Summary
Les lysats plaquettaires représentent un outil émergent pour le traitement des maladies de la surface oculaire. Ici, nous proposons une méthode pour la préparation, la distribution, le stockage et la caractérisation du lysat plaquettaire prélevé sur des donneurs de plaquettes.
Abstract
Diverses maladies de la surface oculaire sont traitées avec des gouttes oculaires dérivées du sang. Leur utilisation a été introduite dans la pratique clinique en raison de leur teneur en métabolites et en facteurs de croissance, ce qui favorise la régénération de la surface oculaire. Les gouttes ophtalmiques à base de sang peuvent être préparées à partir de différentes sources (c.-à-d. don de sang total ou d’aphérèse plaquettaire), ainsi qu’avec différents protocoles (p. ex. différentes dilutions et cycles de congélation et de décongélation). Cette variabilité entrave la standardisation des protocoles cliniques et, par conséquent, l’évaluation de leur efficacité clinique. Le détail et le partage des procédures méthodologiques peuvent contribuer à la définition de lignes directrices communes. Au cours des dernières années, les produits allogéniques se sont diffusés comme alternative aux traitements autologues car ils garantissent des normes d’efficacité plus élevées; parmi eux, les gouttes ophtalmiques au lysat plasma riche en plaquettes (PRP-L) sont préparées selon des procédures de fabrication simples. Dans l’unité de médecine transfusionnelle de l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, en Italie, le PRP-L est obtenu par don d’aphérèse plaquettaire. Ce produit est initialement dilué à 0,3 x 10 9 plaquettes/mL (à partir d’une concentration moyenne de 1 x 10 9 plaquettes/mL) dans0,9% de NaCl. Les plaquettes diluées sont congelées/décongelées et, par la suite, centrifugées pour éliminer les débris. Le volume final est divisé en aliquotes de 1,45 mL et stocké à −80 °C. Avant d’être délivrés aux patients, les gouttes oculaires sont testées pour la stérilité. Les patients peuvent conserver les lysats plaquettaires à -15 °C jusqu’à 1 mois. La composition du facteur de croissance est également évaluée à partir d’aliquotes choisies au hasard, et les valeurs moyennes sont rapportées ici.
Introduction
Les produits dérivés du sang sont largement utilisés dans le soin des plaies1, la chirurgie maxillo-faciale et orthopédique et pour le traitement de différentes maladies de la surface oculaire2 telles que la sécheresse oculaire (DED)3. Dans la DED, l’homéostasie du film lacrymal est altérée en raison du fonctionnement anormal de différents facteurs impliqués dans la production de larmes et l’intégrité de la surface oculaire 4,5.
La DED est caractérisée par une hétérogénéité dans les causes et la gravité 6,7,8 et peut être une conséquence de différents facteurs comme le vieillissement, le sexe9, les lentilles de contact, les médicaments topiques ou systémiques 10, ou des conditions préexistantes comme le syndrome de Gougerot-Sjögren 10. Malgré des symptômes bénins, la DED affecte des millions de personnes dans le monde, ce qui a un impact sur leur qualité de vie et sur le système de santé6.
De nombreux traitements ont été rapportés pour cette pathologie, mais il n’y a toujours pas de consensus sur la solution la plus efficace12. À ce jour, les larmes artificielles sont la première ligne de traitement visant à restaurer la composition aqueuse du film lacrymal, bien que ces substituts ne contiennent pas les principaux solutés biologiquement actifs des larmes naturelles 6,11. Les produits à base de plaquettes sont considérés comme une alternative valable12,13 aux larmes artificielles, bien que leur efficacité clinique, leurs recommandations d’utilisation et leurs méthodes de préparation fassent encore l’objet de débats3.
Les produits sanguins partagent avec les larmes une composition similaire en termes de métabolites14, protéines, lipides, vitamines, ions, facteurs de croissance (GF), composés antioxydants 11 et osmolarité (300 mOsm/L)11. Grâce à l’activité synergique de leurs composants, ils favorisent la régénération de l’épithélium cornéen, inhibent la libération de cytokines inflammatoires et augmentent le nombre de cellules caliciformes et l’expression des mucines dans la conjonctive 2,3.
