Summary
인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 효소적 또는 기계적 패시징과 관련된 한계를 피하기 위해 EDTA 매개 탈유착을 사용하여 인간 포피 섬유아세포의 피더 세포층에 유지되는 hESC 또는 hiPSC 콜로니를 수확하기 위한 빠르고 효과적이며 비용 효율적인 고수율 방법을 확립했습니다.
Abstract
인간 만능 줄기 세포(인간 배아 줄기 세포, hESC 및 인간 유도 만능 줄기 세포, hiPSC)는 원래 장기 배양에서 미분화 상태로 유지하기 위해 다양한 유형의 공급 세포에서 배양되었습니다. 이 접근법은 피더가 없는 배양 프로토콜로 대체되었지만, 여기에는 더 많은 비용이 드는 시약이 포함되며 프라이밍 상태로의 전환을 촉진하여 세포의 분화 능력을 제한할 수 있습니다. 피더와 피더가 없는 조건 모두에서 패스페이징을 위한 hESC 또는 hiPSC 콜로니의 수확은 배양 확장을 위한 필수 절차입니다.
공급세포에서 배양한 hESC/hiPSC를 패시징하기 위한 쉽고 높은 수율 절차를 제공하기 위해 칼슘 킬레이터 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)에 의해 유도된 탈부착을 사용한 수확 방법을 확립했습니다. 우리는 이 접근법을 현미경으로 메스로 콜로니를 분리하는 원래의 기계적 수확 접근법과 비교하여 결과 통과 세포의 수율과 품질을 평가했습니다(효소 수확과 관련된 시약 변동성을 피하기 위해 기계적 수확이 비교기로 선택됨).
한 세트의 실험에서, 두 개의 서로 다른 hESC 라인이 인간 포피 섬유아세포의 공급세포층에 유지되었습니다. 각 라인은 EDTA 기반 또는 기계적 수확을 사용하여 여러 통로를 거쳤으며 콜로니 크기 및 형태, 세포 밀도, 줄기 마커 발현, 배아체의 세 생식층에 대한 분화 및 게놈 이상에 대해 평가되었습니다. 또 다른 실험에서는 두 개의 서로 다른 hiPSC 라인에 EDTA 기반 채취를 사용하여 유사한 결과를 얻었습니다. EDTA에 의한 비부착은 시간을 절약하고 기계적 수확에 비해 더 유리한 크기와 더 균일한 형태의 콜로니를 더 많이 수율로 얻을 수 있었습니다. 또한 효소 수확보다 빠르며 효소 배치 변동성이 발생하지 않았습니다. EDTA 유도 탈접착 분석법은 또한 다운스트림 사용 및 분석을 위해 필요한 경우 hESC/hiPSC 라인을 feeder cell 기반 배양에서 feeder-free 조건으로 쉽게 전달할 수 있습니다.
Introduction
체외에서 hESC 및 hiPSC의 적절한 유지는 인간 세포 및 발생 생물학의 여러 연구 방법을 위한 기본적이고 편리한 방법론입니다. hESC와 hiPSC의 고유한 분화 욕구로 인해 in vitro에서 미분화 상태를 유지하려면 특별한 주의와 주의가 필요합니다. 따라서 방법론적 변동성을 최소화하면서 hESC 및 hiPSC의 유지 관리 및 패세이징을 위한 비용 효율적인 프로토콜을 개발하는 것은 일반적으로 매우 유용합니다.
원래, hESC와 hiPSC는 미분화 상태 1,2,3의 장기 배양 및 유지를 돕기 위해 다양한 유형의 공급세포에서 배양되었습니다. 최근에는 피더 세포를 완전히 다루지 않기 때문에 피더가 없는 조건에서의 배양이 표준이 되었습니다4. 그러나 일부 실험실과 핵심 시설에서는 여전히 공급세포에서 hESC 또는 hiPSC를 배양하고 있습니다. 피더가 없는 배양은 콜로니 부착을 보장하기 위해 특수 조성의 배양 배지와 배양 표면의 일부 코팅 형태(주요 세포외 기질[ECM] 성분 또는 상용 ECM 화합물 또는 상업적으로 이용 가능한 코팅판 사용)를 사용해야 하기 때문에 비용이 더 많이 듭니다. 비용은 사소하지 않으며 hESC 또는 hiPSC 기반 연구 및 개발에 관심이 있는 일부 실험실에 잠재적인 재정적 방해가 될 수 있습니다. 더욱이, feeder-free 조건에서의 배양은 hESC와 hiPSC를 feedercell5에서 유지되는 것보다 덜 순진한 상태로 유도하는 경향이 있으며, 이는 후속 분화를 손상시키고 유전적 변이6를 유발할 수 있다.
