Summary
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के एंजाइमैटिक या यांत्रिक गुजर के साथ जुड़े सीमाओं से बचने के लिए (hESCs) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) फीडर कोशिकाओं पर सुसंस्कृत, हम एक तेजी से स्थापित किया है, प्रभावी, लागत कुशल, उच्च उपज HESC या HIPSC कालोनियों EDTA मध्यस्थता dis-आसंजन का उपयोग कर मानव चमड़ी fibroblasts की एक फीडर सेल परत पर बनाए रखा कटाई के लिए.
Abstract
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (मानव भ्रूण स्टेम सेल, एचईएससी, और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल, एचआईपीएससी) मूल रूप से दीर्घकालिक संस्कृति में एक उदासीन अवस्था में रखरखाव के लिए विभिन्न प्रकार के फीडर कोशिकाओं पर सुसंस्कृत थे। इस दृष्टिकोण को फीडर-मुक्त संस्कृति प्रोटोकॉल द्वारा काफी हद तक दबा दिया गया है, लेकिन इनमें अधिक महंगा अभिकर्मक शामिल हैं और एक प्राइमेड राज्य में संक्रमण को बढ़ावा दे सकते हैं, जो कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता को प्रतिबंधित करता है। फीडर और फीडर मुक्त दोनों स्थितियों में, पासिंग के लिए एचईएससी या एचआईपीएससी कॉलोनियों की कटाई संस्कृतियों के विस्तार के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है।
फीडर कोशिकाओं पर सुसंस्कृत hESCs/hiPSCs पारित करने के लिए एक आसान और उच्च उपज प्रक्रिया प्रदान करने के लिए, हम कैल्शियम chelator ethylenediaminetetraacetic एसिड द्वारा प्राप्त dis-आसंजन का उपयोग कर एक कटाई विधि की स्थापना की है (EDTA). हमने मूल यांत्रिक कटाई दृष्टिकोण के लिए इस दृष्टिकोण की तुलना करके परिणामी पारित कोशिकाओं की उपज और गुणवत्ता का आकलन किया है, जिसमें कॉलोनियों को माइक्रोस्कोप के तहत एक स्केलपेल के साथ अलग किया जाता है (एंजाइमेटिक कटाई से जुड़े अभिकर्मक परिवर्तनशीलता से बचने के लिए यांत्रिक कटाई को तुलनित्र के रूप में चुना गया था)।
प्रयोगों के एक सेट में, दो अलग-अलग एचईएससी लाइनों को मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट की फीडर सेल परत पर बनाए रखा गया था। प्रत्येक पंक्ति को ईडीटीए-आधारित या यांत्रिक कटाई का उपयोग करके कई मार्गों के अधीन किया गया था और कॉलोनी के आकार और आकृति विज्ञान, सेल घनत्व, स्टेमनेस मार्कर अभिव्यक्ति, भ्रूण निकायों में तीन रोगाणु परतों के भेदभाव और जीनोमिक विपथन के लिए मूल्यांकन किया गया था। प्रयोगों के एक अन्य सेट में, हमने दो अलग-अलग एचआईपीएससी लाइनों पर ईडीटीए-आधारित कटाई का उपयोग किया और समान परिणाम प्राप्त किए। EDTA-प्रेरित डिस-आसंजन ने समय बचाया और यांत्रिक कटाई की तुलना में अधिक अनुकूल आकार और अधिक समान आकृति विज्ञान की कॉलोनियों की उच्च उपज दी। यह एंजाइमेटिक कटाई की तुलना में भी तेज था और एंजाइम बैच परिवर्तनशीलता के लिए प्रवण नहीं था। EDTA प्रेरित डिस-आसंजन विधि भी hESC/hiPSC लाइनों को फीडर सेल-आधारित संस्कृति से फीडर-मुक्त स्थितियों में स्थानांतरित करने की सुविधा प्रदान करती है यदि डाउनस्ट्रीम उपयोग और विश्लेषण के लिए वांछित हो।
Introduction
इन विट्रो में hESCs और hiPSCs के उचित रखरखाव मानव कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान में अनुसंधान के कई रास्ते के लिए एक बुनियादी और सुविधाजनक पद्धति है. अंतर करने के लिए hESCs और hiPSCs के अंतर्निहित ड्राइव के कारण, इन विट्रो में उदासीन राज्य को बनाए रखने के लिए विशेष देखभाल और ध्यान की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, संभव के रूप में कम पद्धति परिवर्तनशीलता के साथ hESCs और hiPSCs के रखरखाव और passaging के लिए लागत प्रभावी प्रोटोकॉल विकसित महान सामान्य उपयोगिता की है.
