Summary
Dinamik mikrotübüllerin ve floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinlerin eşzamanlı görüntülenmesi için girişim-yansıma mikroskobu ve toplam-iç-yansıma-floresan mikroskobu uygulamak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Sitoiskelet filamentlerinin ve bunlarla ilişkili proteinlerin doğrudan görselleştirilmesi için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Toplam iç-yansıma-floresan (TIRF) mikroskopisi yüksek bir sinyal-arka plan oranına sahiptir, ancak floresan proteinlerinin fotobeyazlatma ve fotohasarından muzdariptir. Girişim yansıma mikroskobu (IRM) ve interferometrik saçılma mikroskobu (iSCAT) gibi etiketsiz teknikler, fotobeyazlatma problemini ortadan kaldırır, ancak tek molekülleri kolayca görselleştiremez. Bu yazıda, mikrotübülle ilişkili proteinlerin (MAP'ler) ve dinamik mikrotübüllerin in vitro olarak görüntülenmesi için IRM'yi ticari bir TIRF mikroskobu ile birleştirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, dinamik mikrotübüllerle etkileşime giren MAP'lerin yüksek hızda gözlemlenmesini sağlar. Bu, hem mikrotübül etiketleme ihtiyacını hem de ikinci bir uyarma lazeri gibi birkaç ek optik bileşene olan ihtiyacı ortadan kaldırarak mevcut iki renkli TIRF kurulumlarını geliştirir. Görüntü kaydı ve kare senkronizasyonu sorunlarını önlemek için her iki kanal da aynı kamera yongasında görüntülenir. Bu kurulum, dinamik mikrotübüller üzerinde yürüyen tek kinesin moleküllerini görselleştirerek gösterilmiştir.
Introduction
Toplam-iç-yansıma-floresan (TIRF) mikroskopisi, tek floresan moleküllerinin görselleştirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Epifloresan görüntüleme ile karşılaştırıldığında, TIRF üstün arka plan bastırma elde ederek yüksek çözünürlüklü lokalizasyona ve tek floroforların izlenmesine olanak tanır. Bu nedenle, TIRF, floresan olarak etiketlenmiş mikrotübülle ilişkili proteinleri görselleştirmek için tercih edilen yöntemdir ve mikrotübülleri 1,2 görüntülemek için sıklıkla kullanılır.
Mikrotübül dinamiklerinin MAP'ler tarafından düzenlenmesini araştırmak için, genellikle hem mikrotübülleri hem de MAP'leri aynı anda görüntülemek gerekir. Bu amaç için mevcut yöntemlerin çoğu pahalıdır veya teknik dezavantajlardan muzdariptir. Örneğin, eşzamanlı iki renkli TIRF, iki uyarma lazeri ve iki kamera gerektirir. Yüksek maliyete ek olarak, ayrı kameralara duyulan ihtiyaç, kare senkronizasyonu ve görüntü kaydı sorunlarına neden olmaktadır. Ardışık çerçevelerde uyarma lazerleri arasında fiziksel olarak geçiş yapmak için dönen bir filtre küpü kullanılırsa bu ihtiyaç aşılabilir3. Böyle bir kurulumda, tek bir kamera çipi kullanılabilir ve çerçeveler mikrotübüllerin ve MAP'lerin görüntüleri arasında geçiş yapar. Ancak bu teknik, genellikle kare hızını saniyede 0,5 karenin3 (fps) altından daha azıyla sınırlayan filtre değişiminin hızıyla sınırlıdır. Böyle bir kare hızı, 500 nm / s'ye kadar bir hızda meydana gelen bir mikrotübülün büzülmesi, bir kinezinin 800 nm / s mertebesinde bir hızda yürümesi veya 0,3 μm2 / s4'ü aşan difüzyon katsayılarıyla meydana gelen bir MAP'nin difüzyonu gibi hızlı dinamik süreçleri çözmek için yetersizdir. Bu, her kanaldaki iki hareketli hedefin göreceli konumlarını izlerken özellikle sorunludur, örneğin hareketli bir mikrotübül ucu5'in konumuna göre bir MAP'nin konumu.