역사적으로, 공급세포에서 배양된 hESC 및 hiPSC의 패시징은 기계적 수확(현미경 하에서 콜로니를 절제하기 위해 메스를 사용)을 수반했으나7 이는 나중에 콜로니 또는 해리된 세포를 분리하기 위해 부드럽게 긁어내거나 사용하지 않는 효소 분해로 대체되었습니다. 기계적 채취는 지루하고 정밀한 미세 수술이 필요합니다. 효소 수확은 배치 간 효소 차이로 인해 효율이 달라질 수 있으며, ROCK 억제제8,9에 의해 대응되지 않는 한 세포 사멸을 촉진하고 비정상 핵형9의 발생률을 증가시키는 완전한 해리를 선호하는 경향이 있다.
기계적 및 효소적 수확의 단점을 피하면서 공급 세포에서 hESC 및 hiPSC를 배양하는 데 드는 더 낮은 비용과 더 큰 분화 가능성을 활용하기 위해 EDTA 매개 탈접착을 사용하여 인간 포피 섬유아세포의 공급층에서 유지되는 hESC 및 hiPSC 콜로니를 수확하기 위한 빠르고 효과적이며 비용 효율적인 고수율 방법을 확립했습니다. 우리는 수율, 가변성 및 줄기 세포 품질을 기계적 수확으로 얻은 것과 비교했습니다(이 접근 방식이 수반하는 추가 가변성 때문에 효소 분해와 비교하지 않았습니다). EDTA 매개 비접착은 다운스트림 사용 및 분석을 위해 필요한 경우 콜로니를 피더 기반 배양에서 피더가 없는 조건으로 옮기는 데에도 효과적입니다. 이 방법은 EDTA에 의한 비접착이 피더가 없는 배양에 널리 사용되는 방법이기 때문에 일관된 패세이징 방법으로 전이를 제공합니다.
Protocol
이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 인간 섬유아세포 배양 및 공급세포층 제조
- 씨앗 0.5 × 10 각 T-75 배양 플라스크당6 개의 인간 포피 섬유아세포(이하 "공급세포"라고 함)를 20mL의 Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)과 (w/) 10% 소 태아 혈청(FBS)(이하 "공급세포 배지"라고 함)을 넣습니다.
- 공급 셀이 90% 합류에 도달하면 배지를 제거하고 플라스크당 10mL의 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)으로 3배 세척하여 배지의 요인에 의한 트립신 억제를 방지합니다. 각 플라스크에 2mL의 트립신-EDTA를 추가하고 플라스크를 37°C/5%CO2 인큐베이터에 5분 동안 또는 공급기 셀이 플라스크에서 분리될 때까지 둡니다. 현미경으로 세포의 분리를 세포 또는 단일 세포의 부유 응집체로 관찰합니다.
- 각 플라스크에 미리 예열된 신선한 피더 셀 배지 5mL를 추가하여 트립신-EDTA를 비활성화하고 피펫팅을 통해 피더 셀을 부드럽게 부유시킵니다.
- 피더 셀을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 캡하고 200× g 에서 5분 동안 원심분리하여 피더 셀을 펠릿화합니다.
- 피더 셀 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 4mL의 신선한 공급 세포 배지에 조심스럽게 재현탁시킵니다. 세포 계수 챔버 또는 기타 세포 계수 장치를 사용하여 계수하기 전에 공급 세포가 완전히 재현탁되었는지 확인하십시오.
- 팽창을 위해 필요한 수의 새로운 T-75 배양 플라스크에 0.5 × 106 feeder cell을 추가하고 각 플라스크에 20mL의 신선한 feeder cell 배지를 추가합니다. 공급 세포가 90% 합류에 도달할 때까지 37°C/5%CO2 인큐베이터에서 배양 플라스크를 배양합니다.
알림: 피더 셀은 최소 25개의 통로까지 사용할 수 있습니다. - hESC/hiPSC 배양에 사용할 35mm 조직 배양 접시 수에 필요한 공급 세포 수를 계산합니다.
참고: 일반적으로 조직 배양 접시당 3.0 × 10개의5 개의 공급세포는 공급세포의 합류층을 생성하기에 충분합니다. - 공급 세포의 증식을 방지하려면 두 가지 방법 중 하나로 유사분열 포획해야 합니다.