Jusqu’à présent, l’hétérogénéité des produits ophtalmiques à base de sang a été documentée dans la littérature; Ces produits peuvent être classés selon l’origine du donneur de sang, c’est-à-dire autologue ou allogénique, ainsi que la source de sang, c’est-à-dire le sang périphérique, le sang de cordon, le sérum ou les plaquettes.
Bien que les produits autologues aient été les plus répandus3, les produits allogéniques deviennent maintenant le choix préféré, car ils garantissent des normes d’efficacité et de sécurité plus élevées 15, ainsi qu’une réduction significative des coûts16,17. Des études antérieures ont en effet prouvé que les produits sanguins obtenus à partir de patients atteints de maladies auto-immunes et/ou systémiques peuvent présenter une altération de la qualité et de la fonctionnalité 6,16,17. Malgré le fait que les gouttes ophtalmiques à base de sérum soient les plus répandues, les produits à base de plaquettes se sont récemment affirmés comme une alternative valable, car ils peuvent être facilement préparés tout en maintenant des niveaux d’efficacitésignificatifs 3,11. Les produits à base de plaquettes actuellement disponibles peuvent être divisés en plasma riche en plaquettes (PRP), en lysat de plasma riche en plaquettes (PRP-L) et en plasma riche en facteurs de croissance (PRGF)3.
Parmi eux, le PRP-L a l’avantage d’être un produit surgelé longue conservation. Le PRP-L peut être préparé à partir d’aphérèse, de couches leucocytaires ou même de plaquettes expirant (PLT)18,19, ce qui réduit précieusement leur gaspillage. Les aliquotes peuvent être conservées pendant des mois dans les centres de transfusion sanguine à -80 °C ou même au domicile des patients à -15 °C pendant des périodes plus courtes.
Les PRP-L sont hautement enrichis en GF, dont il a été prouvé qu’ils stimulent la régénération de la surface oculaire 12,20,21. Néanmoins, il n’y a que peu d’études cliniques rapportées dans ce domaine, et toutes ont utilisé des sources autologues 3,22. Le PRP-L doit encore faire l’objet d’une validation et d’une caractérisation plus poussées avant de pouvoir être utilisé systématiquement pour le traitement des maladies de la surface oculaire, car il n’existe pas de lignes directrices normalisées pour sa préparation, sa distribution et son entreposage3.
Ici, un protocole détaillé est partagé pour la production de PRP-L utilisé à l’unité de médecine transfusionnelle de l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, en Italie, et la dispensation aux patients atteints de DED. Notre objectif est d’aider la communauté scientifique à développer des méthodes de préparation standard, qui peuvent augmenter l’homogénéité et la cohérence des études et des approches cliniques mondiales.
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Protocol
Le PRP-L utilisé pour l’évaluation quantitative des facteurs de croissance a été recueilli dans le cadre d’une étude plus large sur la caractérisation des produits PRP à des fins régénératives, réalisée à l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia et approuvée par le comité d’éthique Area Vasta Emilia Nord le 10 janvier 2019 (protocole numéro 2019/0003319). Les donateurs ont donné leur consentement éclairé conformément à la Déclaration d’Helsinki. Aucune approbation éthique n’était nécessaire pour recueillir les données agrégées et anonymes du questionnaire sur l’indice des maladies de la surface oculaire (IDSO), qui est couramment utilisé par les cliniciens pour surveiller les symptômes du syndrome de l’œil sec. La figure 1A montre un aperçu du protocole suivi, tandis que les images de la figure 1B illustrent les principales étapes de la procédure.
1. Collecte de plasma riche en plaquettes (PRP)
- Aphérèse PRP
- Pour ce protocole, sélectionnez les donneurs de plaquettes conformément aux lois italiennes: les donneurs de plaquettes doivent être âgés de 18 à 65 ans, avec des paramètres normaux de pression et de numération globulaire et une numération plaquettaire d’au moins 180 x 109 plaquettes / L23. Les donneurs admissibles ne peuvent pas prendre d’antiplaquettaires ou d’anticoagulants dans la semaine précédant le don.