Bu optik kısıtlamalara ek olarak, iki renkli TIRF mikroskopisi, MAP'lerin ve mikrotübüllerin, emisyon spektrumları yeterince ayrılmış farklı floroforlarla etiketlenmesini gerektirir. Tübülinin floresan etiketlemesi mikrotübül dinamiklerini değiştirebilir6 ve floroforların fotobeyazlatılması görüntüleme hızınısınırlar 7. Bu sorunlar nedeniyle, mikrotübülleri görselleştirmek için etiketsiz görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında interferometrik saçılma mikroskobu (iSCAT)8,9, döner-tutarlı-saçılma mikroskobu (ROCS)10, uzamsal ışık girişim mikroskobu (SLIM)11 ve girişim yansıma mikroskobu (IRM)12,13 bulunur. Bu teknikler, floresan görüntülemenin dezavantajları olmadan mikrotübüllerin etiketsiz hızlı görüntülenmesini sağlar, ancak tek MAP'leri görselleştirmek için kullanılamazlar.
Bu etiketsiz tekniklerden IRM, düşük maliyeti ve enstrümantasyondaki mütevazı talepleri ile öne çıkıyor. Yakın zamanda IRM'yi ticari bir TIRF mikroskobu ile birleştirmek için mikrotübüllerin ve floresan MAP'lerin alternatif çerçevelerde görüntülenmesini sağlayanbir protokol sunduk 3,13. Bu belgede, TIRF ve IRM görüntülerini aynı anda tek bir kamera yongasında yakalamak için bu kurulumu değiştirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu, numuneyi aynı anda bir TIRF lazer ve bir IRM LED ışık kaynağı ile aydınlatmak için uyarma yoluna ucuz bir ışın ayırıcının eklenmesini içerir. Modifiye edilmiş bir ticari görüntü ayırıcı, TIRF ve IRM sinyallerini spektral olarak ayırmak ve bunları aynı kamera çipinin ayrı yarılarına yansıtmak için kullanılır. Ayrıca, görüntüleme sırasında reaktiflerin hızlı bir şekilde değiştirilmesini sağlayan bir mikroakışkan sistem kullanıyoruz. Bu protokol, bu kurulumun dinamik mikrotübülleri ve MAP'leri görüntülemek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Aparatın kapasitesi, 10 s-1 kare hızında yakalanan küçülen mikrotübüller üzerinde yürüyen kinesin-1 proteinlerinin ilk görselleştirmesi sunularak gösterilmiştir.
Protocol
1. Akış odalarının hazırlanması
NOT: Mikroakışkan akış odaları, polidimetilsiloksan (PDMS) mikro kanallarının temizlenmiş ve işlevselleştirilmiş bir kapak camına yapıştırılmasıyla inşa edilecektir. Mikro kanallar bir ana kalıpta dökülecektir.
-
PDMS kanallarının hazırlanması
- Temizlenmiş ve/veya işlevselleştirilmiş kapak camlarını, görüntülenen belirli tahlillere uygun yüzey kimyasına sahip şekilde hazırlayın.
NOT: Kinesin hareketlilik tahlilleri için piranha ile temizlenmiş silanjik kapak camları kullanılır. Bunlar Gell et'te açıklandığı gibi hazırlanmıştır. al.1 Alternatif olarak, daha basit bir prosedür, koruyucu camları izopropanolde ve ardından 3x 20 dakikalık döngüler için metanolü sonikleştirmektir. - Bir ana kalıp hazırlamak için, tek taraflı sabit bant şeritlerini istenen akış kanalı boyutuna kesin. Şeritleri 10 cm'lik bir Petri kabının dibine yapıştırın ve şeritler arasında en az 1 cm boşluk bırakarak yan yana yerleştirin.
NOT: Hassas kanal boyutları gerekiyorsa, kalıp fotolitografi14 kullanılarak silikon gofretler üzerinde imal edilebilir. - PDMS polimerini hazırlamak için, kürleme maddesini ve baz elastomeri 1:10 kütle oranında birleştirin. 2 dakika karıştırın.
NOT: Bu karıştırma oranı, polimerin sertliğini ayarlamak için değiştirilebilir. Buzun kürleme maddesine oranının daha yüksek olması, daha yumuşak bir polimer ile sonuçlanır. - Tüm kabarcıklar kaybolana kadar karışımı bir vakum odasında gazdan arındırın.
- Karışımı ana kalıba ~ 0,5 cm kalınlığında bir tabaka halinde dökün, kabarcıklar oluşturmamaya özen gösterin.