मूल रूप से, hESCs और hiPSCs लंबी अवधि की संस्कृति और उदासीन राज्य 1,2,3 के रखरखाव में सहायता करने के लिए फीडर कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार पर सुसंस्कृत थे. हाल ही में, फीडर-मुक्त परिस्थितियों में संस्कृति आदर्श बन गई है, क्योंकि यह फीडर कोशिकाओं से पूरी तरह से निपटने से बचती है4. हालांकि, कुछ प्रयोगशालाएं और मुख्य सुविधाएं अभी भी फीडर कोशिकाओं पर एचईएससी या एचआईपीएससी की संस्कृति करती हैं। फीडर-मुक्त संस्कृति अधिक महंगी है क्योंकि इसे कॉलोनी पालन (प्रमुख बाह्य मैट्रिक्स [ईसीएम] घटकों या एक वाणिज्यिक ईसीएम यौगिक, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेपित प्लेटों का उपयोग करके) सुनिश्चित करने के लिए विशेष रचनाओं के संस्कृति मीडिया और संस्कृति की सतह के कोटिंग के कुछ रूप के उपयोग की आवश्यकता होती है। खर्च तुच्छ नहीं है और hESC को आगे बढ़ाने में रुचि रखने वाली कुछ प्रयोगशालाओं के लिए एक संभावित वित्तीय बाधा प्रस्तुत करता है- या hiPSC आधारित अनुसंधान और विकास. इसके अलावा, फीडर मुक्त शर्तों के तहत संस्कृति hESCs और hiPSCs एक कम भोली राज्य के लिए ड्राइव करने के लिए जाता है की तुलना में फीडर कोशिकाओं5 पर बनाए रखा है, और यह बाद में भेदभाव समझौता औरआनुवंशिक विविधताओं 6 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
ऐतिहासिक रूप से, फीडर कोशिकाओं पर सुसंस्कृत hESCs और hiPSCs के पारित होने में यांत्रिक कटाई शामिल थी - एक माइक्रोस्कोप7 के तहत कॉलोनियों को उत्पाद शुल्क करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करना - लेकिन बाद में इसे बड़े पैमाने पर एंजाइमैटिक पाचन द्वारा दबा दिया गया था या कॉलोनियों या अलग कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोमल स्क्रैपिंग के बिना। यांत्रिक कटाई थकाऊ है और इसके लिए सटीक माइक्रोसर्जरी की आवश्यकता होती है। एंजाइमैटिक कटाई बैच-टू-बैच एंजाइम मतभेदों के कारण दक्षता में भिन्न हो सकती है और पूर्ण पृथक्करण का पक्ष लेती है, जो कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देती है जब तक कि रॉक इनहिबिटर 8,9 द्वारा प्रतिकार नहीं किया जाता है और असामान्य कैरियोटाइप9 की घटनाओं को बढ़ाता है।
यांत्रिक और एंजाइमी कटाई के नुकसान से बचने के दौरान फीडर कोशिकाओं पर एचईएससी और एचआईपीएससी की खेती के कम खर्च और अधिक भेदभाव क्षमता का लाभ उठाने के लिए, हमने ईडीटीए-मध्यस्थता वाले आसंजन का उपयोग करके मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट की फीडर परत पर बनाए गए एचईएससी और एचआईपीएससी कालोनियों की कटाई के लिए एक तेज़, प्रभावी, लागत-कुशल, उच्च उपज विधि स्थापित की है। हमने यांत्रिक कटाई के साथ प्राप्त उपज, परिवर्तनशीलता और स्टेम सेल की गुणवत्ता की तुलना की है (हमने इस दृष्टिकोण में शामिल अतिरिक्त परिवर्तनशीलता के कारण एंजाइमी पाचन की तुलना नहीं की)। हम ध्यान दें कि EDTA-मध्यस्थता वाले आसंजन भी फीडर-आधारित संस्कृति से फीडर-मुक्त स्थितियों में कॉलोनियों को स्थानांतरित करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, यदि डाउनस्ट्रीम उपयोग और विश्लेषण के लिए वांछित है। यह विधि एक सुसंगत पासिंग विधि के साथ एक संक्रमण प्रदान करती है, क्योंकि ईडीटीए-प्रेरित डिस-आसंजन फीडर-मुक्त संस्कृतियों के लिए नियोजित एक लोकप्रिय दृष्टिकोण है।
Protocol
इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. मानव फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं की खेती और फीडर सेल परत की तैयारी
- बीज 0.5 × 106 मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट (इसके बाद "फीडर कोशिकाएं" कहा जाता है) प्रत्येक टी -75 कल्चर फ्लास्क (आवश्यकतानुसार फ्लास्क की संख्या) के साथ इस्कोव के संशोधित डुलबेको के माध्यम (आईएमडीएम) के 20 एमएल के साथ (डब्ल्यू /) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), इसके बाद "फीडर सेल माध्यम" कहा जाता है।
- जब फीडर कोशिकाएं 90% संगम तक पहुंच जाती हैं, तो माध्यम को हटा दें, और माध्यम में कारकों द्वारा ट्रिप्सिन के निषेध से बचने के लिए प्रति फ्लास्क डुलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) के 10 एमएल के साथ 3x धोएं। प्रत्येक फ्लास्क में ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़ें, और फ्लास्क (ओं) को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए या जब तक फीडर कोशिकाओं ने फ्लास्क से अलग नहीं किया है। सूक्ष्मदर्शी के नीचे कोशिकाओं के पृथक्करण को कोशिकाओं अथवा एकल कोशिकाओं के अस्थायी समुच्चय के रूप में देखिए।
- ट्रिप्सिन-ईडीटीए को निष्क्रिय करने के लिए प्रत्येक फ्लास्क में ताजा प्री-वार्म्ड फीडर सेल माध्यम के 5 एमएल जोड़ें, और धीरे से पाइपिंग द्वारा फीडर कोशिकाओं को निलंबित करें।
- फीडर कोशिकाओं को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब कैप, और 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर centrifugation द्वारा फीडर कोशिकाओं गोली.
- ध्यान से फीडर सेल गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें. फिर, ताजा फीडर सेल माध्यम के 4 एमएल में गोली को ध्यान से फिर से निलंबित करें। सुनिश्चित करें कि फीडर कोशिकाओं को एक सेल गिनती कक्ष या अन्य सेल गिनती तंत्र का उपयोग कर गिनती से पहले अच्छी तरह से resuspended कर रहे हैं.