참고: 두 방법 모두 유사분열적으로 포획된 공급세포의 대량의 배치를 생성하고 나중에 사용할 수 있도록 부분 표본으로 동결할 수 있습니다.- 필요한 모든 피더 셀을 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 피더 셀 배지를 총 5mL 부피로 보충하여 감마선 조사에 의한 유사분열 정지를 수행합니다. 즉시 실온에서 감마선 조사 기계로 운반하고 방사선을 조사하여 피더 셀을 유사 분열 적으로 체포합니다(300kV 및 10mA에서 20분).
참고: 운송이 지연되면 공급 셀이 50mL 원심분리기 튜브의 벽에 원치 않게 부착될 수 있습니다. 운송에 몇 분 이상이 필요한 경우 튜브를 지속적으로 저어 운송 중에 피더 셀이 매달려 있는지 확인하십시오. - 5mL의 피더 셀 배지에 필요한 모든 피더 세포를 50mL 원심분리 튜브로 옮겨 미토마이신 C를 사용하여 유사분열 정지를 수행한 다음 20μg/mL 미토마이신 C를 함유한 15mL의 피더 셀 배지를 추가하고 37°C/5% CO2 인큐베이터에서 3시간 동안 배양합니다. 37°C PBS 20mL를 첨가하고, 200× g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고, PBS 세척을 2회 더 반복하고, 공급 세포 배지에 재현탁시킵니다.
- 필요한 모든 피더 셀을 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 피더 셀 배지를 총 5mL 부피로 보충하여 감마선 조사에 의한 유사분열 정지를 수행합니다. 즉시 실온에서 감마선 조사 기계로 운반하고 방사선을 조사하여 피더 셀을 유사 분열 적으로 체포합니다(300kV 및 10mA에서 20분).
- 공급세포가 유사분열적으로 포획된 후, 조직 배양 후드로 돌아가 다음과 같이 35mm 조직 배양 접시당 3.0 × 105 세포로 공급기를 플레이트링합니다. 공급세포가 완전히 재현탁되었는지 확인하고, 공급세포 배지를 추가하여 mL당 1.5 × 105 의 공급세포 농도에 도달하고, 이 공급세포 현탁액 2mL를 각 35mm 조직 배양 접시에 추가합니다.
- 배양 접시를 37°C/5%CO2 인큐베이터로 옮깁니다. 공급 세포가 고르게 분포되도록 하려면 배양 접시를 인큐베이터 선반에서 천천히 그러나 단단히 앞뒤로 3번 움직인 다음 잠시 멈춘 다음 왼쪽에서 오른쪽으로 3번 동일한 작업을 수행합니다. 접시를 다시 움직이지 말고 인큐베이터 도어를 부드럽게 닫으십시오.
- 24시간 후 공급세포 배지에서 10% 혈청 교체(SR)가 포함된 IMDM으로 전환합니다. 그 이후에는 3일마다 이 매체를 교체하십시오. 피더 셀은 처음 3일 후에 사용할 준비가 됩니다.
2. hESC 또는 hiPSC 콜로니의 기계적 수확
- 80% Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 20% SR, 1mM 글루타민 대체물 100x, 1mM 비필수 아미노산(NEAA) 1mM, 1mM 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 0.1mM 2-메르캅토에탄올 및 10ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)로 구성된 예열 hESC 배지. hESC 배지는 공급전지에서 hESC 또는 hiPSC의 배양에 사용됩니다.
- 유사분열적으로 포획된 공급세포가 포함된 신선한 35mm 조직 배양 접시를 취하고, hESC/hiPSC 콜로니를 옮기기 최소 30분 전에 bFGF가 함유된 1.2mL의 hESC 배지로 공급세포 배지를 교체합니다.
- hESC/hiPSC 콜로니가 포함된 배양 접시를 유사분열로 포화된 공급 세포에 놓고 층류 후드 내에 배치한 10배 배율의 현미경 아래에 놓습니다. 멸균 메스를 사용하여 각 군체의 둘레를 조심스럽게 자른 다음 각 군체를 거의 동일한 5-6 조각으로 자릅니다. 메스 블레이드 끝으로 콜로니 조각을 조심스럽게 들어 올려 피더 셀 층에서 분리되어 배지에서 자유롭게 떠오르도록 합니다.
- 콜로니 내의 hESC/hiPSC에 비해 덜 뚜렷한 핵을 가진 더 작은 세포의 섬으로 나타나는 분화 세포가 포함된 콜로니 영역을 피하십시오.
- 1mL 피펫을 사용하여 자유롭게 떠다니는 콜로니를 feeder cell이 포함된 새로운 배양 접시로 옮깁니다. 나중에 서로 자라지 않도록 식민지를 분리하십시오. 배양 접시를 세포 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 다음 날까지 접시를 방해하지 마십시오.