- Effectuer plasma-plaquettes-aphérèse à l’aide d’un système automatisé de prélèvement sanguin, conformément aux instructions des fabricants et aux lois nationales23, pour obtenir 1 unité de plasma riche en plaquettes (PRP) à donneur unique. Recueillir le PRP dans la solution anticoagulante de citrate d’adénine Dextrose Solution A (ACD-A).
NOTE: L’aphérèse plaquettaire est réalisée avec une procédure continue; Le temps de collecte est compris entre 40 min et 90 min. La quantité de DCA administrée aux donneurs et la durée des interventions dépendent des caractéristiques du donneur, p. ex. hématocrite et jauge d’aiguille.
- Caractéristiques des unités PRP
REMARQUE: L’étape suivante est généralement effectuée automatiquement par le système automatisé de prélèvement sanguin pendant la procédure plasma-plaquet-aphérèse. Veuillez consulter le manuel d’instructions du fabricant.- Resuspendre les unités PRP recueillies par aphérèse dans une quantité adéquate de solution de conservation avec la quantité minimale de plasma résiduel, nécessaire pour maintenir un pH > 6,4 pendant toute la durée de stockage, jusqu’à un volume final moyen de 180 mL net de la solution anticoagulante (environ 40 mL).
NOTE: Selon la loi italienne, les contrôles de qualité doivent évaluer que la numération plaquettaire (PLT) est d’au moins 2,0 x 1011 PLT / unité, tandis que les leucocytes résiduels doivent être inférieurs à 1 x 106 cellules / unité. - Conserver le PRP leucodéplé et irradié pendant 5 jours au maximum à 22 °C ± 2 °C sur un agitateur plaquettaire avant toute nouvelle manipulation23.
- Resuspendre les unités PRP recueillies par aphérèse dans une quantité adéquate de solution de conservation avec la quantité minimale de plasma résiduel, nécessaire pour maintenir un pH > 6,4 pendant toute la durée de stockage, jusqu’à un volume final moyen de 180 mL net de la solution anticoagulante (environ 40 mL).
- Dilution du PRP
- Immédiatement avant de commencer la dilution du PRP, effectuer une numération PLT avec un hémocytomètre en utilisant l’échantillon prélevé dans le sac principal à travers une pointe perforante.
NOTE: Effectuer les étapes suivantes de la stérilité sous une cagoule de classe II pour les risques biologiques. Portez un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, gants et lunettes de protection) pendant la procédure. - Diluer le PRP avec une quantité adéquate de NaCl stérile à 0,9 % jusqu’à une concentration finale de 0,32 x 10 9± 0,03 x 109 PLT/mL, ce qui simule la concentration moyenne de PLT dans le sang périphérique.
- Profitant d’un pic perçant pour les poches de sang, divisez le PRP dilué en sacs de collecte vides de 300 ml pour atteindre un volume net de 190 mL/sac.
- Utiliser une partie aliquote de PRP dilué résiduel (habituellement 1 mL) pour effectuer des contrôles de qualité évaluant les contaminations microbiennes possibles. Effectuer un essai de stérilité en suivant les instructions du fabricant dans un laboratoire de microbiologie (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : Utilisez des flacons de culture spécifiques aux hémocultures aérobies, qui sont capables d’effectuer la culture qualitative et la récupération de micro-organismes aérobies (principalement des bactéries et des levures) à partir d’échantillons de sang de petit volume. - Conservez les sacs de PRP dilués à −80 °C pendant un maximum de 2 mois avant la décongélation.
- Immédiatement avant de commencer la dilution du PRP, effectuer une numération PLT avec un hémocytomètre en utilisant l’échantillon prélevé dans le sac principal à travers une pointe perforante.
2. Préparation de lysat plasmatique riche en plaquettes (PRP-L)
- Décongélation
- Avant de commencer la procédure de décongélation, assurez-vous qu’un bain chaud est réglé à 37 °C. Mettez les sacs PRP dans le bain chaud et attendez jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés.
- Collecte PRP-L
- Centrifuger les sacs PRP à 3000 x g pendant 30 min à température ambiante.
