- 洗浄および/または官能化されたカバーガラスを、画像化される特定のアッセイに適した表面化学で準備します。
注:キネシン運動性アッセイには、ピラニア洗浄シラン処理カバーガラスが使用されます。これらは、Gell et に記載されているように調製されます。al.1 あるいは、より簡単な手順は、カバーガラスをイソプロパノールで超音波処理し、続いてメタノールを3x 20分サイクルで超音波処理することです。 - マスターモールドを作製するには、片面固定テープのストリップを所望の流路サイズに切断する。ストリップを10cmのペトリ皿の底に接着し、ストリップ間に少なくとも1cmの間隔を空けて左右に配置する。
注:正確なチャネル寸法が必要な場合は、フォトリソグラフィー14を使用してシリコンウェーハ上にモールドを作製することができる。 - PDMSポリマーを調製するために、硬化剤とベースエラストマーとを1:10の質量比で組み合わせる。2分間混ぜる。
注:この混合比は、ポリマーの剛性を調整するために変更することができます。硬化剤に対する主剤の比率が高いほど、ポリマーが柔らかくなります。 - すべての気泡が消えるまで真空チャンバ内の混合物を脱気する。
- 混合物を厚さ約0.5cmの層でマスターモールドに注ぎ、気泡が発生しないように注意してください。
- 混合物を70°Cの予熱したオーブンで40分間焼成する。
メモ: PDMS ブロックの厚さが厚い場合は、硬化時間が長くなることがあります (>1 cm)。完全に硬化するまで5分刻みで加熱を続けます。 - ポリマーの構造領域を切り出す。PDMSパンチャーを使用してチャネルの両端にパンチ穴を開ける。
メモ: このプロトコルでは、穴の直径は 0.75 mm に設定され、必要な流量に応じて調整できます。PDMSチャネルは、乾燥した環境に長期間保管することができますが、使用前に清掃する必要があります。 - PDMS ブロックの構造化された側をクリーニングします。固定テープを使用して大きな粒子を除去します。イソプロパノールで洗い流し、次にメタノールですすいでください。これらのすすぎを3回繰り返し、超純水ですすぎ、表面をブロードライします。
- プラズマは、酸素または空気プラズマを使用してPDMSを洗浄します。
メモ: このプロトコルでは、18 W エアプラズマが使用されます。 - プラズマ洗浄したPDMSを、適切に洗浄したカバーガラスの上に置き、80°Cのホットプレート上で15分間加熱する。
メモ:エポキシ樹脂をPDMSブロックの側面に適用して、カバーガラスに接着することができます。 - 適切なサイズの低密度ポリエチレン(LDPE)チューブを穴に挿入します。アウトレットチューブを0.5 mLシリンジに接続します。
メモ: このプロトコルでは、内径 0.023 インチのチューブは、外径 0.025 インチの金属アダプターを介して PDMS に接続されます。 - 入口チューブを溶液に浸し、シリンジで必要な体積を描画することによって、溶液をマイクロチャネルに流す。
- 洗浄および/または官能化されたカバーガラスを、画像化される特定のアッセイに適した表面化学で準備します。
2. 光学セットアップ
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顕微鏡の変形例(図1)
- TIRF 顕微鏡を変更して、IRM イメージング13 を有効にします。顕微鏡のフィルターホイールに使用されている50/50(反射率(R)/透過(T))ビームスプリッタを10/90(R/T)ビームスプリッタに置き換えます。
- カメラと顕微鏡の間に画像スプリッターを挿入します。
- 画像スプリッタのフィルタキューブに、10/90(R/T)ビームスプリッタを挿入します。反射ビームの前に600nmのロングパスフィルタを配置し、透過ビームの前に適切な蛍光発光フィルタを配置する。
メモ: 異なる R/T 比のビームスプリッタを使用して、収集される IRM および TIRF 発光光の分数を調整できます。 - 製造元の仕様に従ってイメージスプリッタを合わせて、カメラチップ上のTIRF信号とIRM信号を空間的に分離します。
注: 一般的な蛍光色素分子の TIRF シグナルは微小管の IRM シグナルよりもはるかに弱く、2 つのシグナルがオーバーレイされている場合は検出できないため、シグナルの空間的分離が必要です。
3. 動的微小管と単一キネシン分子のイメージング
- 表面機能化とパッシベーション
- BRB80緩衝液(80 mM Na-PIPES、1 mM EGTA、1 mM MgCl2、NaOHでpH 7.8に滴定)を反応チャンバに流す。