- विस्तार के लिए नए टी -75 संस्कृति फ्लास्क की आवश्यक संख्या में 0.5 × 106 फीडर कोशिकाओं को जोड़ें, और प्रत्येक फ्लास्क में ताजा फीडर सेल माध्यम के 20 एमएल जोड़ें। संस्कृति फ्लास्क (ओं) को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें जब तक कि फीडर कोशिकाएं 90% संगम तक नहीं पहुंच जातीं।
नोट: फीडर कोशिकाओं का उपयोग कम से कम 25 मार्ग तक किया जा सकता है। - 35 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन की संख्या के लिए आवश्यक फीडर कोशिकाओं की संख्या की गणना करें जिनका उपयोग एचईएससी/एचआईपीएससी की खेती के लिए किया जाएगा।
नोट: आमतौर पर, 3.0 × टिशू कल्चर डिश प्रति 5फीडर कोशिकाएं फीडर कोशिकाओं की एक संगम परत उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हैं। - फीडर कोशिकाओं के प्रसार से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि वे दो तरीकों में से किसी एक में माइटोटिक रूप से गिरफ्तार हैं।
नोट: दोनों तरीकों के लिए, माइटोटिक रूप से गिरफ्तार फीडर कोशिकाओं का एक बड़ा बैच उत्पन्न किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए विभाज्य में जमे हुए हो सकता है।- गामा-विकिरण द्वारा माइटोटिक गिरफ्तारी को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में आवश्यक सभी फीडर कोशिकाओं को स्थानांतरित करके और फीडर सेल माध्यम के साथ 5 एमएल की कुल मात्रा में टॉपिंग करें। एक गामा-विकिरण मशीन के लिए कमरे के तापमान पर तुरंत परिवहन, और फीडर कोशिकाओं (20 मिनट के लिए 300 केवी और 10 एमए) को माइटोटिक रूप से गिरफ्तार करने के लिए विकिरणित करें।
नोट: परिवहन में देरी से 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब की दीवार पर फीडर कोशिकाओं के अवांछित लगाव हो सकते हैं। यदि परिवहन को कुछ मिनटों से अधिक की आवश्यकता होती है, तो सुनिश्चित करें कि फीडर कोशिकाएं लगातार ट्यूब को उत्तेजित करके परिवहन के दौरान निलंबित रहें। - फीडर सेल माध्यम के 5 एमएल में आवश्यक सभी फीडर कोशिकाओं को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करके माइटोमाइसिन सी का उपयोग करके माइटोटिक गिरफ्तारी करें, और फिर 20 माइक्रोग्राम / एमएल माइटोमाइसिन सी युक्त फीडर सेल माध्यम के 15 एमएल जोड़ें, और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के 20 एमएल जोड़ें, 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें, पीबीएस धोने को दो अतिरिक्त बार दोहराएं, और फीडर सेल माध्यम में फिर से निलंबित करें।
- गामा-विकिरण द्वारा माइटोटिक गिरफ्तारी को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में आवश्यक सभी फीडर कोशिकाओं को स्थानांतरित करके और फीडर सेल माध्यम के साथ 5 एमएल की कुल मात्रा में टॉपिंग करें। एक गामा-विकिरण मशीन के लिए कमरे के तापमान पर तुरंत परिवहन, और फीडर कोशिकाओं (20 मिनट के लिए 300 केवी और 10 एमए) को माइटोटिक रूप से गिरफ्तार करने के लिए विकिरणित करें।
- फीडर कोशिकाओं को माइटोटिक रूप से गिरफ्तार किए जाने के बाद, टिशू कल्चर हुड पर लौटें, और फीडर कोशिकाओं को 3.0 × 105 कोशिकाओं प्रति 35 मिमी टिशू कल्चर डिश पर प्लेट करें, निम्नानुसार है। सुनिश्चित करें कि फीडर कोशिकाओं को पूरी तरह से निलंबित कर दिया गया है, 1.5 × 105 प्रति एमएल की फीडर सेल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए फीडर सेल माध्यम जोड़ें, और प्रत्येक 35 मिमी टिशू कल्चर डिश में इस फीडर सेल निलंबन के 2 एमएल जोड़ें।
- संस्कृति व्यंजन को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। फीडर कोशिकाओं की एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए, संस्कृति व्यंजन धीरे धीरे लेकिन मजबूती से इनक्यूबेटर शेल्फ आगे और पिछड़े 3x पर ले जाएँ, एक ठहराव के द्वारा पीछा किया, और फिर छोड़ दिया से सही 3x के लिए एक ही कार्रवाई प्रदर्शन. व्यंजन को फिर से न हिलाएं, और धीरे से इनक्यूबेटर का दरवाजा बंद करें।
- 24 घंटे के बाद, फीडर सेल माध्यम से आईएमडीएम डब्ल्यू / 10% सीरम प्रतिस्थापन (एसआर) पर स्विच करें। इसके बाद हर तीसरे दिन इस माध्यम को बदलें। फीडर सेल पहले 3 दिनों के बाद उपयोग के लिए तैयार हैं।
2. hESC या hiPSC कालोनियों की यांत्रिक कटाई
- प्रीवार्म एचईएससी माध्यम जिसमें 80% डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम), 20% एसआर, 1 एमएम ग्लूटामाइन विकल्प 100x, 1 एमएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 1 एमएम पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), 0.1 एमएम 2-मर्कैप्टोथेनॉल, और 10 एनजी / एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ)। एचईएससी माध्यम का उपयोग फीडर कोशिकाओं पर या तो एचईएससी या एचआईपीएससी की संस्कृति के लिए किया जाता है।
- मिटोटिक रूप से गिरफ्तार फीडर कोशिकाओं युक्त ताजा 35 मिमी टिशू कल्चर व्यंजन लें, और एचईएससी/एचआईपीएससी कालोनियों के हस्तांतरण से पहले कम से कम 30 मिनट पहले बीएफजीएफ युक्त एचईएससी माध्यम के 1.2 एमएल के साथ फीडर सेल माध्यम को बदलें।
- एक लामिना का प्रवाह हुड के भीतर रखा 10x बढ़ाई के साथ एक खुर्दबीन के तहत mitotically गिरफ्तार फीडर कोशिकाओं पर hESC / hiPSC कालोनियों युक्त एक संस्कृति पकवान रखें. प्रत्येक कॉलोनी की परिधि के आसपास सावधानी से कटौती करने के लिए एक बाँझ स्केलपेल का प्रयोग करें और फिर 5-6 लगभग बराबर टुकड़ों में प्रत्येक कॉलोनी में कटौती. ध्यान से स्केलपेल ब्लेड की नोक के साथ कॉलोनी के टुकड़े लिफ्ट इतना है कि वे फीडर सेल परत से अलग और माध्यम में स्वतंत्र रूप से तैरना.