NOTE: Les étapes suivantes doivent être effectuées en stérilité sous une hotte de classe II pour risque biologique. - En exploitant la pointe perforante du sac de transfert, connectez le sac centrifugé avec un sac de transfert stérile vide de 300 mL. Transférez soigneusement le surnageant PRP-L, tout en évitant les débris, dans le nouveau sac. Dans la mesure du possible, utilisez une presse à sac.
- Scellez le tube de connexion de l’unité PRP-L avec un scellant à sacs.
- Centrifuger les sacs PRP à 3000 x g pendant 30 min à température ambiante.
- PRP-L aliquote
REMARQUE : Une unité de départ contenant 190 ml de PRP (voir l’étape 1.3.3.) est suffisante pour remplir deux trousses de gouttes ophtalmiques (pour plus de détails sur les dispositifs médicaux spécifiques utilisés pour l’application et la conservation des gouttes ophtalmiques à partir de composants sanguins, voir le tableau des matériaux). Les trousses de gouttes ophtalmiques doivent être ouvertes sous une hotte de classe II avec les flacons entiers placés au-dessus de la seringue préconnectée et la flèche centrale du robinet d’arrêt pointant vers la gauche pour exclure le filtre antibactérien.- Prélever 30 à 60 ml de PRP-L avec une seringue stérile et relier la seringue au raccord Luer/lock sur la ligne de remplissage.
- Selon les instructions du fabricant, tournez le robinet d’arrêt d’un demi-tour pour ouvrir la ligne entre la seringue contenant du PRP-L et la seringue préconnectée. Remplissez la seringue préconnectée avec du PRP-L.
- Débranchez la seringue PRP-L, fermez le capuchon du tube de la connexion luer/lock et faites pivoter le robinet d’arrêt dans sa position d’origine. Utilisez la seringue du kit de gouttes ophtalmiques pour remplir les flacons de PRP-L.
- Répétez la procédure des étapes 2.3.1.-2.3.3. jusqu’à ce que tous les flacons applicateurs soient remplis. Assurez-vous que chaque applicateur est correctement rempli, puis scellez-les individuellement avec un scellant à sacs.
- Répétez la procédure avec un nouveau kit de gouttes ophtalmiques.
- Utiliser une petite partie aliquote de PRP-L dilué résiduel pour évaluer la contamination microbienne possible (voir étape 1.3.4.).
REMARQUE: Si le liquide atteint accidentellement le filtre antibactérien à l’extrémité de la chaîne, la seringue d’aspiration peut s’opposer à la résistance, entravant le remplissage. Pour continuer le cycle de remplissage, soulevez la section d’extrémité de la ficelle pour environ 5/6 aliquotes du filtre hydrophobe antibactérien à l’extrémité de la ficelle. Dans cette position, utilisez une nouvelle seringue stérile (d’un volume de 30 mL) qui a déjà été remplie d’air. Connectez le luer/lock femelle du filtre antibactérien et appuyez fort et à plusieurs reprises sur le piston de la seringue pour éliminer tous les résidus de composants sanguins et libérer la membrane du filtre antibactérien du liquide. Retirez la seringue et remplissez les flacons restants.
- Stockage PRP-L
- Étiquetez correctement chaque applicateur et mettez-les dans un sac en plastique. Étiquetez également le sac en plastique, en prenant soin de mettre en évidence le groupe sanguin du donneur.
- Conserver à −80 °C pendant un maximum de 24 mois avant l’affectation du patient, conformément à la loi italienne23 et aux directives24.
3. Dispense de PRP-L
- Effectuer l’assignation du patient de préférence en faisant correspondre le groupe sanguin PRP-L. Livrer les flacons applicateurs de PRP-L à l’aide d’une glacière et s’assurer que chaque flacon d’applicateur contient 1,45 mL de PRP-L, ce qui correspond à environ 45 gouttes. Informez le patient que les flacons applicateurs peuvent être conservés au domicile du patient jusqu’à 1 mois à -15 °C.