- Karışımı önceden ısıtılmış bir fırında 70 °C'de 40 dakika pişirin.
NOT: PDMS bloğu kalınsa (>1 cm) daha uzun bir kürlenme süresi gerekebilir. Tamamen kürlenene kadar 5 dakikalık artışlarla ısıtmaya devam edin. - Polimerin yapılandırılmış bölgelerini kesin. PDMS zımba kullanarak kanalın her iki ucundaki delikleri delin.
NOT: Bu protokolde, delik çapı 0,75 mm'ye ayarlanmıştır ve gerekli akış hızlarına göre ayarlanabilir. PDMS kanalları kuru ortamlarda uzun süre saklanabilir, ancak kullanımdan önce temizlenmelidir. - PDMS bloğunun yapılandırılmış tarafını temizleyin. Büyük parçacıkları çıkarmak için sabit bant kullanın. İzopropanol ve ardından metanol ile durulayın. Bu durulamaları 3x tekrarlayın, ultra saf suyla durulayın ve yüzeyi fön ile kurulayın.
- Plazma, PDMS'yi oksijen veya hava plazması kullanarak temizler.
NOT: Bu protokolde 18 W hava plazması kullanılmıştır. - Plazma ile temizlenmiş PDMS'yi uygun şekilde temizlenmiş bir kapak camına yerleştirin ve 15 dakika boyunca 80 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde ısıtın.
NOT: Epoksi reçine, kapak camına daha iyi yapışması için PDMS bloğunun yanlarına uygulanabilir. - Deliklere uygun boyutta düşük yoğunluklu polietilen (LDPE) boru yerleştirin. Çıkış borusunu 0,5 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
NOT: Bu protokolde, iç çapı 0,023 inç olan tüpler, PDMS'ye 0,025 inç dış çaplı metal adaptör aracılığıyla bağlanır. - Giriş tüpünü çözeltiye batırarak ve şırınga ile gerekli hacmi çizerek çözeltileri mikro kanallara aktarın.
- Temizlenmiş ve/veya işlevselleştirilmiş kapak camlarını, görüntülenen belirli tahlillere uygun yüzey kimyasına sahip şekilde hazırlayın.
2. Optik kurulum
-
Mikroskobun modifikasyonu (Şekil 1)
- IRM görüntülemeyi etkinleştirmek için bir TIRF mikroskobunu değiştirin13. Mikroskopun filtre tekerleğinde kullanılan 50/50 (Reflektans (R)/İletim (T)) ışın ayırıcıyı 10/90 (R/T) ışın ayırıcı ile değiştirin.
- Kamera ve mikroskop arasına bir görüntü ayırıcı yerleştirin.
- Görüntü ayırıcının filtre küpüne, 10/90 (R/T) ışın ayırıcı takın. Yansıyan ışının önüne 600 nm uzunluğunda bir filtre ve iletilen ışının önüne uygun bir floresan emisyon filtresi yerleştirin.
NOT: Farklı R/T oranlarına sahip ışın ayırıcılar, toplanan IRM ve TIRF emisyon ışığının fraksiyonlarını ayarlamak için kullanılabilir. - Kamera yongasındaki TIRF ve IRM sinyallerini uzamsal olarak ayırmak için görüntü ayırıcıyı üreticinin teknik özelliklerine göre hizalayın.
NOT: Sinyallerin uzamsal olarak ayrılması gereklidir, çünkü tipik floroforların TIRF sinyali, bir mikrotübülün IRM sinyalinden çok daha zayıftır ve iki sinyal bindirilirse tespit edilemez.
3. Görüntüleme dinamik mikrotübülleri ve tek Kinesin molekülleri
- Yüzey fonksiyonelleştirme ve pasivasyon
- BRB80 tamponunu (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, NaOH ile pH 7,8'e titre edilmiş) reaksiyon odasına aktarın.
- Akış antibiyotin çözeltisi BRB80'de 0.025 mg / mL'ye seyreltilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Kanalı BRB80 ile yıkayın.
- F-127 çözeltisinde akış (% 1 Pluronik F-127 (w / v) BRB80'de gece boyunca çözülür) ve yüzey pasivasyonu için en az 20 dakika inkübe edin.
