Summary
For at undgå de begrænsninger, der er forbundet med enzymatisk eller mekanisk overførsel af humane embryonale stamceller (hESC'er) og humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er), der dyrkes på fødeceller, har vi etableret en hurtig, effektiv, omkostningseffektiv metode med højt udbytte til høst af hESC- eller hiPSC-kolonier, der opretholdes på et fødecellelag af humane forhudsfibroblaster ved hjælp af EDTA-medieret dis-adhæsion.
Abstract
Humane pluripotente stamceller (humane embryonale stamceller, hESC'er og humant inducerede pluripotente stamceller, hiPSC'er) blev oprindeligt dyrket på forskellige typer fødeceller til vedligeholdelse i en udifferentieret tilstand i langvarig kultur. Denne tilgang er i vid udstrækning blevet erstattet af feeder-fri kulturprotokoller, men disse involverer dyrere reagenser og kan fremme en overgang til en primet tilstand, hvilket begrænser cellernes differentieringskapacitet. Under både feeder- og feederfrie forhold er høst af hESC- eller hiPSC-kolonier til passaging en nødvendig procedure for at udvide kulturerne.
For at give en nem og højtydende procedure til overførsel af hESC'er/hiPSC'er, der dyrkes på fødeceller, har vi etableret en høstmetode ved hjælp af vedhæftning fremkaldt af calciumchelatoren ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Vi har vurderet udbyttet og kvaliteten af de resulterende passerede celler ved at sammenligne denne tilgang med den oprindelige mekaniske høstmetode, hvor kolonier isoleres med en skalpel under et mikroskop (mekanisk høst blev valgt som komparator for at undgå reagensvariabiliteten forbundet med enzymatisk høst).
I et sæt eksperimenter blev to forskellige hESC-linjer opretholdt på et fødecellelag af humane forhudsfibroblaster. Hver linje blev udsat for flere passager ved hjælp af EDTA-baseret eller mekanisk høst og vurderet for kolonistørrelse og morfologi, celletæthed, stamhedsmarkørekspression, differentiering til de tre kimlag i embryoidlegemer og genomiske aberrationer. I et andet sæt eksperimenter brugte vi EDTA-baseret høst på to forskellige hiPSC-linjer og opnåede lignende resultater. EDTA-induceret vedhæftning sparede tid og gav et højere udbytte af kolonier af en mere gunstig størrelse og mere ensartet morfologi sammenlignet med mekanisk høst. Det var også hurtigere end enzymatisk høst og ikke tilbøjelig til enzymbatchvariabilitet. EDTA-induceret dis-adhæsionsmetoden letter også overførslen af hESC/hiPSC-linjer fra fødecellebaseret kultur til føderfrie betingelser, hvis det ønskes til downstream-brug og analyse.
Introduction
Korrekt vedligeholdelse af hESC'er og hiPSC'er in vitro er en grundlæggende og praktisk metode til flere forskningsveje inden for human celle- og udviklingsbiologi. På grund af hESC'ers og hiPSC'ers iboende drivkraft til at differentiere kræver opretholdelse af den udifferentierede tilstand in vitro særlig omhu og opmærksomhed. Udvikling af omkostningseffektive protokoller til vedligeholdelse og overførsel af hESC'er og hiPSC'er med så lidt metodologisk variation som muligt er således af stor generel nytteværdi.
Oprindeligt blev hESC'er og hiPSC'er dyrket på forskellige typer fødeceller for at hjælpe med den langsigtede dyrkning og vedligeholdelse af den udifferentierede tilstand 1,2,3. For nylig er kultur under feederfrie forhold blevet normen, da den helt undgår at håndtere fødeceller4. Nogle laboratorier og kernefaciliteter dyrker dog stadig hESC'er eller hiPSC'er på fødeceller. Feederfri kultur er dyrere, fordi den kræver brug af kulturmedier med specielle sammensætninger og en eller anden form for belægning af kulturoverfladen for at sikre kolonivedhæftning (større ekstracellulære matrixkomponenter [ECM] eller en kommerciel ECM-forbindelse eller ved hjælp af kommercielt tilgængelige coatede plader). Udgiften er ikke ubetydelig og udgør en potentiel økonomisk hindring for nogle laboratorier, der er interesserede i at forfølge hESC- eller hiPSC-baseret forskning og udvikling. Desuden har kultur under feederfrie forhold tendens til at drive hESC'erne og hiPSC'erne til en mindre naiv tilstand end den, der opretholdes på fødeceller5, og dette kan kompromittere efterfølgende differentiering og føre til genetiske variationer6.