- BRB80で0.025mg/mLに希釈した抗生物質溶液を流し、室温で10分間インキュベートする。
- BRB80でチャンネルを洗ってください。
- F-127溶液(BRB80に一晩溶解した1%プルロニックF-127(w/v))を流し、表面不動態化のために少なくとも20分間インキュベートする。
メモ: シラン処理されたカバーガラスの代わりに清掃が容易なカバーガラスを使用する場合は、BRB80 に 2 mg/mL のカゼインを使用して室温で >20 分間不動態化してください。 - BRB80でチャンネルを洗ってください。
- イメージングの準備
- 温度制御が必要な場合は、対物ヒーターを使用して正しい温度に設定してください。
注:このプロトコルでは、すべての実験は28°Cで行われます。 - サンプルを顕微鏡ステージに置き、IRMイメージング用の落射光源(>600nm)をオンにします。
メモ: このプロトコルでは、白色 LED 光源を 600 nm ロングパスフィルタとともに使用します。 - 顕微鏡を試料表面に焦点を合わせます。PDMS ソリューション インターフェイスの近くで正しいフォーカル プレーンを探します。
注: IRM では、チャネルの水性内部は PDMS ポリマーよりもはるかに明るく見えるはずです。 - チャネルの中心付近の視野を選択します。
- BRB80中の蛍光マイクロビーズ0.1 μmの溶液を調製する(密度:109ビーズ/mL、このプロトコルで使用されるビーズの200倍希釈に相当)。
- マイクロビーズ溶液の少なくとも1つの流路体積に流れる。
- IRM を介して反応を監視します。マイクロビーズが徐々に表面に「着地」するのを待ちます。マイクロビーズの所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。
- 温度制御が必要な場合は、対物ヒーターを使用して正しい温度に設定してください。
- ビオチン化グアニリル5'-α,β-メチレンジホスホネート(GMPCPP)安定化微小管種子の増殖
- 0.6 mL 遠沈管で、BRB80 で 1 mM GMPCPP、1 mM MgCl 2、および2 μM ビオチン化チューブリン (5 ~ 10% 標識化学量論) を含む溶液 50 μL を調製します。
注:正しい標識化学量論は、高密度ビオチン化チューブリンと標識されていないウシチューブリンを正しい比率で組み合わせることによって達成することができる。 - 溶液を氷上で5分間インキュベートし、次いで37°Cで12.5分間インキュベートする。
注:種子の長さは、重合時間を調整することによって制御することができる。 - 室温のBRB80を100 μL加えて重合を停止した。
- 室温(126,000 x g、5分)の超遠心機で溶液をスピンダウンします。ピペットを用いて上清を捨て、未重合のチューブリンを除去した。
メモ: このプロトコルでは、空気駆動の超遠心分離機が使用されます。 - ペレットに室温BRB80を200 μL加える。ペレットを穏やかに、しかし徹底的にピペッティングして再懸濁する。切断チップ付きの200 μLピペットを使用して、微小管のせん断を軽減します。
- 0.6 mL 遠沈管で、BRB80 で 1 mM GMPCPP、1 mM MgCl 2、および2 μM ビオチン化チューブリン (5 ~ 10% 標識化学量論) を含む溶液 50 μL を調製します。
- 成長ダイナミックグアノシン二リン酸(GDP)-チューブリン「拡張」
注:種子は流路の抗生物質表面に固定化されます。ダイナミックなGTP/GDPの「拡張」は、固定化された種子の端から成長します。- 種子をBRB80で20倍に希釈する。希釈した種子を反応チャンバに流す。
- IRM を介して反応を監視します。種子が徐々に表面に「着地」し、それに結合するのを待ちます。種子の所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。
- 微小管延長混合物を調製する:BRB80緩衝液中の12μM非標識チューブリン、1mM GTP、5mMジチオスレイトール(DTT)。
- 伸長混合物の少なくとも1つの流路体積に流れる。反応温度が28°Cであることを確認する。
- 微小管の延長が時間の経過とともに種子から成長するのを待ちます。
メモ: 定常状態の長さは、通常 20 分未満で達成されます。 - イメージングには動的微小管を使用します。キネシン-1のステップ3.5で説明したように、微小管に蛍光MAPを追加して視覚化します。
注: 微小管は表面結合しているため、TIRF で簡単に見ることができます。
- キネシン運動性アッセイ