- 다음 날, bFGF가 함유된 hESC 배지 600μL를 최종 부피 1.8mL에 조심스럽게 추가합니다. hESC + bFGF 배지를 다음 통과까지 매일 교체하십시오(일반적으로 1주일 후).
3. EDTA 매개 탈부착을 이용한 hESC 또는 hiPSC 콜로니 수확
- 유사분열적으로 포획된 공급 세포가 있는 신선한 배양 접시를 취하고 콜로니 이동 최소 30분 전에 10% SR이 포함된 IMDM에서 1.2mL의 예열된 hESC + bFGF 배지로 전환합니다.
- hESC 또는 hiPSC 콜로니가 포함된 배양 접시를 한 번에 하나씩 취급하십시오. hESC + bFGF 배지를 제거하고 1mL의 실온 DPBS로 콜로니를 세척하여 부착되지 않은 세포와 세포 파편을 제거합니다. 0.5mM EDTA 1mL를 추가하고 37°C에서 1분 동안 배양합니다. 층류 후드에 온난화판이 있는 경우 더 나은 접착력을 위해 이 단계와 온난화판의 섹션 4 단계를 수행합니다.
- 1분 배양 후 EDTA 용액을 제거하고 1mL 피펫을 사용하여 hESC + bFGF 배지 1mL를 조심스럽게 추가합니다. 동일한 피펫으로 부드럽게 삼각 작용하여 공급 세포 층에서 콜로니를 방출합니다. 피더 셀 층이 느슨해지고 별도의 덩어리로 접힐 때까지 조심스럽게 삼중주의를 계속합니다. 피펫 팁으로 피더 셀 층을 당겨 빼냅니다.
- 새로운 1mL 피펫을 사용하여 현탁된 hESC/hiPSC 콜로니를 1:5의 비율로 분할하여 공급세포와 hESC + bFGF 배지가 포함된 새로운 배양 접시에 옮깁니다. 군체는 각각의 새로운 배양 접시 내에서 고르게 분포하는 경향이 있지만 접시를 좌우로 부드럽게 움직여 이를 용이하게 합니다. hESC + bFGF 배지를 다음 통과까지 매일 교체하십시오(일반적으로 1주일 후).
Representative Results
아래에 문서화된 분석 및 비교에서는 2개의 hESC 라인(각각 WiCell 및 Karolinska Institute의 H9 및 HS429)과 2개의 hiPSC 라인(NCS001 및 NCS002, 둘 다 인간 만능 줄기 세포를 위한 노르웨이 핵심 시설에서 생성)을 사용했습니다. 그림과 표에 제시된 데이터는 hESC 라인에서 얻은 것이지만 hiPSC 라인에서도 완전히 유사한 결과를 얻었습니다.
우리 손에서 기계적 수확은 콜로니가 직경이 ~200-250μm인 약 5-6개의 덩어리로 분할되는 반면, EDTA에 의한 비접착 후 분쇄가 뒤따르는 경우 각 콜로니는 직경이 ~60μm인 ~10-20개의 덩어리로 분할되었습니다. EDTA로 수확한 각 덩어리의 세포 수는 ~20개로 추정됩니다. 콜로니를 메스로 이 크기의 덩어리로 분할하는 것은 비실용적이기 때문에, 이러한 점에서, EDTA에 의해 유도된 탈부착은 콜로니 세포 생존에 더 유리한 크기의 덩어리를 생성하기 때문에 우수하다10,11.
EDTA를 사용하여 채취한 hESC/hiPSC 콜로니는 기계적으로 채취한 콜로니에 비해 크기와 모양이 더 균질했습니다(그림 1A-F). 이는 기계적 수확에 필요한 절단으로 인해 가장자리가 고르지 않고 덩어리 크기가 다양하기 때문입니다. 이를 정량적으로 평가하기 위해 ImageJ-win64 프로토콜12를 사용하여 통과 5일 후 콜로니 원형도(콜로니 가장자리가 얼마나 둥글었는지에 대한 척도로, 값 1은 완벽한 원을 나타냄)를 평가했습니다. 군체 순환도는 기계적으로 수확한 군체에서 현저히 낮았다(기계적 수확: 0.61 ± 0.10; EDTA 기반 수확: 0.84 ± 0.01; n = 10, p < 0.001, Mann-Whitney U-검정, U = 10).