Historisk set involverede overførslen af hESC'er og hiPSC'er dyrket på fødeceller mekanisk høst - ved hjælp af en skalpel til punktafgiftskolonier under et mikroskop7 - men dette blev senere stort set erstattet af enzymatisk fordøjelse med eller uden blid skrabning for at isolere kolonier eller dissocierede celler. Mekanisk høst er kedelig og kræver præcisionsmikrokirurgi. Enzymatisk høst kan variere i effektivitet på grund af batch-til-batch enzymforskelle og har tendens til at favorisere fuldstændig dissociation, hvilket fremmer celledød, medmindre det modvirkes af ROCK-hæmmere 8,9 og øger forekomsten af unormale karyotyper9.
For at drage fordel af de lavere omkostninger og større differentieringspotentiale ved dyrkning af hESC'er og hiPSC'er på føderceller og samtidig undgå ulemperne ved mekanisk og enzymatisk høst har vi etableret en hurtig, effektiv, omkostningseffektiv metode med højt udbytte til høst af hESC- og hiPSC-kolonier, der opretholdes på et fødelag af humane forhudsfibroblaster ved hjælp af EDTA-medieret dis-vedhæftning. Vi har sammenlignet udbyttet, variabiliteten og stamcellekvaliteten med det, der opnås ved mekanisk høst (vi sammenlignede ikke med enzymatisk fordøjelse på grund af den ekstra variabilitet, denne tilgang indebærer). Vi bemærker, at EDTA-medieret vedhæftning også fungerer godt til overførsel af kolonier fra feeder-baseret kultur til feeder-frie forhold, hvis det ønskes til downstream-brug og analyser. Denne metode giver en overgang med en konsekvent passaging-metode, da EDTA-induceret dis-adhæsion er en populær tilgang, der anvendes til feederfrie kulturer.
Protocol
Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter, der anvendes i denne protokol.
1. Dyrkning af humane fibroblastceller og fremstilling af fødecellelaget
- Frø 0,5 × 106 humane forhudsfibroblaster (i det følgende kaldet "fødeceller") pr. hver T-75 kulturkolbe (antal kolber efter behov) med 20 ml Iscoves modificerede Dulbecco's Medium (IMDM) med (w/) 10% føtalt bovint serum (FBS), i det følgende kaldet "fødecellemedium".
- Når fødecellerne når 90% sammenløb, fjernes mediet og vaskes 3x med 10 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) pr. kolbe for at undgå hæmning af trypsin af faktorer i mediet. Der tilsættes 2 ml trypsin-EDTA til hver kolbe, og kolben anbringes i en 37 °C/5 % CO2 -inkubator i 5 minutter, eller indtil fødecellerne har løsnet sig fra kolben (kolberne). Overhold frigørelsen af cellerne under et mikroskop som flydende aggregater af celler eller enkeltceller.
- Der tilsættes 5 ml frisk forvarmet fødecellemedium til hver kolbe for at inaktivere trypsin-EDTA, og fødecellerne suspenderes forsigtigt ved pipettering.
- Overfør fødecellerne til et 15 ml centrifugerør. Hætte røret, og pellet fødecellerne ved centrifugering ved 200 × g i 5 min.
- Supernatanten fjernes forsigtigt uden at forstyrre fødecellepelletsen. Derefter resuspenderes pelleten forsigtigt i 4 ml frisk fødercellemedium. Sørg for, at fødecellerne er grundigt resuspenderet før tælling ved hjælp af et celletællekammer eller andet celletælleapparat.
- Der tilsættes 0,5 × 106 fødeceller til det krævede antal nye T-75 dyrkningskolber til ekspansion, og der tilsættes 20 ml frisk fødecellemedium til hver kolbe. Kulturkolben/-kolberne inkuberes i en 37 °C/5 % CO2 -inkubator, indtil fødecellerne har nået 90 % sammenløb.
BEMÆRK: Fødeceller kan bruges op til mindst passage 25. - Beregn antallet af fødeceller, der kræves til antallet af 35 mm vævskulturskåle, der vil blive brugt til dyrkning af hESC'er/hiPSC'er.
BEMÆRK: Normalt er 3,0 × 105 fødeceller pr. Vævskulturskål tilstrækkelige til at generere et sammenflydende lag af fødeceller. - For at undgå spredning af fødecellerne skal du sikre dig, at de er mitotisk arresteret på en af to måder.
BEMÆRK: For begge metoder kan et stort parti mitotisk arresterede fødeceller genereres og fryses ned i alikvoter til senere brug.- Der udføres mitotisk anholdelse ved gammabestråling ved at overføre alle nødvendige fødeceller til et 50 ml centrifugerør og fylde op med fødecellemedium til et samlet volumen på 5 ml. Der transporteres straks ved stuetemperatur til en gammabestrålingsmaskine, og der bestråles for at standse fødecellerne mitotisk (300 kV og 10 mA i 20 min).