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Representative Results
La raison d’être de l’utilisation de gouttes ophtalmiques dérivées du sérum (qui est le produit sanguin le plus fréquemment utilisé pour le traitement des maladies de la surface oculaire) réside dans leur teneur en GF, qui sont presque entièrement dérivés des plaquettes circulantes. Le PRP contient un nombre significativement plus élevé de plaquettes (et, par conséquent, de GF dérivés des plaquettes) par rapport au sérum sanguin périphérique, allant de 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLT/mL. Selon la législation italienne, la numération plaquettaire dans les unités PRP doit être d’au moins 0,9 x 10 9-1 x 109 PLT/mL. Par conséquent, pour obtenir un produit qui simule l’efficacité des gouttes ophtalmiques sériques, le PRP doit être dilué à la teneur en plaquettes physiologiques avant la préparation du lysat.
Néanmoins, étant donné que la réparation tissulaire est principalement motivée par les GF dérivés des plaquettes, le dénombrement PLT seul pourrait être trompeur pour un traitement efficace des maladies de la surface oculaire. Dans la DED, qui est la maladie oculaire la plus souvent traitée avec des gouttes oculaires dérivées du sang, la production de film lacrymal et l’homéostasie sont altérées. Les produits à base de plaquettes pour le traitement de la DED devraient donc également imiter le contenu physiologique des larmes.
Identifier le PRP-L le plus approprié pour traiter les maladies de la surface oculaire, décrit à l’étape 1.3.2. du présent protocole, nous avons évalué de manière préliminaire différentes dilutions de PRP, en fonction de leur teneur en PLT (entre 0,7 x 10 9/mL et 0,3 x 109/mL), et certaines GF représentatives de celles connues pour être impliquées dans la réparation des tissus oculaires12,20,21.
La numération plaquettaire a été réalisée avec un hémocytomètre, tandis que les GF ont été évalués au moyen d’un test de quantification des protéines multiplex. Le test a été effectué comme décrit précédemment25 conformément aux instructions du fabricant. Les GF présentés dans ce manuscrit ont été sélectionnés pour la quantification après un examen préliminaire de 36 GF et DFG réalisés sur lysat PRP avec un réseau protéique semi-quantitatif. La quantification de Luminex a été réalisée sur 3 des 36 GF criblés : EGF et PDGF (qui se sont avérés être les plus abondants dans nos lysats PRP) et les isoformes TGFβ-1,2,3 (dont la teneur est importante pour le traitement de la surface oculaire21). Les teneurs en EGF et en PDGF ont été mesurées car elles peuvent influencer l’efficacité du PRP-L22, tandis que les isoformes TGFβ ont été sélectionnées pour leur rôle connu dans la régulation de la signalisation immunitaire21.
Étant donné que les réseaux de protéines font partie d’une autre étude in vitro sur la caractérisation de différents PRP26, ces données ne sont pas présentées dans ce manuscrit.
Nous avons évalué quantitativement l’EGF, le PDGF et le TGFβ dans les lysats PRP de deux donneurs différents (D1 et D2), précédemment dilués entre 0,7 x 10 9-0,3 x 10 9 PLT/ml dans0,9 % de NaCl. La figure 2 montre les résultats de la dilution de 0,3 x 109 PLT/mL, qui s’est avérée très similaire à la composition lacrymale.
La dilution de 0,3 x 109 PLT/mL a été choisie en fonction des données de la littérature sur la composition des larmes. Les valeurs de l’EGF se sont avérées assez faibles par rapport à la valeur moyenne de déchirure, mais toujours dans la plage de normalité27. Même le PDGF, bien que très variable entre les deux donneurs considérés, était toujours comparable à la concentration retrouvée dans les larmes normales20. Enfin, le TGFβ-1 s’est avéré être l’isoforme la plus abondante dans le PRP-L, semblable aux déchirures21.