注:このステップでは、収縮する微小管上の運動性緑色蛍光タンパク質(GFP)標識キネシン-1を視覚化するためのプロトコルについて説明します。eGFP(rKin430-eGFP)に融合したトランケートラットキネシン−1構築物を、先に記載したように発現および精製した15、16。- 運動性緩衝液を調製する:BRB80中の1mM ATPおよび0.2mg/mLカゼイン。
- 運動性緩衝液中のキネシン-eGFPを10nMに希釈する。
- 酸化的フォトブリーチング(80 mM グルコース、80 mg/mL グルコースオキシダーゼ、32 mg/mL カタラーゼ、0.2 mg/mL カゼイン、20 mM DTT)に対抗するために 2 mM ATP を添加した 2x 脱酸素剤溶液を調製します。
- 脱酸素剤10部、BRB809部、および10nMキネシン-eGFP1部を組み合わせて、最終キネシン濃度を0.5nMにする。
メモ: 合計ボリュームは、チャンネルボリュームの 1.5 倍以上にする必要があります。 - 顕微鏡ソフトウェアでイメージング設定を行います。
メモ: このプロトコルでは、ビデオは 100 ミリ秒の露光時間で 10 fps で録画されます。レーザー強度は〜0.05キロワット/cm2です。 - イメージングを開始し、キネシン溶液をチャンバーに流します。
- 測定が完了したら、ステージが円形または横方向の動きでゆっくりと平行移動する短い(〜5秒)ビデオを録画します。このビデオの中央投影を背景画像として使用し、生の測定値から減算します。
4. 画像処理・解析
注:画像処理はNIH ImageJ2(imagej.nih.gov/ij/)を用いて行った。TIRF チャネルと IRM チャネルの分割とアライメントを自動化するためにマクロが開発されました。このマクロを使用するには、GaussFit_OnSpotプラグインがインストールされている必要があります (ImageJ プラグインリポジトリで利用可能)。
- 背景記録から、画像|をクリックしてImageJで中央値投影を作成します。 スタック|Z プロジェクト。
- [プロセス]をクリックして、生の画像データから背景投影の中央値を減 算|画像計算機。
メモ: 「32 ビット (浮動小数点数) 結果」オプションを必ずチェックしてください。 - 画像登録のために、目的の微小管の近くにあるマイクロビーズのコレクションを選択し、それらを使用してTIRFおよびIRM画像を整列させます。
- このコレクション内の各ビーズについて、 マルチポイント 選択ツールを使用して、TIRF チャンネル内のおおよその位置をマークし、次に IRM チャンネル内の対応する位置をマークします。
メモ: たとえば、2 つのビーズ (1 と 2) がある場合、マルチポイント選択では、(1) TIRF のビーズ 1、(2) IRM のビーズ 1、(3) TIRF のビーズ 2、(IRM のビーズ 2) の順に 4 つのポイントが作成されます。 - 提供された ImageJ マクロ (ImageSplitterRegistration.ijm) を実行します。
注:これにより、次の手順が自動化されます:i)ガウスにフィッティングすることによって各ビーズの中心位置を推定します。ii)各ビーズについて、前記TIRFチャネルにおける中心を前記IRMチャネルにおける中心から分離する変位ベクトルを計算するステップと、 Aiii)すべてのビーズにわたってこの変位ベクトルを平均化する工程と、iv) TIRF チャンネルと IRM チャンネルを別々の画像に分割する。v)iiiで計算された平均変位ベクトルによってTIRF画像を平行移動させる工程と、vi) マルチチャンネル.tiffファイル内の TIRF イメージと IRM イメージをオーバーレイします。
Representative Results
光学セットアップを図 1に図式化します。IRM照明とTIRF励起光の両方が、10/90(R/T)ビームスプリッタ(BS1)を介して対物レンズ(100x、NA:1.49)のバックアパーチャに向けられます。放射された信号は、同じビームスプリッタ(BS1)を通過し、ミラー(M1)を介して画像スプリッタに反射される。イメージスプリッタの構成要素( 図1では破線で囲まれています)は、適切なスペクトルフィルタとともに、90/10(R/T)ビームスプリッタ(BS2)を介してIRM信号とTIRF信号を分離します。最後に、分割された画像がカメラチップに投影され、視覚化されます。イメージスプリッタのアライメントは、TIRF信号とIRM信号がチップの別々の半分に投影されるようにします。