BEMÆRK: En forsinkelse i transporten kan føre til uønsket fastgørelse af fødecellerne til væggen i 50 ml centrifugerøret. Hvis transporten kræver mere end et par minutter, skal du sikre dig, at fødecellerne forbliver suspenderet under transporten ved kontinuerligt at omrøre røret. - Der udføres mitotisk anholdelse ved hjælp af mitomycin C ved at overføre alle de fødeceller, der er nødvendige i 5 ml fødecellemedium, til et 50 ml centrifugeglas, og derefter tilsættes 15 ml fødecellemedium indeholdende 20 μg/ml mitomycin C, og inkuberes i en 37 °C/5% CO2-inkubator i 3 timer. Der tilsættes 20 ml 37 °C PBS, pellets cellerne ved centrifugering ved 200 × g i 5 minutter, PBS-vasken gentages yderligere to gange, og opslæmmes igen i fødercellemediet.
- Der udføres mitotisk anholdelse ved gammabestråling ved at overføre alle nødvendige fødeceller til et 50 ml centrifugerør og fylde op med fødecellemedium til et samlet volumen på 5 ml. Der transporteres straks ved stuetemperatur til en gammabestrålingsmaskine, og der bestråles for at standse fødecellerne mitotisk (300 kV og 10 mA i 20 min).
- Når fødecellerne er blevet mitotisk arresteret, returneres til vævskulturhætten, og fødercellerne udskilles ved 3,0 × 105 celler pr. 35 mm vævskulturskål som følger. Sørg for, at fødercellerne er helt resuspenderet, tilsæt fødecellemedium for at nå en fødecellekoncentration på 1,5 × 105 pr. ml, og tilsæt 2 ml af denne fødecellesuspension til hver 35 mm vævskulturskål.
- Overfør dyrkningsskålene til en 37 °C/5% CO2 inkubator. For at sikre en jævn fordeling af fødercellerne skal du flytte kulturskålene langsomt men fast på inkubatorhylden frem og tilbage 3x, efterfulgt af en pause, og udfør derefter den samme handling fra venstre mod højre 3x. Flyt ikke opvasken igen, og luk forsigtigt inkubatordøren.
- Efter 24 timer skiftes fra fødecellemedium til IMDM m/ 10% serumudskiftning (SR). Udskift derefter dette medium hver tredje dag. Fødecellerne er klar til brug efter de første 3 dage.
2. Mekanisk høst af hESC- eller hiPSC-kolonierne
- Forvarm hESC-medium bestående af 80% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 20% SR, 1 mM glutaminerstatning 100x, 1 mM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 1 mM penicillin/streptomycin (P/S), 0,1 mM 2-mercaptoethanol og 10 ng/ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF). hESC-substratet anvendes til dyrkning af enten hESC'erne eller hiPSC'erne på fødercellerne.
- Der udtages friske 35 mm vævskulturskåle, der indeholder mitotisk arresterede fødeceller, og udskift fødecellemediet med 1,2 ml hESC-medium indeholdende bFGF mindst 30 minutter før overførslen af hESC/hiPSC-kolonierne.
- Placer en kulturskål indeholdende hESC / hiPSC-kolonier på mitotisk arresterede fødeceller under et mikroskop med 10x forstørrelse placeret i en laminær strømningshætte. Brug en steril skalpel til at skære forsigtigt rundt om omkredsen af hver koloni og skær derefter hver koloni i 5-6 omtrent lige store stykker. Løft forsigtigt kolonistykkerne op med spidsen af skalpelbladet, så de løsner sig fra fødecellelaget og flyder frit i mediet.
- Prøv at undgå regioner i kolonierne, der indeholder differentierende celler, der fremstår som øer af mindre celler med mindre forskellige kerner sammenlignet med hESC'er / hiPSC'er inden for en koloni.
- Overfør de frit flydende kolonier med en 1 ml pipette til de nye dyrkningsskåle, der indeholder fødecellerne. Prøv at holde kolonierne adskilt, så de ikke vokser ind i hinanden senere. Flyt kulturskålene forsigtigt til en celleinkubator, og undgå at forstyrre opvasken indtil næste dag.
- Den følgende dag tilsættes forsigtigt 600 μL hESC-medium indeholdende bFGF til et slutvolumen på 1,8 ml. Udskift hESC + bFGF-mediet hver dag derefter indtil næste passage (generelt efter 1 uge).