NOT: Silanize kapak camları yerine kolay temizlenen kapak camları kullanılıyorsa, BRB80'de oda sıcaklığında >20 dakika boyunca 2 mg/mL kazein kullanarak pasifleştirin. - Kanalı BRB80 ile yıkayın.
- Görüntüleme için hazırlık
- Sıcaklık kontrolü gerekiyorsa, objektif bir ısıtıcı kullanın ve doğru sıcaklığa ayarlayın.
NOT: Bu protokolde, tüm deneyler 28 °C'de gerçekleştirilir. - Numuneyi mikroskop sahnesine yerleştirin ve IRM görüntüleme için epiillumination ışık kaynağını (>600 nm) açın.
NOT: Bu protokolde, 600 nm uzun geçirgen filtre ile beyaz bir LED ışık kaynağı kullanılır. - Mikroskopu numune yüzeyine odaklayın. PDMS çözümü arabiriminin yakınında doğru odak düzlemini arayın.
NOT: IRM'de, kanalın sulu iç kısmı PDMS polimerinden çok daha parlak görünmelidir. - Kanalın merkezine yakın bir görüş alanı seçin.
- BRB80'de 0,1 μm floresan mikroboncuklardan oluşan bir çözelti hazırlayın (yoğunluk: 109 boncuk/mL, bu protokolde kullanılan boncuklar için 200 kat seyreltmeye karşılık gelir).
- Mikroboncuk çözeltisinin en az bir kanal hacminde akış yapın.
- IRM aracılığıyla reaksiyonu izleyin. Mikroboncukların yavaş yavaş yüzeye "inmesini" bekleyin. İstenilen mikroboncuk yoğunluğu elde edildiğinde, fazlalığı BRB80 ile yıkayın.
- Sıcaklık kontrolü gerekiyorsa, objektif bir ısıtıcı kullanın ve doğru sıcaklığa ayarlayın.
- Biyotinile guanilil 5'-α,β-metilendifosfonat (GMPCPP)-stabilize mikrotübül tohumlarının yetiştirilmesi
- 0.6 mL'lik bir santrifüj tüpünde, BRB80'de 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl2 ve 2 μM biyotinillenmiş tübülin (% 5-10 etiketleme stokiyometrisi) içeren 50 μL çözelti hazırlayın.
NOT: Doğru etiketleme stokiyometrisi, yüksek yoğunluklu biyotinile tübülinin etiketlenmemiş sığır tübülini ile doğru oranda birleştirilmesiyle elde edilebilir. - Çözeltiyi 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, ardından 12,5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Tohumların uzunluğu, polimerizasyon süresi ayarlanarak kontrol edilebilir. - 100 μL oda sıcaklığı BRB80 ekleyerek polimerizasyonu durdurun.
- Çözeltiyi oda sıcaklığında (126.000 x g, 5 dakika) ultrasantrifüjde döndürün. Polimerize edilmemiş tübülini çıkarmak için bir pipet kullanarak süpernatantı atın.
NOT: Bu protokolde, hava tahrikli bir ultrasantrifüj kullanılmıştır. - Pelet üzerine 200 μL oda sıcaklığında BRB80 ekleyin. Pelet'i nazikçe ama iyice pipetleyerek yeniden askıya alın. Mikrotübüllerin kesilmesini azaltmak için kesme uçlu 200 μL'lik bir pipet kullanın.
- 0.6 mL'lik bir santrifüj tüpünde, BRB80'de 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl2 ve 2 μM biyotinillenmiş tübülin (% 5-10 etiketleme stokiyometrisi) içeren 50 μL çözelti hazırlayın.
- Büyüyen dinamik guanozin difosfat (GSYİH)-tübülin "uzantıları"
NOT: Tohumlar, akış kanalının antibiyotin yüzeyinde hareketsiz hale getirilecektir. Dinamik GTP / GSYİH "uzantıları", hareketsiz tohumların uçlarından yetiştirilecektir.- Tohumları BRB80'de 20x seyreltin. Seyreltilmiş tohumları reaksiyon odasına akıtın.
- IRM aracılığıyla reaksiyonu izleyin. Tohumların yavaş yavaş yüzeye "inmesini" bekleyin ve ona bağlanın. İstenilen tohum yoğunluğu elde edildiğinde, fazlalığı BRB80 ile yıkayın.
- Bir mikrotübül uzatma karışımı hazırlayın: BRB80 tamponunda 12 μM etiketsiz tübülin, 1 mM GTP, 5 mM ditiyotreitol (DTT).