整列した顕微鏡では、 図 2 に示すように、カメラ画像に中間分割画像が表示されます。表面結合微小管はIRMチャネル13において容易に見えるべきであり、蛍光キネシンはTIRFチャネルにおいて可視でなければならない。
2つのチャンネルの整列と登録に使用されるマイクロビーズは、TIRF画像では明るいスポットとして、IRM画像では暗いスポットとして表示されます。ビーズは生データに表示されますが、バックグラウンド減算によってコントラストが大幅に向上します(図2)。減算に使用される背景画像は、移動ステージで記録されたビデオの時間中央値です。プロトコルで説明されているように、関心領域の近くにあるビーズのコレクションを選択し、提供されたマクロ (imageSplitterRegistration.ijm) を実行することによって、イメージのアライメントが実行されました。マクロは、ポイントをガウス分布に合わせ、各チャンネルの適合点の中心点間の平均距離を最小化することによって画像を整列させます。このプロセスは 図2に表され、蛍光マイクロビーズの良好なアライメントを示しています(TIRFチャネルでは緑色、IRMチャネルでは黒色)。
最後に、この同時イメージングセットアップの能力は、微小管の収縮する端に向かって歩く単一のキネシン分子を観察することによって実証される。 図3 は、収縮する微小管(灰色)上を歩くeGFP標識キネシン分子(緑色)のキモグラフを示す。また、キモグラフが生成された記録からの一連のスナップショットも表示されます。
図1:キネシン運動性のIRMおよびTIRF同時イメージングのための光学セットアップの概略図。 LED光源からの落射照明は、絞り膜を通過し、10/90(R/T)ビームスプリッタ(BS1)に到達します。ビームスプリッタは、赤色IRM照明光と488nmのTIRF励起光を対物レンズまで部分的に反射してサンプルを照らす。サンプルからの信号は、同じ対物レンズによって収集され、IRMおよびTIRF画像が90/10(R/T)ビームスプリッタ(BS2)によって空間的に分離される画像分割アセンブリに送られます。その後、信号はカメラチップに到達する前にスペクトルフィルタリングされます。略語: IRM = 干渉反射顕微鏡;TIRF = 全内部反射蛍光;LED = 発光ダイオード;ITIRF = TIRF イルミネーション;I GFP =GFP 蛍光;Iinc = IRM 照明;Iref =ガラス/水の界面での散乱光。私はスキャット =微小管からの散乱光;I IRM =IRM 信号 (I参照 と Iスキャットの干渉);R/T = 反射/送信;LP600: ロングパスフィルター (600 nm);DM = ダイクロイックミラー;BS1 および BS2 = ビームスプリッタ 1 および 2;M1、M2、M3、M4 = ミラー;BP535/50 = バンドパス(535/50 nm);GFP = 緑色蛍光タンパク質;GMPCPP = グアニリル 5'-α,β-メチレンジホスホネート;GDP=グアノシン二リン酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:背景の減算と画像の配置 TIRF(左半分)とIRM(右半分)の画像は、同じカメラチップ(カメラ画像)の2つの半分に同時に表示されます。時間的な背景の中央値減算は、IRM では暗く、TIRF 画像では明るく見えるビーズ (背景減算画像) のコントラストを高めます。IRM および TIRF イメージは、選択したビーズ (白い長方形) の位置に基づいて平行移動 (右) によって整列されます。スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:キモグラフと微小管収縮中のキネシンの動きのスナップショット。 カイモグラフ(左)は、eGFP-キネシン-1(緑色)が微小管のプラス端(濃い灰色)に向かって歩いていることを示しています。対応する時系列のスナップショットが表示されます (右)。白い矢印は単一のキネシン-1分子を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ImageSplitterRegistration File: このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
微小管関連タンパク質(MAP)による微小管ダイナミクスの調節を研究するには、しばしば微小管とMAPの同時イメージングが必要です。TIRFなどの蛍光顕微鏡技術が、この目的のために典型的に採用される。しかし、それらは、フォトブリーチング、光損傷、および蛍光色素標識の必要性を含む蛍光イメージングの欠点によって制限される。IRMなどのラベルのない方法は、微小管の可視化には適していますが、単一の蛍光色素をイメージングすることはできません。このプロトコルは、動的微小管とMAPの同時イメージングのために、ラベルフリーIRMイメージングとTIRF顕微鏡を組み合わせたものです。