- कालोनियों है कि विभेदक कोशिकाओं, जो एक कॉलोनी के भीतर hESCs / hiPSCs की तुलना में कम अलग नाभिक के साथ छोटे कोशिकाओं के द्वीप के रूप में दिखाई देते हैं के क्षेत्रों से बचने की कोशिश करो.
- फीडर कोशिकाओं युक्त नई संस्कृति व्यंजन के लिए एक 1 एमएल विंदुक के साथ स्वतंत्र रूप से चल कालोनियों स्थानांतरण. कॉलोनियों को अलग रखने की कोशिश करें ताकि वे बाद में एक-दूसरे में न बढ़ें। संस्कृति व्यंजनों को ध्यान से एक सेल इनक्यूबेटर में ले जाएं, और अगले दिन तक व्यंजन को परेशान करने से बचें।
- अगले दिन, ध्यान से 1.8 एमएल की अंतिम मात्रा में बीएफजीएफ युक्त एचईएससी माध्यम के 600 माइक्रोन जोड़ें। अगले मार्ग (आमतौर पर 1 सप्ताह के बाद) तक प्रत्येक दिन hESC + bFGF माध्यम बदलें।
3. EDTA मध्यस्थता dis-adhesion का उपयोग कर hESC या hiPSC कालोनियों की कटाई
- माइटोटिक रूप से गिरफ्तार फीडर कोशिकाओं के साथ ताजा संस्कृति व्यंजन लें, और कॉलोनियों के हस्तांतरण से कम से कम 30 मिनट पहले आईएमडीएम डब्ल्यू / 10% एसआर से प्रीवार्म्ड एचईएससी + बीएफजीएफ माध्यम के 1.2 एमएल पर स्विच करें।
- एक समय में hESC या hiPSC कालोनियों युक्त एक संस्कृति पकवान संभालें. एचईएससी + बीएफजीएफ माध्यम निकालें, और किसी भी संभावित अनासक्त कोशिकाओं और सेल मलबे को खत्म करने के लिए कमरे के तापमान डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ कॉलोनियों को धो लें। 0.5 एमएम ईडीटीए के 1 एमएल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। लामिना का प्रवाह हुड एक वार्मिंग प्लेट है, तो बेहतर आसंजन के लिए वार्मिंग प्लेट पर इस कदम और खंड 4 में कदम प्रदर्शन.
- 1 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, EDTA समाधान को हटा दें, और ध्यान से एक 1 एमएल विंदुक का उपयोग कर hESC + bFGF माध्यम के 1 एमएल जोड़ें. धीरे फीडर सेल परत से कालोनियों को मुक्त करने के लिए एक ही विंदुक के साथ triturate. ध्यान से triturate करने के लिए जारी रखें जब तक फीडर सेल परत ढीला और एक अलग झुरमुट में खुद पर सिलवटों. विंदुक टिप के साथ फीडर सेल परत दूर खींचो.
- एक नए 1 एमएल विंदुक के साथ निलंबित hESC/hiPSC कालोनियों फीडर कोशिकाओं और hESC + bFGF माध्यम युक्त नए संस्कृति व्यंजन के लिए स्थानांतरण, 1:5 के अनुपात में विभाजन. कॉलोनियों प्रत्येक नई संस्कृति पकवान के भीतर समान रूप से वितरित करने के लिए करते हैं, लेकिन पक्ष की ओर से धीरे पकवान ले जाकर इस सुविधा. अगले मार्ग (आमतौर पर 1 सप्ताह के बाद) तक प्रत्येक दिन hESC + bFGF माध्यम बदलें।
Representative Results
नीचे प्रलेखित परख और तुलना में, हम दो hESC लाइनों का इस्तेमाल किया (H9 और HS429, WiCell और Karolinska संस्थान से, क्रमशः) और दो hiPSC लाइनों (NCS001 और NCS002, दोनों मानव Pluripotent स्टेम सेल के लिए नार्वेजियन कोर सुविधा द्वारा उत्पन्न). आंकड़े और तालिकाओं में प्रस्तुत डेटा hESC लाइनों से हैं, लेकिन पूरी तरह से इसी तरह के परिणाम hiPSC लाइनों से प्राप्त किए गए थे.
हमारे हाथों में, यांत्रिक कटाई के परिणामस्वरूप कालोनियों को ~ 200-250 माइक्रोन व्यास के लगभग पांच से छह गुच्छों में विभाजित किया जा रहा था, जबकि ईडीटीए-प्रेरित विघटन-आसंजन के साथ विचूर्णन के बाद, प्रत्येक कॉलोनी ~ 10-20 में विभाजित थी ~ 60 माइक्रोन व्यास के गुच्छे। हम अनुमान है कि प्रत्येक EDTA कटाई झुरमुट में कोशिकाओं की संख्या ~ 20 है. यह एक स्केलपेल के साथ इस आकार के गुच्छों में एक कॉलोनी को विभाजित करने के लिए अव्यावहारिक है, इस संबंध में, EDTA प्रेरित डिस-आसंजन बेहतर है, क्योंकि यह एक आकार के गुच्छों को उत्पन्न करता है जो कॉलोनी सेल अस्तित्व10,11के लिए अधिक अनुकूल है।
ईडीटीए का उपयोग करके काटा गया एचईएससी/एचआईपीएससी कॉलोनियों भी यांत्रिक रूप से काटा गया काटा गया काटा गया (चित्र 1ए-एफ) की तुलना में आकार और आकार में अधिक सजातीय थे। ऐसा इसलिए है क्योंकि यांत्रिक कटाई के लिए आवश्यक कटिंग असमान किनारों और अलग-अलग क्लंप आकार उत्पन्न करती है। इस मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए, हम कॉलोनी परिपत्र का आकलन किया (कैसे गोल कॉलोनी किनारों की एक उपाय के रूप में; 1 का एक मूल्य एक पूर्ण चक्र इंगित करता है) 5 दिनों ImageJ-win64 प्रोटोकॉल12 का उपयोग कर गुजर के बाद. यांत्रिक रूप से काटी गई कॉलोनियों में कॉलोनी की परिपत्रता काफी कम थी (यांत्रिक कटाई: 0.61 ± 0.10; ईडीटीए आधारित कटाई: 0.84 ± 0.01; एन = 10, पी < 0.001, मान-व्हिटनी यू-परीक्षण, यू = 10)।