- Uzatma karışımının en az bir kanal hacminde akış. Reaksiyon sıcaklığının 28 °C olduğundan emin olun.
- Mikrotübül uzantılarının zamanla tohumlardan büyümesini bekleyin.
NOT: Kararlı durum uzunluğu genellikle 20 dakikadan daha kısa sürede elde edilir. - Görüntüleme için dinamik mikrotübülleri kullanın. Kinesin-1 için adım 3.5'te açıklandığı gibi mikrotübüller üzerine floresan MAP'ler ekleyin ve görselleştirin.
NOT: Mikrotübüller yüzeye bağlı olduğundan, TIRF tarafından kolayca görülebilirler.
- Kinesin hareketlilik testi
NOT: Bu adımda, büzülen mikrotübüller üzerinde hareketli yeşil floresan protein (GFP) etiketli kinezin-1'in görselleştirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. eGFP (rKin430-eGFP) ile kaynaşmış kesilmiş bir sıçan kinesin-1 yapısı, daha önce 15,16'da tanımlandığı gibi ifade edildi ve saflaştırıldı.- Hareketlilik tamponu hazırlayın: BRB80'de 1 mM ATP ve 0.2 mg / mL kazein.
- Kinezin-eGFP'yi motiliteli tamponda 10 nM'ye kadar seyreltin.
- 2 mM ATP ile desteklenmiş oksidatif fotobeyazlatmaya (80 mM glikoz, 80 mg / mL glikoz oksidaz, 32 mg / mL katalaz, 0.2 mg / mL kazein, 20 mM DTT) karşı koymak için 2x oksijen temizleyici çözeltisi hazırlayın.
- 10 parça oksijen temizleyici, 9 parça BRB80 ve 1 parça 10 nM kinesin-eGFP'yi 0,5 nM'lik son kinesin konsantrasyonu için birleştirin.
NOT: Toplam hacim, kanal hacminden en az 1,5 kat daha büyük olmalıdır. - Mikroskop yazılımındaki görüntüleme ayarlarını yapın.
NOT: Bu protokolde, videolar 100 ms pozlama süresiyle 10 fps'de kaydedilir. Lazer yoğunluğu ~ 0.05 kW /cm2'dir. - Görüntülemeye başlayın ve kinesin çözeltisini odaya aktarın.
- Ölçüm tamamlandıktan sonra, sahne alanının dairesel veya yanal bir hareketle yavaşça çevrildiği kısa (~ 5 sn) bir video kaydedin. Bu videonun medyan projeksiyonunu arka plan resmi olarak kullanın ve ham ölçümlerden çıkarın.
4. Görüntü işleme ve analizi
NOT: Görüntü işleme, NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. TIRF ve IRM kanallarının bölünmesini ve hizalanmasını otomatikleştirmek için bir makro geliştirilmiştir. Bu makro, GaussFit_OnSpot eklentisinin yüklenmesini gerektirir (ImageJ eklentileri deposunda bulunur).
- Arka plan kaydından, Image | Yığınlar | Z-projesi.
- İşlem | tıklayarak ham görüntü verilerinden medyan arka plan projeksiyonunu çıkarın Görüntü Hesaplayıcı.
NOT: "32 bit (float) result" (32 bit (float) result) seçeneğini işaretlediğinizden emin olun. - Görüntü kaydı için, ilgilendiğiniz mikrotübülün yakınında bir mikroboncuk koleksiyonu seçin ve bunları TIRF ve IRM görüntülerini hizalamak için kullanın.
- Bu koleksiyondaki her boncuk için, TIRF kanalındaki yaklaşık konumu ve ardından IRM kanalındaki karşılık gelen konumu işaretlemek üzere çok noktalı seçim aracını kullanın.
NOT: Örneğin, iki boncuk (1 ve 2) varsa, çok noktalı seçimde aşağıdaki sırayla dört nokta bulunur: (1) TIRF'de boncuk 1, IRM'de (2) boncuk 1, (3) TIRF'de boncuk 2, IRM'de (4) boncuk 2. - Sağlanan ImageJ makrosunu (ImageSplitterRegistration.ijm) çalıştırın.