IRMセットアップは>600nmにフィルタリングされたLED照明源を使用し、TIRFセットアップは488nmレーザーを使用します。安価なプレートビームスプリッタを使用して、照明光をサンプルに反射させ、収集した信号を検出器に送信しました(図1)。10%の反射率と90%の透過率を持つビームスプリッタを選択して、単一分子信号の損失を最小限に抑えました。照明光強度の90%の損失は、照明レーザーおよびLEDのパワーを増加させることによって補償される。
信号のスペクトル分離は、90/10(R/T)ビームスプリッタと2つのスペクトルフィルタ(IRMの場合はロングパス600nm、TIRFの場合はバンドパス535/50nm)を使用して達成されました。スペクトル的に分離されたIRM信号とTIRF信号は、画像スプリッタアセンブリを使用して、単一のカメラチップの2つの半分に投影されます。90/10ビームスプリッタを使用すると、IRM信号の90%が犠牲になりますが、これはLED照明源の強度を上げることによって補償されます。ダイクロイックミラーを使用して、IRM信号とTIRF信号をより効率的に分離することもできます。アッセイに含まれる蛍光マイクロビーズは、TIRFおよびIRM画像の正確な位置合わせを可能にし、目的を集束させるための基準として機能します。
このプロトコルで最も重要な光学素子は、高開口数(NA)目標です。これは、完全な内部反射を達成するだけでなく、収集効率と画像コントラストを最大化するためにも不可欠です。得られた画像の品質は、ガラス表面の清浄度と、不均一な照明を補正し、静的な特徴を除去するための鮮明な背景画像の取得にも依存する。IRM イメージングでは、微小管やタンパク質の光損傷を最小限に抑えるために、長波長照明 (>600 nm) を使用することをお勧めします。これは、白色LED光源を使用する場合に特に重要であり、その場合、UV光を除去するためにロングパスフィルタを含める必要があります。
このプロトコルにより、動的微小管のラベルフリーの高速イメージングと、蛍光MAPsの同時高解像度可視化が可能になります17。微小管とMAPの画像を交互にキャプチャするフィルタキューブスイッチング技術と比較して、このセットアップはフィルタキューブの物理的な回転に依存しないため、はるかに高いフレームレートが可能です。2色TIRFイメージング技術と比較して、この技術は要求の少ない光学セットアップを採用し、微小管の蛍光色素標識の必要性を回避します。この設定の主な制限は、MAP の TIRF イメージングによるものです。フレームレートは蛍光色素分子の露光時間によって制限され、蛍光色素分子のフォトブリーチングの可能性は依然として残っています。それにもかかわらず、このプロトコルは、必要な場合にのみTIRFを使用し(すなわち、微小管を視覚化するために)、TIRFの制限内で可能な限り最高の速度を達成するため、既存の技術を改善する。微小管とMAPの両方が干渉技術によって視覚化された場合にのみ、さらなる改善が可能ですが、これには金属ナノ粒子でMAPを標識する必要があり、これには限界と実験上の課題があります。
この技術の能力を実証するために、IRMとTIRFを介して、微小管の収縮と蛍光キネシン分子の歩行という2つの高速動的プロセスを同時に視覚化しました。この技術は、収縮する微小管5上のスパスチンの速い拡散を視覚化するために以前に採用されてきた。MAPsや微小管へのこのアプリケーションを超えて、このプロトコルは、細胞膜やアクチンフィラメントなどのIRMを介して視覚化されるのに十分な大きさの任意の高分子構造と同時に単一の蛍光分子を視覚化するために使用することができます。
Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
クリーンルーム機器を共有してくれたティエリー・エモネの研究室に感謝します。我々は、この研究で使用された精製eGFP−キネシンを調製したYin-Wei Kuoに感謝する。Y.T.は、フョードル・ライネン研究フェローシップを通じてアレクサンダー・フォン・フンボルト財団の支援を認めています。この作業はNIH Grant R01 GM139337(J.H.に)によって支援された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
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