Une fois que la dilution PLT la plus appropriée pour préparer le PRP-L par aphérèse a été identifiée, l’unité de médecine transfusionnelle a commencé à distribuer ces produits aux patients atteints de troubles de la surface oculaire en 2015. Les ophtalmologistes ont régulièrement recueilli les questionnaires de l’IDSO pour surveiller les symptômes de la dysfonction émorquée; le test OSDI évalue les mesures de la qualité de vie, telles que la perception de l’irritation oculaire et la façon dont elle affecte le fonctionnement lié à la vision. Le questionnaire, créé par le groupe de recherche sur les résultats d’Allergan Inc. en 1995 et maintenant accepté comme un instrument valide pour surveiller la DED, est soumis aux patients et analysé comme décrit précédemment28,29.
Ici, nous montrons les résultats agrégés des tests OSDI des patients atteints de DED traités entre janvier 2020 et janvier 2021 (n = 27). Après un traitement de 6 mois avec le PRP-L, les scores OSDI ont diminué de 56 ± 21 à 45 ± 21, indiquant une amélioration de la qualité de vie des patients (Figure 3).
Bien que ces données soient toujours dans la gamme sévère et ne concernent pas les résultats cliniques d’efficacité, ils suggèrent que les patients atteints de dysfonction érectile considèrent le PRP-L comme un produit utile qui améliore l’inconfort oculaire; Cet aspect devrait être étudié plus avant dans des essais cliniques prospectifs visant à évaluer son efficacité dans le traitement des maladies de la surface oculaire.
Dans le tableau 1, nous présentons une comparaison de la méthode de production actuelle avec une autre méthode de préparation du PRP-L allogénique pour les gouttes ophtalmiques30 et à d’autres fins22. À notre connaissance, le protocole30 de Zhang et le protocole actuel sont les seules méthodes publiées pour produire du PRP-L pour la surface de l’œil. Dans les deux cas, le PRP-L est obtenu par aphérèse; les différences entre les deux protocoles, principalement en ce qui concerne le nombre de cycles de congélation et de dégel et les étapes de centrifugation, devraient être comparées afin d’améliorer la production de PRP-L. Néanmoins, il n’a pas été prouvé que ces différences méthodologiques nuisaient à la capacité de régénération du PRP-L testé sur d’autres tissus22.
Figure 1: Principales étapes du protocole pour la préparation du PRP-L. (A) Schéma du protocole, de la collecte du PRP à la préparation et à la dispense du PRP-L. B) Des photos représentatives des principales étapes des protocoles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification par Luminex des facteurs de croissance dérivés des plaquettes pour la dilution de 0,3 x 109/mL du PRP-L. (A) Facteur de croissance épidermique (EGF); (B) facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF); (C) facteur de croissance transformant-isoforme bêta 1 (TGFβ1); (D) facteur de croissance transformant-bêta isoforme 2 (TGFβ2); (E) facteur de croissance transformant-bêta isoforme 3 (TGFβ3). Les valeurs sont exprimées en pg/mL, moyenne ±écart type de trois mesures indépendantes. D1 et D2 sont deux donneurs de plaquettes différents. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Scores OSDI agrégés des patients atteints de DED traités par PRP-L entre janvier 2020 et janvier 2021 à l’unité d’ophtalmologie de l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 patients. Les résultats agrégés du score OSDI sont représentés sous forme d’erreur moyenne ± type, la valeur de p a été calculée à l’aide d’un test t apparié à un logiciel d’analyse de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Cet article | PRP-L pour l’œil (étude in vitro )29 | PRP-L à d’autres fins21 | |
| Source | APHÉRÈSE des PLT | APHÉRÈSE des PLT | Aphérèse et sang total |
| Cycles de gel et de dégel | 1 (à -80 °C) | 2 (à -80 °C) | 1-3 (à -20 °C et -80 °C) |
| Température de stockage | à -80 °C | à -80 °C | à -20 °C et -80 °C |
| Vitesse de centrifugation avant stockage | 3000 x g/30 min | 3500 x g/30 min | 400-3000 x g/6 min -30 min |
| Filtration avant stockage | Non | Oui | Non/Oui |
Tableau 1 : Comparaison des protocoles de préparation du PRP-L allogénique à partir de produits à base de plaquettes recueillis par aphérèse.