콜로니 형성 중 수확 후 세포-세포 상호 작용의 척도인 수확 및 재도금된 콜로니의 세포 밀도는 EDTA 기반 수확 및 기계적 수확과 유사했습니다(표 1 및 그림 1G,H). 기계적으로 수확된 군체는 중앙 부위에서 괴사가 발생하는 경향이 더 컸습니다(그림 1J). 이는 모양이 다양하고 특히 기계적으로 분리된 세포 덩어리의 크기 때문인 것으로 보이며, 이러한 덩어리가 너무 크면 새로운 배양 접시로 옮겨질 때 쉽게 접힐 수 있습니다. EDTA를 사용하여 채취한 콜로니의 경우는 그렇지 않았으며, EDTA는 뚜렷한 가장자리가 있는 반투명 외관을 균일하게 나타냈습니다(그림 1I).
EDTA 기반 수확을 사용하여 2-3분 이내에 우물에 형성된 모든 군체를 기본적으로 수집할 수 있었습니다. 기계 수확을 사용하면 우물에서 모든 식민지를 수집하는 것은 지루하고 시간이 많이 걸립니다. 우리는 일반적으로 기계적 수확을 사용하여 ~30% 또는 ~20-25개의 콜로니만 수집할 수 있었고 이는 ~20분이 걸렸습니다. 마찬가지로, 콜라겐분해효소 분해 후 부드럽게 긁어내는 방법을 사용하면 전체 과정이 몇 분 밖에 걸리지 않았지만 일반적으로 모든 콜로니를 수확하는 것은 어려웠습니다. 따라서 EDTA 기반 수확은 효소 수확보다 빠르거나 빠르며 기계적 또는 효소 수확보다 더 효율적입니다.
다양한 수확 방법이 줄기 및 다능성에 미치는 영향을 평가하기 위해 먼저 EDTA 기반 또는 기계적 수확을 사용하여 20회 통과 후 얻은 콜로니에 줄기 마커에 대한 qPCR 분석(그림 2) 및 면역세포화학적 염색(그림 3 및 그림 4)을 실시했습니다. 두 방법 중 하나를 사용하여 얻은 콜로니는 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 줄기 마커의 안정적인 발현을 나타냈습니다. 그런 다음 배아체의 세 가지 생식층에 대한 분화에 의한 다능성을 평가했습니다(그림 5 및 그림 6). 두 방법 중 하나를 사용하여 20회 통과 후 얻은 hESC 또는 hiPSC에서 생성된 배아체에는 외배엽, 중배엽 및 내배엽에 대해 일반적으로 평가되는 마커를 발현하는 세포의 혼합물이 포함되어 있었습니다.
마지막으로, qPCR 기반 유전자 분석을 사용하여 각 방법으로 통과하는 hESC 및 hiPSC의 게놈 이상 발생률을 평가했습니다( 재료 표 참조). 두 가지 수확 방법 중 하나를 사용하여 20회 통과한 후 얻은 콜로니는 참조 이배체 염색체 패턴에서 약간의 편차를 보인 몇 가지 예를 보여주었습니다(평가된 이상은 일반적으로 hiPSC의 재프로그래밍과 관련이 있지만 hESC에서도 얻을 수 있음)(그림 7). 그러나 이러한 편차의 패턴은 두 수확 방법 중 하나를 얻은 군체에서 본질적으로 동일했으며, 이는 수확 방법과 관련이 없음을 나타냅니다.
그림 1: EDTA 기반 또는 기계적 수확 후 콜로니 형태 및 세포 밀도. (A-F) (A-C) EDTA 기반 또는 (D-F) 기계적 수확을 사용하여 20회 통과 후 5일 동안 피더가 없는 배양에서 확립된 H9 hESC 콜로니의 대표적인 명시야 이미지. (지,H) (G) EDTA 기반 또는 (H) 기계적 수확을 사용하여 20회 통과 후 확립된 H9 hESC 콜로니의 세포 밀도에 대한 대표적인 형광 이미지. 세포핵은 DAPI로 염색됩니다. (나,J) (I) EDTA 기반 또는 (J) 기계적 수확을 사용하여 20회 통과 후 확립된 H9 hESC 콜로니의 대표적인 명시야 이미지. 기계적으로 수확된 군체의 괴사성 중앙 영역(J의 화살표)에 주목하십시오. 모든 이미지는 20번째 통과 후 5일 후에 획득되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: hESC = 인간 배아 줄기 세포; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: EDTA 기반 또는 기계적 수확 후 생성된 두 개의 hESC 라인(H9 및 HS429)에서 줄기 마커 mRNA의 발현. 기계적 수확을 사용한 단일 통로 후, 기계적 수확을 사용한 20회 통과 후, EDTA 기반 수확(1:5 희석)을 사용하여 20회 통과 후 H9(상단 패널) 및 HS429(하단 패널) hESC에 표시된 마커의 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응. 