NOT: Bu, aşağıdaki adımları otomatikleştirir: i) bir Gaussian'a uyarak her bir boncuğun merkez konumunu tahmin etmek; ii) her bir boncuk için, TIRF kanalındaki merkezi IRM kanalındaki merkezden ayıran yer değiştirme vektörünün hesaplanması; iii) bu yer değiştirme vektörünün tüm boncuklar arasında ortalamasını almak; iv) TIRF ve IRM kanallarını ayrı görüntülere bölmek; v) TIRF görüntüsünün iii'te hesaplanan ortalama yer değiştirme vektörü ile çevrilmesi; vi) TIRF ve IRM görüntülerini çok kanallı bir .tiff dosyasında üst üste bindirmek.
Representative Results
Optik kurulum Şekil 1'de şematize edilmiştir. Hem IRM aydınlatması hem de TIRF uyarma ışığı, 10/90 (R/T) ışın ayırıcı (BS1) aracılığıyla hedefin arka diyaframına (100x, NA: 1,49) yönlendirilir. Yayılan sinyal aynı ışın ayırıcıdan (BS1) geçer ve bir ayna (M1) aracılığıyla görüntü ayırıcıya yansıtılır. Görüntü ayırıcının bileşenleri ( Şekil 1'de kesikli çizgilerle çevrelenmiş), IRM ve TIRF sinyallerini uygun spektral filtrelerle birlikte bir 90/10 (R/T) ışın ayırıcı (BS2) aracılığıyla ayırır. Son olarak, bölünmüş görüntüler görselleştirme için kamera çipine yansıtılır. Görüntü ayırıcının hizalaması, TIRF ve IRM sinyallerinin çipin ayrı yarılarına yansıtılacağı şekildedir.
İyi hizalanmış bir mikroskopta, kamera görüntüsü Şekil 2'de gösterildiği gibi yarıya bölünmüş bir görüntü görüntülemelidir. Yüzeye bağlı mikrotübüller IRM kanalı13'te kolayca görülebilmeli ve floresan kinesin TIRF kanalında görülebilmelidir.
İki kanalı hizalamak ve kaydetmek için kullanılan mikro boncuklar, TIRF görüntülerinde parlak noktalar ve IRM görüntülerinde koyu noktalar olarak görünür. Boncuklar ham verilerde görünür olsa da, arka plan çıkarma işlemi kontrastı önemli ölçüde artırır (Şekil 2). Çıkarma işlemi için kullanılan arka plan görüntüsü, hareketli bir aşamayla kaydedilen bir videonun zamansal medyanıdır. Protokolde açıklandığı gibi, görüntü hizalaması, ilgilenilen bölgeye yakın bir boncuk koleksiyonu seçilerek ve sağlanan makro (imageSplitterRegistration.ijm) yürütülerek gerçekleştirildi. Makro, noktaları Gausslulara uyar ve her kanaldaki uyumların merkez noktaları arasındaki ortalama mesafeyi en aza indirerek görüntüleri hizalar. Bu işlem, floresan mikroboncukların iyi bir hizalanmasını gösteren Şekil 2'de gösterilmiştir (TIRF kanalında yeşil, IRM kanalında siyah).
Son olarak, bu eşzamanlı görüntüleme kurulumunun yetenekleri, mikrotübüllerin küçülen uçlarına doğru yürüyen tek kinesin moleküllerini gözlemleyerek gösterilmiştir. Şekil 3 , küçülen bir mikrotübül (gri) üzerinde yürüyen eGFP etiketli kinesin moleküllerinin (yeşil) bir kimografını göstermektedir. Ayrıca, kimografın oluşturulduğu kayıttan bir dizi anlık görüntü de sunulmaktadır.