काटा और replated कालोनियों, जो कॉलोनी गठन के दौरान के बाद की कटाई सेल-सेल बातचीत का एक उपाय है में सेल घनत्व, EDTA आधारित कटाई और यांत्रिक कटाई (तालिका 1 और चित्रा 1G, एच) के साथ समान था. यंत्रवत् कटाई कालोनियों उनके केंद्रीय क्षेत्रों (चित्रा 1J) में परिगलन विकसित करने के लिए एक बड़ी प्रवृत्ति थी. यह संभवतः आकार में परिवर्तनशीलता के कारण था और, विशेष रूप से, यंत्रवत् रूप से पृथक सेल क्लंप का आकार, जब ये गुच्छे बहुत बड़े होते हैं, तो वे नए संस्कृति व्यंजनों में स्थानांतरित होने पर आसानी से खुद को मोड़ सकते हैं। ईडीटीए का उपयोग करके काटी गई कॉलोनियों के साथ ऐसा नहीं था, जिसने समान रूप से अलग-अलग किनारों (चित्रा 1I) के साथ एक पारभासी उपस्थिति का प्रदर्शन किया।
ईडीटीए-आधारित कटाई का उपयोग करके, हम अनिवार्य रूप से उन सभी कॉलोनियों को इकट्ठा करने में सक्षम थे जो 2-3 मिनट के भीतर एक कुएं में स्थापित की गई थीं। यांत्रिक कटाई का उपयोग करना, सभी कॉलोनियों को एक कुएं में इकट्ठा करना थकाऊ और समय लेने वाला होगा। हम आम तौर पर यांत्रिक कटाई का उपयोग करके केवल ~ 30%, या ~ 20-25 कालोनियों को इकट्ठा करने में कामयाब रहे, और इसमें ~ 20 मिनट लगे। इसी तरह, कोमल स्क्रैपिंग के बाद कोलेजनेज पाचन का उपयोग करके, आमतौर पर सभी कॉलोनियों की कटाई करना मुश्किल था, हालांकि कुल प्रक्रिया में केवल कुछ मिनट लगते थे। इस प्रकार, ईडीटीए-आधारित कटाई एंजाइमी कटाई की तुलना में तेज या तेज है और यांत्रिक या एंजाइमी कटाई की तुलना में अधिक कुशल है।
स्टेमनेस और प्लुरिपोटेंसी पर विभिन्न कटाई विधियों के प्रभाव का आकलन करने के लिए, हमने पहले स्टेमनेस मार्करों के लिए ईडीटीए-आधारित या यांत्रिक कटाई का उपयोग करके क्यूपीसीआर विश्लेषण (चित्रा 2) और इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला (चित्रा 3 और चित्रा 4) का उपयोग करके 20 मार्ग के बाद प्राप्त कॉलोनियों को अधीन किया। किसी भी विधि का उपयोग करके प्राप्त कालोनियों ने एमआरएनए और प्रोटीन स्तरों पर स्टेमनेस मार्करों की एक स्थिर अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। फिर हमने भ्रूण निकायों में तीन रोगाणु परतों के भेदभाव से प्लुरिपोटेंसी का आकलन किया (चित्र 5 और चित्र 6)। किसी भी विधि का उपयोग करके 20 मार्ग के बाद प्राप्त एचईएससी या एचआईपीएससी से उत्पन्न भ्रूण निकायों में एक्टोडर्म, मेसोडर्म और एंडोडर्म के लिए आमतौर पर मूल्यांकन किए गए मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का मिश्रण होता है।
अंत में, हमने hESCs और hiPSCs में जीनोमिक विपथन की घटनाओं का आकलन किया, जो qPCR-आधारित आनुवंशिक विश्लेषण ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके प्रत्येक विधि द्वारा पारित किया गया था। या तो कटाई विधि का उपयोग कर 20 मार्ग के बाद प्राप्त कालोनियों एक संदर्भ द्विगुणित गुणसूत्र पैटर्न से मामूली विचलन के कुछ उदाहरण प्रदर्शित (मूल्यांकन असामान्यताएं उन लोगों को आमतौर पर hiPSCs के reprogramming के साथ जुड़े थे, लेकिन यह भी hESCs में प्राप्त किया जा सकता है) (चित्रा 7). हालांकि, इन विचलनों का पैटर्न अनिवार्य रूप से कटाई विधि के बाद प्राप्त कॉलोनियों में समान था, यह दर्शाता है कि वे कटाई विधि से जुड़े नहीं थे।
चित्रा 1: ईडीटीए-आधारित या यांत्रिक कटाई के बाद कॉलोनी आकृति विज्ञान और सेल घनत्व। (ए-एफ) (ए-सी) ईडीटीए-आधारित या (डीएफ) यांत्रिक कटाई का उपयोग करके 20 मार्गों के बाद 5 दिनों के लिए फीडर-मुक्त संस्कृति में स्थापित एच 9 एचईएससी कॉलोनियों की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां। (जी, एच) एच 9 एचईएससी कालोनियों में सेल घनत्व के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों (जी) EDTA आधारित या (एच) यांत्रिक कटाई का उपयोग कर 20 मार्ग के बाद स्थापित. कोशिका नाभिक DAPI से सना हुआ होता है। (मैं, जे) (I) EDTA- आधारित या (J) यांत्रिक कटाई का उपयोग करके 20 मार्ग के बाद स्थापित H9 hESC कॉलोनियों की प्रतिनिधि ब्राइटफ़ील्ड छवियां। कॉलोनी में परिगलित केंद्रीय क्षेत्र यंत्रवत् काटा (जे में तीर) पर ध्यान दें। सभी छवियों को 20 वें मार्ग के 5 दिन बाद प्राप्त किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: hESC = मानव भ्रूण स्टेम सेल; EDTA = एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: ईडीटीए-आधारित या यांत्रिक कटाई के बाद उत्पन्न दो एचईएससी लाइनों (एच 9 और एचएस 429) में स्टेमनेस मार्कर एमआरएनए की अभिव्यक्ति। यांत्रिक कटाई का उपयोग करके एकल मार्ग के बाद, यांत्रिक कटाई का उपयोग करके 20 मार्ग के बाद, और ईडीटीए-आधारित कटाई (1: 5 कमजोर पड़ने) का उपयोग करके 20 मार्ग के बाद, एच 9 (ऊपरी पैनल) और एचएस 429 (निचले पैनल) एचईएससी में संकेतित मार्करों की मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन। अभिव्यक्ति का स्तर हाउसकीपिंग जीन ACTB (बीटा-एक्टिन) के सापेक्ष है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का संकेत देती हैं। संक्षिप्ताक्षर: hESC = मानव भ्रूण स्टेम सेल; EDTA = एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: विभिन्न कटाई स्थितियों के बाद एच 9 एचईएससी लाइन में स्टेमनेस मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति। H9 hESC कालोनियों के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला आगे गुजरने से पहले यंत्रवत् (A-E), यांत्रिक कटाई का उपयोग कर 20 मार्ग के बाद, और (K-O) EDTA- आधारित कटाई का उपयोग कर 20 मार्ग के बाद. स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: hESC = मानव भ्रूण स्टेम सेल; EDTA = एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: विभिन्न कटाई स्थितियों के बाद HS429 hESC लाइन में स्टेमनेस मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति। HS429 hESC कालोनियों के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना यंत्रवत् कटाई से पहले (एई) काटा गया, (एफ-जे) यांत्रिक कटाई का उपयोग करके 20 मार्ग के बाद, और (के-ओ) ईडीटीए-आधारित कटाई का उपयोग करके 20 मार्ग के बाद। स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: hESC = मानव भ्रूण स्टेम सेल; EDTA = एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: यांत्रिक या ईडीटीए-आधारित कटाई के बाद एच 9 एचईएससी लाइन से उत्पन्न भ्रूण निकायों में तीन रोगाणु परतों के लिए मार्करों की अभिव्यक्ति। (ए और डी पंक्तियों) एक्टोडर्म (ईसीटीओ, टीयूजेआई), (बी और ई पंक्तियों) एंडोडर्म (एंडो, एएफपी), और (सी और एफ पंक्तियों) मेसोडर्म (एमईएसओ, एसएमए) के लिए मार्करों के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। ईबीएस उत्पन्न (ए-सी) यांत्रिक कटाई के 20 मार्ग के बाद या (डीएफ) ईडीटीए-आधारित कटाई के 20 मार्ग के बाद। स्केल बार = 40 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: hESC = मानव भ्रूण स्टेम सेल; EDTA = एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड; EBs = भ्रूण निकाय। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: यांत्रिक या ईडीटीए-आधारित कटाई के बाद HS429 hESC लाइन से उत्पन्न भ्रूण निकायों में तीन रोगाणु परतों के लिए मार्करों की अभिव्यक्ति। (ए और डी पंक्तियों) एक्टोडर्म (ईसीटीओ, टीयूजेआई), (बी और ई पंक्तियों) एंडोडर्म (एंडो, एएफपी), और (सी और एफ पंक्तियों) मेसोडर्म (एमईएसओ, एसएमए) के लिए मार्करों के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। ईडीटीए-आधारित कटाई के 20 मार्ग के बाद यांत्रिक कटाई (ए-सी) या (डीएफ) के 20 मार्ग के बाद ईबीएस उत्पन्न (ए-सी)। स्केल बार = 40 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: hESC = मानव भ्रूण स्टेम सेल; EDTA = एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड; EBs = भ्रूण निकाय। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: HS9 और HS429 ESC लाइनों और NCS002 IPSC लाइन में सामान्य जीनोमिक विपथन के qPCR आधारित आनुवंशिक विश्लेषण यांत्रिक या EDTA आधारित कटाई का उपयोग कर 20 मार्ग निम्नलिखित. मान 2 पर आधार रेखा सभी गुणसूत्र मार्करों पर सामान्य द्विगुणित का प्रतिनिधित्व करती है। 1 या 3 का मान सभी कोशिकाओं में संकेतित गुणसूत्र मार्कर के क्रमशः नुकसान या लाभ का प्रतिनिधित्व करेगा। 1 और 2 के बीच या 2 और 3 के बीच मध्यवर्ती मान कोशिकाओं के एक अंश में संकेतित मार्कर के नुकसान या लाभ की उपस्थिति को इंगित करते हैं। ध्यान दें कि कटाई की दो स्थितियों में विपथन का पैटर्न समान है। संक्षिप्ताक्षर: ईएससी = भ्रूण स्टेम सेल; EDTA = एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड; IPSC = प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| सेल घनत्व (कोशिकाओं / | ||
| एच9 | औसत | स्टदेव |
| आगे गुजरने से पहले यांत्रिक फसल | 3918 | 263.3 |
| यांत्रिक फसल 20 बार | 3868 | 197.7 |
| EDTA फसल 20 बार | 4080 | 127.8 |
| एचएस429 | औसत | स्टदेव |
| आगे गुजरने से पहले यांत्रिक फसल | 5249 | 565.4 |
| यांत्रिक फसल 20 बार | 5247 | 726.3 |
| EDTA फसल 20 बार | 4963 | 448.8 |
तालिका 1: EDTA आधारित या यांत्रिक कटाई के बाद उत्पन्न दो hESC लाइनों (H9 और HS429) से कालोनियों में सेल घनत्व की तुलना. सेल घनत्व का मूल्यांकन या तो यांत्रिक कटाई का उपयोग करके एकल मार्ग के बाद, यांत्रिक कटाई का उपयोग करके 20 मार्ग के बाद, या ईडीटीए-आधारित कटाई (1: 5 कमजोर पड़ने पर) का उपयोग करके 20 मार्ग के बाद किया गया था। सभी मामलों में, n = 5 कॉलोनियां।
Discussion
हमने ईडीटीए-मध्यस्थता डिस-आसंजन का उपयोग करके फीडर कोशिकाओं पर सुसंस्कृत एचईएससी और एचआईपीएससी की कटाई के लिए एक तेज़ और लागत-कुशल विधि का वर्णन किया है और इसकी तुलना मुख्य रूप से एक स्केलपेल का उपयोग करके यांत्रिक कटाई की पारंपरिक विधि से की है। हमने ईडीटीए-आधारित कटाई की तुलना विधि की गति के संबंध में एंजाइमेटिक कटाई से की, लेकिन परिणामी कॉलोनी गुणवत्ता के पहलुओं की नहीं। इसका कारण यह है कि एंजाइमेटिक कटाई स्वाभाविक रूप से अधिक परिवर्तनशील है और इसे जीनोमिक विपथन5 के उच्च प्रसार से जोड़ा गया है, जो अंतर-विधि मतभेदों को अस्पष्ट कर सकता है।