발현 수준은 하우스키핑 유전자 ACTB (베타-액틴)의 발현 수준과 관련이 있습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어: hESC = 인간 배아 줄기 세포; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다양한 수확 조건 후 H9 hESC 라인에서 줄기 마커 단백질의 발현. 추가 패거징 전에 기계적으로 수확한 H9 hESC 콜로니의 대표적인 면역형광 염색(A-E), 기계적 수확을 사용하여 20개 통과 후(F-J), EDTA 기반 수확을 사용하여 20개 통과 후(K-O). 스케일 바 = 100 μm. 약어: hESC = 인간 배아 줄기 세포; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 다양한 수확 조건 후 HS429 hESC 라인에서 줄기 마커 단백질의 발현. 추가 통과 전 기계적으로 수확한 HS429 hESC 콜로니의 대표적인 면역형광 염색(A-E), 기계적 수확을 사용한 20회 통과 후(F-J), EDTA 기반 수확을 사용하여 20회 통과 후(K-O). 스케일 바 = 100 μm. 약어: hESC = 인간 배아 줄기 세포; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 기계적 또는 EDTA 기반 수확 후 H9 hESC 계통에서 생성된 배아체의 3개 생식층에 대한 마커 발현. (A 및 D 행) 외배엽(ECTO, TUJI), (B 및 E 행) 내배엽(ENDO, AFP) 및 (C 및 F 행) 중배엽(MESO, SMA)에 대한 마커의 대표적인 면역형광 염색. EB는 기계적 수확 20회 통과 후 (A-C) 또는 EDTA 기반 수확 20회 통과 후 생성(D-F)합니다. 스케일 바 = 40μm. 약어: hESC = 인간 배아 줄기 세포; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산; EBs = 배아체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 기계적 또는 EDTA 기반 수확 후 HS429 hESC 계통에서 생성된 배아체의 3개 생식층에 대한 마커 발현. (A 및 D 행) 외배엽(ECTO, TUJI), (B 및 E 행) 내배엽(ENDO, AFP) 및 (C 및 F 행) 중배엽(MESO, SMA)에 대한 마커의 대표적인 면역형광 염색. EB는 기계적 수확(A-C)의 20회 통과 후 생성되거나 EDTA 기반 수확의 20회 통과 후 (DF)가 생성됩니다. 스케일 바 = 40μm. 약어: hESC = 인간 배아 줄기 세포; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산; EBs = 배아체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 기계적 또는 EDTA 기반 수확을 사용하여 20개 통과 후 HS9 및 HS429 ESC 라인과 NCS002 iPSC 라인의 일반적인 게놈 이상에 대한 qPCR 기반 유전자 분석. 값 2의 기준선은 모든 염색체 마커에서 정상적인 이배체를 나타냅니다. 1 또는 3의 값은 모든 세포에서 표시된 염색체 마커의 손실 또는 이득을 각각 나타냅니다. 1과 2 사이 또는 2와 3 사이의 중간 값은 셀의 일부에서 표시된 마커의 손실 또는 이득이 있음을 나타냅니다. 수차 패턴은 두 수확 조건에서 유사합니다. 약어: ESC = 배아 줄기 세포; EDTA = 에틸렌디아민테트라아세트산; iPSC = 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세포 밀도(cells/mm2) | ||
| H9 시리즈 | 의미하다 | stdev (표준) |
| 추가 통과 전 기계적 수확 | 3918 | 263.3 |
| 기계적 수확 20 회 | 3868 | 197.7 |
| EDTA 수확 20 회 | 4080 | 127.8 |
| HS429 시리즈 | 의미하다 | stdev (표준) |
| 추가 통과 전 기계적 수확 | 5249 | 565.4 |
| 기계적 수확 20 회 | 5247 | 726.3 |
| EDTA 수확 20 회 | 4963 | 448.8 |
표 1: EDTA 기반 또는 기계적 수확 후 생성된 두 개의 hESC 라인(H9 및 HS429)에서 콜로니의 세포 밀도 비교. 세포 밀도는 기계적 수확을 사용한 단일 통과 후, 기계적 수확을 사용한 20개 통과 후 또는 EDTA 기반 수확을 사용한 20개 통과 후(1:5 희석 상태에서)에 평가되었습니다. 모든 경우에 n = 5개의 콜로니입니다.