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Discussion
Ces dernières années, l’utilisation clinique de produits à base de plaquettes pour les pathologies de surface oculaire a augmenté, mais leur diffusion est entravée par le manque de robustesse scientifique. Cela est principalement dû à la grande hétérogénéité des sources de donneurs et des protocoles de préparation, qui ne sont souvent pas entièrement divulgués ou ne sont pas spécifiquement conçus aux fins pour lesquelles ils sont dispensés. En particulier, les informations sur les produits à base de plaquettes recueillies par aphérèse font encore défaut. Par conséquent, le but du présent travail était de décrire le traitement étape par étape des lysats plasmatiques riches en plaquettes (PRP-L) obtenus par aphérèse pour le traitement de la DED.
Le PRP-L est une source optimale pour la production de gouttes ophtalmiques puisqu’il contient plus de GF que les autres produits sanguins22 et, par rapport au sérum ou au PRP, sa production ou son stockage sont peu coûteux et simples. Pour obtenir le PRP-L, les plaquettes sont soumises à une lyse (habituellement par un ou plusieurs cycles de congélation et de décongélation) pour libérer leur contenu. Ce procédé garantit une solution enrichie en molécules actives qui stimulent la régénérationtissulaire 22,26. Un nombre croissant de maladies ont été traitées avec le PRP-L 22, mais l’indication d’utilisation en ophtalmologie est encore faible en raison des faibles critères de standardisation dans la collecte plaquettaire et la production de PRP-L 3,22.
Les produits allogéniques à base de plaquettes doivent être préférés car ils sont plus standardisables que les produits autologues, tant en termes de caractéristiques du donneur que de méthode de préparation. L’état de santé du patient peut affecter la qualité du produit 6,16,17, tandis que les trousses internes pour prélever les plaquettes autologues du sang total lorsque les services transfusionnels ne sont pas directement disponibles ne répondent pas à la qualité standard requise en médecine transfusionnelle31.
À notre connaissance, il n’existe aucune étude clinique caractérisant l’utilisation du PRP-L allogénique en ophtalmologie 3, alors qu’il existe peu de rapports concernant les gouttes ophtalmiques autologues de PRP-L3 et une seule étude utilisant le PRP-L allogénique obtenu à partir de sang de cordon ombilical pour traiter les patients atteintsde maladies de la surface oculaire32. Bien que le PRP-L allogénique soit mentionné dans les lignes directrices cliniques24 et que son utilisation ait été proposée 3,30, il n’existe toujours pas de preuves de son efficacité par rapport à d’autres traitements et à d’autres produits sanguins (p. ex. sérum). Ici, le protocole présenté vise à aider la communauté scientifique à développer des méthodes de production communes et à mettre en lumière les différences méthodologiques.
Ici, nous avons décrit la production de PRP-L à partir de PRP allogénique collecté par aphérèse. Les produits allogéniques à base de plaquettes pour obtenir des lysats plaquettaires peuvent également être prélevés à partir de couches leucocytaires (BC), et les deux sources ont été déclarées également31. Les BC sont obtenus à partir de donneurs groupés (habituellement quatre ou cinq), minimisant ainsi les différences interindividuelles. À l’inverse, la mise en commun augmente le risque de transmission d’agents infectieux ou de prions ou de stimulation d’une réponse allogénique31,33. L’aphérèse est une procédure complexe et invasive, et seule une minorité de donneurs y sont admissibles ou s’y conforment34. Néanmoins, les produits à base de plaquettes obtenus par aphérèse sont exempts d’autres cellules sanguines circulantes résiduelles et contiennent une plus grande quantité d’IFP35. Pour ces raisons, les travaux actuels sont axés sur le développement d’études cliniques pour comparer le PRP-L à partir de ces deux sources différentes.
Dans ce protocole, la concentration initiale des PLT dans les unités PRP recueillies par aphérèse était en moyenne de 1 x 109/mL, ce qui correspond aux concentrations déclarées pour d’autres produits à base de plaquettes22. Dans cette méthode, les PLT sont ensuite dilués avec une solution de NaCl à 0,9 % à 0,3 x 109/mL. D’autres protocoles font état de l’utilisation de plasma pour la dilution22.