हम प्रदर्शित करते हैं कि ईडीटीए-आधारित कटाई अन्य तरीकों की तुलना में तेज और अधिक कुशल है और यांत्रिक कटाई की तुलना में छोटी और रूपात्मक रूप से अधिक सजातीय कालोनियां उत्पन्न करती है। यह बाद की विशेषता सेल अस्तित्व के संबंध में फायदेमंद है, क्योंकि यांत्रिक कटाई के साथ प्राप्त बड़े गुच्छों में केंद्रीय परिगलन का खतरा होता है, जबकि एंजाइमेटिक पाचन पृथक एचईएससी और एचआईपीएससी उत्पन्न करता है, जो एपोप्टोसिस के लिए अधिक प्रवण होते हैं और अतिरिक्त उपचार की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए रॉक इनहिबिटर के साथ, जीवित रहने के लिए। EDTA-आधारित कटाई का उपयोग कम से कम 20 मार्गों के लिए किया जा सकता है। ईडीटीए-आधारित और यांत्रिक कटाई विधियां तुलनीय हैं जब यह कॉलोनी सेल घनत्व, एमआरएनए और स्टेम जीन की प्रोटीन अभिव्यक्ति, भ्रूण निकायों में तीन रोगाणु परतों के भेदभाव और जीनोमिक असामान्यताओं की बात आती है। यदि लक्ष्य दक्षता, उच्च उपज, कम परिवर्तनशीलता, और एचईएससी और एचआईपीएससी की जेंटलर हैंडलिंग है, तो ईडीटीए-आधारित कटाई बेहतर है।
हम यह भी ध्यान दें कि फीडर कोशिकाओं पर सुसंस्कृत hESCs और hiPSCs की EDTA आधारित कटाई एक अधिक भोली राज्य बनाए रखने के लिए एक सस्ता तरीका है और फीडर-आधारित से फीडर-मुक्त संस्कृति में एक चिकनी संक्रमण प्रदान करता है जहां यह वांछनीय है।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
EDTA-मध्यस्थता वाले आसंजन के सबसे महत्वपूर्ण चरण प्रोटोकॉल धारा 3 (EDTA समाधान में इनक्यूबेशन) और धारा 4 (विचूर्णन) हैं। यदि EDTA समाधान के संपर्क में 1 मिनट से अधिक समय तक है, तो एकल कोशिकाओं के लिए पूर्ण पृथक्करण का खतरा बढ़ जाता है। यह तब भी हो सकता है जब विचूर्णन बहुत लंबा या बहुत कठोर हो। उत्तरार्द्ध विंदुक टिप आकार से प्रभावित है। यहां वर्णित 1 एमएल सेल संस्कृति पिपेट का उपयोग करना आदर्श है। एक छोटे टिप व्यास के साथ विंदुक का एक अलग प्रकार का उपयोग जोखिम भरा है.
समस्या निवारण
यदि फीडर कोशिकाओं का प्रसार जारी रहता है, तो माइटोटिक गिरफ्तारी प्रभावी नहीं रही है, और एक नया बैच लिया जाना चाहिए और प्रक्रिया को फिर से शुरू किया जाना चाहिए। कालोनियों फीडर सेल परत से ढीला नहीं है, तो एक यकीन है कि वहाँ EDTA में कोई सीए2 + है और कालोनियों युक्त संस्कृति पकवान पीबीएस के साथ अच्छी तरह से rinsed है EDTA जोड़ने से पहले किसी भी शेष सेल संस्कृति माध्यम को दूर करने के लिए बनाना चाहिए. बहुत अधिक पृथक्करण, जो पृथक कोशिकाओं या सेल क्लंप उत्पन्न करता है जो बहुत छोटे होते हैं, अत्यधिक विचूर्णन के कारण उत्पन्न हो सकते हैं और नई कॉलोनियों की स्थापना से समझौता कर सकते हैं। विचूर्णन की डिग्री प्रोटोकॉल के परीक्षण रन में अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए ताकि यह पुष्टि की जा सके कि परिणामी सेल क्लंप ~ 60 माइक्रोन व्यास के हैं। यदि फीडर परत संस्कृति पकवान से अनायास अलग हो जाती है, विशेष रूप से पहले hESCs/hiPSCs कटाई के लिए तैयार हैं, तो ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि फीडर कोशिकाओं का उपयोग तैयार होने के बाद ~ 7 दिनों के भीतर नहीं किया गया है। इसलिए, फीडर कोशिकाओं के उपयोग की समय सीमा की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए। यदि ईडीटीए एक्सपोजर के दौरान फीडर परत अलग हो जाती है (कुछ ऐसा जो हमने यहां इस्तेमाल की जाने वाली फीडर कोशिकाओं के साथ कभी नहीं देखा है), तो फीडर सेल का प्रकार या उनकी संस्कृति विधि को बदला जाना चाहिए।
तकनीक की सीमाएं
तकनीक की मुख्य सीमा यह है कि इसे एक सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए डिस-आसंजन प्रक्रिया के दृश्य निरीक्षण की आवश्यकता होती है। इसका मतलब यह है कि उपयोगकर्ताओं को सीखना चाहिए कि कैसे पहचानना है जब कॉलोनियों फीडर सेल परत से रिलीज और फीडर सेल परत सब्सट्रेट से ढीला हो जाता है. हालांकि, यह मुश्किल नहीं है, और हमारे अनुभव में, तकनीक के नए उपयोगकर्ता कुछ परीक्षणों के भीतर इसमें महारत हासिल कर सकते हैं।
वहाँ भी एक अंतर्निहित संभावना है कि काटा hESCs या hiPSCs कुछ फीडर कोशिकाओं द्वारा दूषित किया जा सकता है. यदि इरादा गैर-फीडर स्थितियों में स्थानांतरित करना है या परख के लिए एचईएससी या एचआईपीएससी को अलग करना है, तो इस तरह के संदूषण शुद्धता से समझौता करेंगे। हम ध्यान दें कि यहां इस्तेमाल की जाने वाली फीडर कोशिकाओं (मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट्स) के साथ, फीडर सेल परत को अलग करना बेहद मुश्किल है, यहां तक कि एंजाइमी पाचन (दिखाया नहीं गया) के साथ भी। चूंकि अविभाजित फीडर सेल परत को पूरी तरह से हटा दिया जाता है, इसलिए काटे गए एचईएससी या एचआईपीएससी का संदूषण नगण्य होने की संभावना है। जैसा कि फीडर कोशिकाओं को इसके अलावा, माइटोटिक रूप से गिरफ्तार किया जाता है, कोई भी संदूषण अंततः एचईएससी या एचआईपीएससी के आगे गुजरने के साथ शून्य हो जाएगा।
मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
एचईएससी और एचआईपीएससी के संवर्धन के लिए वर्तमान मानदंड फीडर-मुक्त परिस्थितियों में ऐसा करना है, जिसके लिए पासजिंग के लिए ईडीटीए का उपयोग व्यापक है। फीडर-मुक्त संस्कृति विशेष रूप से तैयार मीडिया और संस्कृति सबस्ट्रेट्स के उपयोग पर निर्भर करती है जो पालन सुनिश्चित करती है। इन अभिकर्मकों में एक अतिरिक्त खर्च होता है जो कुछ प्रयोगशाला बजट से अधिक हो सकता है। इसके अलावा, फीडर-मुक्त परिस्थितियों में संस्कृति फीडर-मुक्त संस्कृति मीडिया में विशिष्ट कारकों की कमी और भोले राज्य से प्राइमेड राज्य में परिणामी संक्रमण के कारण एक परेशान भेदभाव क्षमता से जुड़ी हुई है। माइटोटिक रूप से गिरफ्तार फीडर कोशिकाओं पर वृद्धि इस संक्रमण से बचा जाता है और समग्र लागत को प्रबंधनीय स्तर तक ला सकता है, इस प्रकार प्रयोगशाला अनुसंधान में प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के व्यापक उपयोग की सुविधा प्रदान करता है।
Disclosures
ग्लोवर निदेशक हैं और हेगे ब्रिंकर फेजर्डिंगस्टैड मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल के लिए नॉर्वेजियन कोर सुविधा के दैनिक प्रबंधक हैं। लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या अन्य हितों के टकराव नहीं हैं।
Acknowledgments
हम प्रारंभिक प्रयोगों के दौरान सहायता के लिए लार्स मोएन और स्टेम सेल रिसर्च के लिए नॉर्वेजियन सेंटर में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल के लिए नॉर्वेजियन कोर सुविधा, ओस्लो विश्वविद्यालय अस्पताल, सुविधाओं के उपयोग के लिए धन्यवाद. H9 hESC लाइन WiCell से प्राप्त की गई थी, और HS429 hESC लाइन कारोलिंस्का संस्थान में Outi Hovatta से प्राप्त की गई थी। दोनों का उपयोग सामग्री हस्तांतरण समझौतों के अनुसार किया गया था। NCS001 और NCS002 hiPSC लाइनों मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल के लिए नार्वेजियन कोर सुविधा द्वारा उत्पन्न किए गए थे. उस रीप्रोग्रामिंग और यहां रिपोर्ट किए गए सभी कार्यों को दक्षिणपूर्वी नॉर्वे क्षेत्रीय आचार समिति (अनुमोदन आरईके 2017/110) की मंजूरी के साथ किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
| Brand Bürker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
| Disposable scalpels no.15 | Susann-Morton | 505 | |
| DPBS (1x) without Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
| Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| Eppendorf pipette 1 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf pipette 200 μL | Eppendorf | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter tip 1,000 μL | Sarstedt | 70.1186.210 | |
| Filter tip 200 μL | Sarstedt | 70.760.211 | |
| Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation) | Best Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
| Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
| Growth Factor Reduced Matrixgel | Corning | 734-0269 | |
| H9 hESC line | WiCell | WAe009-A | |
| hPSC Genetic Analysis Kit | Stem Cell Technologies | #07550 | |
| HS429 hESC line | ECACC | KIe024-A | |
| Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line | ATTC | CRL2429 | |
| IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
| iPSC lines | Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells | NCS001 & NCS002 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss) | Zeiss | ||
| Microscope | CETI | ||
| Mitomycin C | Sigma Aldrich | M4287 | |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
| Pipettes, plastic 10 mL | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipettes, plastic, 5 mL | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serum Replacement (SR) | Gibco | 10828-028 | |
| Sterile filters 0.22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
| T-75 culture flask | ThermoScientific | 156499 | |
| Trypan Blue Stain (0.4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA, 500 mL | Gibco | 25300062 |
References
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- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9 (2015).
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