Şekil 1: Kinesin motilitesinin eşzamanlı IRM ve TIRF görüntülemesi için optik kurulumun şematik gösterimi. Bir LED ışık kaynağından gelen epiillumination, diyafram diyaframından geçer ve 10/90 (R/T) ışın ayırıcıya (BS1) ulaşır. Işın ayırıcı, kırmızı IRM aydınlatma ışığını ve 488 nm TIRF uyarma ışığını numuneyi aydınlatma hedefine kadar kısmen yansıtır. Numuneden gelen sinyal aynı amaç tarafından toplanır ve IRM ve TIRF görüntülerinin 90/10 (R/T) ışın ayırıcı (BS2) ile uzamsal olarak ayrıldığı görüntü bölme düzeneğine yönlendirilir. Sinyaller daha sonra kamera çipine ulaşmadan önce spektral olarak filtrelenir. Kısaltmalar: IRM = girişim yansıma mikroskobu; TIRF = toplam-iç-yansıma-floresan; LED = ışık yayan diyot; I TIRF =TIRF aydınlatması; I GFP =GFP floresansı; Iinc = IRM aydınlatma; Iref = cam/su arayüzünde dağınık ışık; Iscat = mikrotübülden saçılan ışık; I IRM =IRM sinyali (Iref ve Iscat paraziti); R/T = yansıtılan/iletilen; LP600: uzun geçirgen filtre (600 nm); DM = dikroik ayna; BS1 ve BS2 = ışın ayırıcılar 1 ve 2; M1, M2, M3, M4 = aynalar; BP535/50 = bant geçişi (535/50 nm); GFP = yeşil floresan protein; GMPCPP = guanylyl 5'-α,β-metilendifosfonat; GSYİH = guanozin difosfat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Arka plan çıkarma ve görüntü hizalaması. TIRF (sol yarım) ve IRM (sağ yarı) görüntüleri, aynı kamera yongasının (kamera görüntüsü) iki yarısında aynı anda görünür. Zamansal medyan arka plan çıkarma, IRM'de koyu ve TIRF görüntülerinde parlak görünen boncukların (arka plan çıkarılmış görüntü) kontrastını artırır. IRM ve TIRF görüntüleri, seçilen boncukların (beyaz dikdörtgenler) lokalizasyonuna bağlı olarak çeviri (sağda) ile hizalanır. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Kimograf ve Kinesins'in mikrotübül büzülmesi sırasındaki hareketinin anlık görüntüleri. Kimograf (solda), mikrotübülün (koyu gri) artı ucuna doğru yürüyen eGFP-kinesin-1'i (yeşil) gösterir. İlgili zaman serilerinden anlık görüntüler gösterilir (sağda). Beyaz oklar tek kinesin-1 moleküllerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
ImageSplitterRegistration File: Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Mikrotübül dinamiklerinin mikrotübülle ilişkili proteinler (MAP'ler) tarafından düzenlenmesini incelemek genellikle mikrotübüllerin ve MAP'lerin eşzamanlı görüntülenmesini gerektirir. TIRF gibi floresan mikroskopi teknikleri tipik olarak bu amaçla kullanılır. Bununla birlikte, fotobeyazlatma, fotohasar ve florofor etiketleme ihtiyacını içeren floresan görüntülemenin dezavantajları ile sınırlıdırlar. IRM gibi etiketsiz yöntemler, mikrotübülleri görselleştirmek için uygundur, ancak tek floroforları görüntüleyemez. Bu protokol, dinamik mikrotübüllerin ve MAP'lerin eşzamanlı görüntülenmesi için etiketsiz IRM görüntüleme ve TIRF mikroskopisini birleştirir.
IRM kurulumu, >600 nm'ye filtrelenmiş bir LED aydınlatma kaynağı kullanırken, TIRF kurulumu 488 nm lazer kullanır. Aydınlatma ışığını numuneye yansıtmak ve toplanan sinyali dedektöre iletmek için ucuz bir plaka ışın ayırıcı kullandık (Şekil 1). Tek moleküllü sinyal kaybını en aza indirmek için% 10 yansıtma ve% 90 iletim ile bir ışın ayırıcı seçildi. Aydınlatma ışık yoğunluğundaki% 90'lık kayıp, aydınlatma lazerinin ve LED'in gücünü artırarak telafi edilir.
Sinyallerin spektral ayrımı, bir 90/10 (R / T) ışın ayırıcı ve iki spektral filtre (IRM için uzun geçişli 600 nm ve TIRF için bant geçişli 535/50 nm) kullanılarak elde edildi. Spektral olarak ayrılmış IRM ve TIRF sinyalleri, bir görüntü ayırıcı tertibatı kullanılarak tek bir kamera çipinin iki yarısına yansıtılır. 90/10 ışın ayırıcının kullanılması, IRM sinyalinin% 90'ını feda eder, ancak bu, LED aydınlatma kaynağının yoğunluğunu artırarak telafi edilir. IRM ve TIRF sinyallerini daha verimli bir şekilde ayırmak için burada dikroik bir ayna da kullanılabilir. Tahlillerde yer alan floresan mikroboncuklar, TIRF ve IRM görüntülerinin doğru bir şekilde hizalanmasını sağlar ve hedefe odaklanmak için bir referans görevi görür.