Discussion
EDTA 매개 비부착을 사용하여 공급세포에서 배양된 hESC 및 hiPSC를 빠르고 비용 효율적으로 수확하는 방법을 설명하고, 이를 주로 메스를 사용한 기존의 기계적 수확 방법과 비교했습니다. 또한 EDTA 기반 수확을 효소 수확과 비교했는데, 이는 방법의 속도 측면이 그랬지만 결과 콜로니 품질의 측면은 비교하지 않았습니다. 그 이유는 효소 채취가 본질적으로 더 가변적이고, 게놈 이상(genomic aberations)5의 유병률이 더 높기 때문에 방법 간 차이가 모호해질 수 있기 때문이다.
EDTA 기반 수확이 다른 방법보다 빠르고 효율적이며 기계적 수확보다 더 작고 형태학적으로 더 균질한 콜로니를 생성한다는 것을 입증했습니다. 기계적 채취로 얻은 더 큰 덩어리는 중앙 괴사가 발생하기 쉬운 반면, 효소 분해는 세포 사멸에 더 취약하고 생존을 위해 ROCK 억제제와 같은 추가 치료가 필요한 분리된 hESC 및 hiPSC를 생성하는 경향이 있기 때문에 이 후자의 특징은 세포 생존과 관련하여 유익합니다. EDTA 기반 수확은 최소 20개의 통로에 사용할 수 있습니다. EDTA 기반 및 기계적 수확 방법은 콜로니 세포 밀도, 줄기 유전자의 mRNA 및 단백질 발현, 배아체의 세 생식층 분화 및 게놈 이상과 관련하여 비슷합니다. hESC 및 hiPSC의 효율성, 더 높은 수율, 더 적은 변동성 및 더 부드러운 취급이 목표라면 EDTA 기반 수확이 바람직합니다.
또한 feeder cell에서 배양된 hESC 및 hiPSC의 EDTA 기반 채취는 보다 순수한 상태를 유지할 수 있는 저렴한 방법이며 바람직한 경우 feeder 기반에서 feeder-free 배양으로 원활하게 전환할 수 있습니다.
프로토콜 내의 중요한 단계
EDTA 매개 비부착의 가장 중요한 단계는 프로토콜 섹션 3(EDTA 용액에서 배양) 및 섹션 4(트리튜레이션)입니다. EDTA 용액에 대한 노출이 1분 이상 지속되면 단일 세포로의 완전한 해리 위험이 증가합니다. 이것은 또한 조단이 너무 길거나 너무 가혹한 경우에도 발생할 수 있습니다. 후자는 피펫 팁 크기의 영향을 받습니다. 여기에 설명된 대로 1mL 세포 배양 피펫을 사용하는 것이 이상적입니다. 팁 직경이 더 작은 다른 유형의 피펫을 사용하는 것은 위험합니다.
문제 해결
공급 세포가 계속 증식하는 경우에, 유사분열 정지는 효과적이지 않으며, 신선한 배치는 가지고 가고 절차를 다시 시작해야 합니다. 콜로니가 공급 세포 층에서 느슨해지지 않으면 EDTA에 Ca2+ 가 없는지 확인하고 EDTA를 추가하기 전에 콜로니가 포함된 배양 접시를 PBS로 잘 헹구어 남아 있는 세포 배양 배지를 제거해야 합니다. 고립된 세포나 너무 작은 세포 덩어리를 생성하는 과도한 해리는 과도한 분쇄로 인해 발생할 수 있으며 새로운 군집의 형성을 손상시킬 수 있습니다. 트리튜레이션 정도는 결과 세포 덩어리의 직경이 ~60μm임을 확인하기 위해 프로토콜의 시험 실행에서 경험적으로 결정되어야 합니다. 특히 hESC/hiPSC를 수확할 준비가 되기 전에 공급층이 배양 접시에서 자발적으로 분리되는 경우, 이는 준비된 후 ~7일 이내에 공급세포를 사용하지 않았기 때문일 수 있습니다. 따라서 피더 셀의 사용 기간을 주의 깊게 모니터링해야 합니다. EDTA 노출 중에 피더 층이 해리되는 경우(여기에 사용된 피더 셀에서는 관찰된 적이 없음) 피더 셀의 유형 또는 배양 방법을 변경해야 합니다.
기술의 한계
이 기술의 주요 한계는 성공적인 결과를 얻기 위해 접착 제거 과정을 육안으로 검사해야 한다는 것입니다. 즉, 사용자는 콜로니가 피더 셀층에서 방출되고 피더 셀층이 기질에서 느슨해지는 시점을 식별하는 방법을 배워야 합니다. 그러나 이것은 어렵지 않으며 경험상 이 기술의 새로운 사용자는 몇 번의 시도 내에서 마스터할 수 있습니다.