Peu d’études ont rapporté l’utilisation du PRP-L en ophtalmologie; dans ces cas, des gouttes ophtalmiques autologues ont été préparées à des concentrations de PLT allant de 0,5 x 10 9/mL-1 x 109/mL36,37,38. Comme on l’a vu plus haut, des marqueurs de normalisation sont souhaitables et aideraient également à déterminer la dilution appropriée. Ici, par exemple, nous rapportons la concentration de certains GF pivots dans le PRP-L. Les teneurs en EGF et en PDGF influencent l’efficacité du PRP-L22, tandis que les isoformes TGFβ sont impliquées dans la régulation de la signalisation immunitaire21,39, et leur concentration est finement régulée. Par conséquent, la concentration de TGFβ dans les gouttes ophtalmiques à base de plaquettes peut non seulement influencer l’efficacité, mais aussi provoquer des effets néfastes potentiels39; Il convient donc de l’étudier attentivement avant de définir la dilution appropriée. Néanmoins, la dilution choisie - 0,3 x 109 PLT/ml - était basée sur la teneur en GF dans les larmes21,25. Zhang et al. ont précédemment comparé les gouttes ophtalmiques à base de sérum, à la fois autologues et allogéniques, et les lysats à base de plaquettes pour leur teneur en GF et pour leur capacité à favoriser la régénération des cellules cornéennes in vitro30. L’étude a montré comment ces produits ont des caractéristiques comparables, le PRP-L ayant une concentration d’EGF plus élevée mais une fibronectine plus faible. Dans leur protocole, le processus de congélation / décongélation a été répété deux fois, la centrifugeuse a été réalisée à 3500 x g pendant 30 minutes et le lysat plaquettaire stocké à -80 ° C30.
La congélation et la décongélation sont en effet une étape critique; la plupart des protocoles (y compris celui-ci) ont été élaborés avec une congélation de −80 °C et une congélation de 37 °C, mais la congélation a également été signalée à −24 °C, −196 °C et −150 °C 22,33 Même le nombre de cycles de gel/dégel effectués est variable, allant de 1 à 522,33. Un nombre limité d’études ont également rapporté un traitement par sonication ou solvant/détergent pour obtenir des lysats plaquettaires22,33. D’autres variables méthodologiques précédemment rapportées dans la préparation du PRP-L concernent l’étape de centrifugation - entre 300 x g et 10000 x g, de 2 min à 60 min - et le stockage à long terme, qui, dans la plupart des cas, est à −80 °C, bien que des produits similaires aient également été stockés directement à −20 °C22. Les conditions de stockage, en particulier, devraient être surveillées attentivement car elles pourraient affecter la disponibilité et l’activité des GF contenus dans les lysats. Dans ce contexte très hétérogène, les contrôles de qualité et les études cliniques prenant en considération la libération de facteurs biogènes et les différences dans l’effet thérapeutique doivent être évalués d’urgence.
Enfin, nous montrons ici comment cette méthode a été évaluée de manière significative avec un résultat positif d’une analyse globale de patients atteints de sécheresse oculaire recevant PRP-L pendant 6 mois (questionnaire OSDI3). Bien que prometteur, l’IDSO seul n’est pas suffisant pour déterminer l’efficacité du PRP-L dans le traitement de la DED et d’autres maladies de la surface oculaire, et des études cliniques sur l’utilisation du PRP-L allogénique sont justifiées. De plus, les différences possibles de composition du produit dues à d’autres étapes méthodologiques (c.-à-d. congélation et décongélation, centrifugation, stockage) devraient être comparées afin d’optimiser la procédure méthodologique.
En conclusion, la grande hétérogénéité des sources et des protocoles sanguins entrave encore la traduction définitive des produits sanguins dans le traitement clinique des maladies de la surface oculaire. Bien que le PRP-L soit un produit émergent présentant certains avantages, d’autres études sont nécessaires pour valider son utilisation et élaborer des lignes directrices communes. Le partage et le détail du protocole de préparation peuvent élargir la facilité d’utilisation et faire la lumière sur les étapes critiques.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier la « Casa del Dono di Reggio Emilia » pour avoir fourni des concentrés de plaquettes dérivés de donneurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
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