Bu protokoldeki en kritik optik eleman, yüksek sayısal açıklık (NA) hedefidir. Bu sadece toplam iç yansıma elde etmek için değil, aynı zamanda koleksiyon verimliliğini ve görüntü kontrastını en üst düzeye çıkarmak için de gereklidir. Elde edilen görüntülerin kalitesi aynı zamanda cam yüzeyin temizliğine ve düzgün olmayan aydınlatmayı düzeltmek ve statik özellikleri kaldırmak için net bir arka plan görüntüsünün elde edilmesine de bağlıdır. IRM görüntüleme için, mikrotübüllerin ve proteinlerin fotohasarını en aza indirmek için uzun dalga boyu aydınlatması (>600 nm) kullanmanızı öneririz. Bu özellikle beyaz bir LED ışık kaynağı kullanılıyorsa önemlidir, bu durumda herhangi bir UV ışığını gidermek için uzun geçirgen bir filtre dahil edilmelidir.
Bu protokol, dinamik mikrotübüllerin etiketsiz, yüksek hızlı görüntülenmesini ve floresan MAP'lerin eşzamanlı yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar17. Mikrotübüllerin ve MAP'lerin görüntülerini yakalamak arasında geçiş yapan filtre küpü anahtarlama tekniğiyle karşılaştırıldığında, bu kurulum bir filtre küpünün fiziksel dönüşüne bağlı olmadığından çok daha yüksek kare hızlarına sahiptir. İki renkli TIRF görüntüleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, bu teknik daha az zorlu bir optik kurulum kullanır ve mikrotübüllerin florofor etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu kurulumun birincil sınırlamaları, MAP'lerin TIRF görüntülemesinden kaynaklanmaktadır; kare hızı bir floroforun pozlama süresi ile sınırlıdır ve floroforların fotobeyazlatılması bir olasılık olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, bu protokol mevcut teknikleri geliştirir, çünkü TIRF'yi yalnızca gerektiğinde kullanır (yani, MAP'leri görselleştirmek için ancak mikrotübülleri görselleştirmek için) ve TIRF sınırları içinde mümkün olan en yüksek hıza ulaşır. Daha fazla iyileştirme ancak hem mikrotübüller hem de MAP'ler interferometrik bir teknikle görselleştirilirse mümkündür, ancak bu, MAP'lerin sınırlamaları ve deneysel zorlukları olan metal nanopartiküllerle etiketlenmesini gerektirir.
Bu tekniğin yeteneklerini göstermek için, IRM ve TIRF aracılığıyla iki hızlı dinamik süreci aynı anda görselleştirdik: bir mikrotübülün büzülmesi ve bir floresan kinesin molekülünün yürümesi. Bu teknik daha önce spastinin küçülen mikrotübüller üzerindeki hızlı difüzyonunu görselleştirmek için kullanılmıştır5. MAP'lere ve mikrotübüllere yapılan bu uygulamanın ötesinde, bu protokol, tek floresan molekülleri, bir hücre zarı veya aktin filamenti gibi IRM aracılığıyla görselleştirilebilecek kadar büyük herhangi bir makromoleküler yapı ile aynı anda görselleştirmek için kullanılabilir.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Thierry Emonet'in laboratuvarına temiz oda ekipmanlarını paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu çalışmada kullanılan saflaştırılmış eGFP-kinezini hazırladığı için Yin-Wei Kuo'ya teşekkür ederiz. YT, Alexander von Humboldt Vakfı'nın Feodor Lynen Araştırma Bursu aracılığıyla desteğini kabul eder. Bu çalışma NIH Grant R01 GM139337 (J.H.'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Kuo, Y. -W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).
- Hinrichs, M. H., et al. Tau protein diffuses along the microtubule lattice. The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).
- Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -W., Howard, J. Herding of proteins by the ends of shrinking polymers. arXiv:. , (2021).
- Guo, H., et al. Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules. Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy. Astratov, V. , Springer. Cham. 25-65 (2019).
- Young, G., Kukura, P.
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520 (2019).
- Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A.
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).
- Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).
- Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy. arXiv. , (2022).