또한 채취된 hESC 또는 hiPSC가 몇 개의 공급 세포에 의해 오염될 수 있는 고유한 가능성도 있습니다. 비공급기 조건으로 옮기거나 분석을 위해 hESC 또는 hiPSC를 분리하려는 경우 이러한 오염은 순도를 손상시킬 수 있습니다. 여기에 사용된 공급세포(인간 포피 섬유아세포)의 경우, 효소 분해(도시되지 않음)를 통해서도 공급세포층을 해리하는 것이 극히 어렵다는 것을 알 수 있습니다. toto에서 해리되지 않은 공급 세포층이 제거되기 때문에 수확된 hESC 또는 hiPSC의 오염은 무시할 수 있을 것입니다. 더욱이 공급세포가 유사분열적으로 포획됨에 따라, hESC 또는 hiPSC의 추가 패시징으로 오염이 결국 0으로 감소합니다.
기존 방법에 대한 중요성
hESC 및 hiPSC를 배양하기 위한 현재 표준은 passaging을 위한 EDTA의 사용이 널리 퍼져 있는 feeder-free 조건에서 배양하는 것입니다. 피더가 없는 배양은 접착을 보장하는 특수 배합된 배지 및 배양 기질의 사용에 달려 있습니다. 이러한 시약에는 일부 실험실 예산을 초과할 수 있는 추가 비용이 수반됩니다. 또한, 피더가 없는 조건에서의 배양은 피더가 없는 배양 배지에 특정 요인이 부족하고 결과적으로 나이브 상태에서 프라이밍 상태로의 전환으로 인해 교란된 분화 가능성과 관련이 있습니다. 유사분열로 정지된 공급세포의 성장은 이러한 전이를 방지하고 전체 비용을 관리 가능한 수준으로 낮출 수 있으므로 실험실 연구에서 만능 줄기세포의 광범위한 사용을 촉진할 수 있습니다.
Disclosures
조엘 C. 글로버(Joel C. Glover)는 노르웨이 인간 만능 줄기세포 핵심 시설(Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells)의 책임자이며 헤게 브린커 피에르딩스타드(Hege Brincker Fjerdingstad)는 일일 관리자입니다. 저자는 공개할 재정적 이해관계 또는 기타 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
예비 실험에 도움을 준 Lars Moen과 오슬로 대학 병원의 노르웨이 줄기 세포 연구 센터의 인간 만능 줄기 세포를 위한 노르웨이 핵심 시설에 감사드립니다. H9 hESC 라인은 WiCell에서, HS429 hESC 라인은 Karolinska Institute의 Outi Hovatta에서 얻었습니다. 둘 다 자재 이전 계약에 따라 사용되었습니다. NCS001 및 NCS002 hiPSC 라인은 인간 만능 줄기 세포를 위한 노르웨이 핵심 시설에서 생성되었습니다. 이러한 재프로그래밍과 여기에 보고된 모든 작업은 노르웨이 남동부 지역 윤리 위원회(승인 REK 2017/110)의 승인을 받아 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
| Brand Bürker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
| Disposable scalpels no.15 | Susann-Morton | 505 | |
| DPBS (1x) without Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
| Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| Eppendorf pipette 1 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf pipette 200 μL | Eppendorf | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter tip 1,000 μL | Sarstedt | 70.1186.210 | |
| Filter tip 200 μL | Sarstedt | 70.760.211 | |
| Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation) | Best Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
| Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
| Growth Factor Reduced Matrixgel | Corning | 734-0269 | |
| H9 hESC line | WiCell | WAe009-A | |
| hPSC Genetic Analysis Kit | Stem Cell Technologies | #07550 | |
| HS429 hESC line | ECACC | KIe024-A | |
| Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line | ATTC | CRL2429 | |
| IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
| iPSC lines | Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells | NCS001 & NCS002 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss) | Zeiss | ||
| Microscope | CETI | ||
| Mitomycin C | Sigma Aldrich | M4287 | |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
| Pipettes, plastic 10 mL | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipettes, plastic, 5 mL | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serum Replacement (SR) | Gibco | 10828-028 | |
| Sterile filters 0.22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
| T-75 culture flask | ThermoScientific | 156499 | |
| Trypan Blue Stain (0.4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA, 500 mL | Gibco | 25300062 |
References
- Skottman, H., Hovet, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9 (2015).
- Villa-Diaz, L. G., et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).
- Watanabe, M., et al. TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids. Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307 (2015).
- Inzunza, J., et al. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117 (2020).
- Castro-Viñuelas, R., et al. Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).
- Meng, G., Rancourt, D. E. Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