3. Høst af hESC- eller hiPSC-kolonierne ved hjælp af EDTA-medieret adhæsion
- Tag friske kulturretter med mitotisk arresterede fødeceller, og skift fra IMDM m / 10% SR til 1,2 ml forvarmet hESC + bFGF-medium mindst 30 minutter før overførslen af kolonierne.
- Håndter en kulturskål, der indeholder hESC- eller hiPSC-kolonier ad gangen. Fjern hESC + bFGF-mediet, og vask kolonierne med 1 ml DPBS ved stuetemperatur for at eliminere eventuelle ikke-bundne celler og celleaffald. Tilsæt 1 ml 0,5 mM EDTA, og inkuber i 1 min ved 37 °C. Hvis laminar strømningshætten har en varmeplade, skal du udføre dette trin og trinnene i afsnit 4 på varmepladen for bedre vedhæftning.
- Efter 1 min. inkubation fjernes EDTA-opløsningen, og der tilsættes forsigtigt 1 ml hESC + bFGF-medium ved hjælp af en 1 ml pipette. Triturer forsigtigt med den samme pipette for at frigøre kolonierne fra fødecellelaget. Fortsæt med at triturere forsigtigt, indtil fødercellelaget løsner og foldes på sig selv i en separat klump. Træk fødercellelaget væk med pipettespidsen.
- De suspenderede hESC/hiPSC-kolonier overføres med en ny 1 ml pipette til nye dyrkningsskåle, der indeholder fødercellerne og hESC + bFGF-mediet, og spaltes i forholdet 1:5. Kolonierne har tendens til at fordele jævnt inden for hver ny kulturskål, men letter dette ved at flytte skålen forsigtigt fra side til side. Udskift hESC + bFGF-mediet hver dag derefter indtil næste passage (generelt efter 1 uge).
Representative Results
I de analyser og sammenligninger, der er dokumenteret nedenfor, brugte vi to hESC-linjer (H9 og HS429, fra henholdsvis WiCell og Karolinska Institutet) og to hiPSC-linjer (NCS001 og NCS002, begge genereret af den norske kernefacilitet for humane pluripotente stamceller). De data, der præsenteres i figurerne og tabellerne, er fra hESC-linjerne, men der blev opnået helt lignende resultater fra hiPSC-linjerne.
I vores hænder resulterede mekanisk høst i, at kolonierne blev opdelt i cirka fem til seks klumper på ~ 200-250 μm i diameter, mens hver koloni med EDTA-induceret vedhæftning efterfulgt af trituration blev opdelt i ~ 10-20 klumper på ~ 60 μm i diameter. Vi estimerer, at antallet af celler i hver EDTA-høstet klump er ~ 20. Da det er upraktisk at opdele en koloni i klumper af denne størrelse med en skalpel, er EDTA-induceret vedhæftning i denne henseende overlegen, da den genererer klumper af en størrelse, der er mere gunstig for kolonicelleoverlevelse10,11.
hESC/hiPSC-kolonierne høstet ved hjælp af EDTA var også mere homogene i størrelse og form sammenlignet med de kolonier, der blev høstet mekanisk (figur 1A-F). Dette skyldes, at den skæring, der kræves til mekanisk høst, genererer ujævne kanter og varierende klumpstørrelser. For at evaluere dette kvantitativt vurderede vi kolonicirkulariteten (som et mål for, hvor afrundede kolonikanterne var; en værdi på 1 indikerer en perfekt cirkel) 5 dage efter passaging ved hjælp af ImageJ-win64-protokol12. Kolonicirkulariteten var signifikant lavere i kolonierne høstet mekanisk (mekanisk høst: 0,61 ± 0,10; EDTA-baseret høst: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, Mann-Whitney U-test, U = 10).
Celletætheden i de høstede og genbelagte kolonier, som er et mål for celle-celle-interaktioner efter høst under kolonidannelse, var den samme som EDTA-baseret høst og mekanisk høst (tabel 1 og figur 1G, H). De mekanisk høstede kolonier havde en større tendens til at udvikle nekrose i deres centrale regioner (figur 1J). Dette skyldtes sandsynligvis variation i formen og især størrelsen af de mekanisk isolerede celleklumper, da når disse klumper er for store, let kan folde sig på sig selv, når de overføres til nye kulturretter. Dette var ikke tilfældet med kolonierne høstet ved hjælp af EDTA, som ensartet udviste et gennemskinneligt udseende med forskellige kanter (figur 1I).
Ved hjælp af EDTA-baseret høst var vi i stand til at samle stort set alle de kolonier, der var etableret i en brønd inden for 2-3 minutter. Ved hjælp af mekanisk høst ville det være kedeligt og tidskrævende at samle alle kolonierne i en brønd. Det lykkedes os typisk kun at indsamle ~30%, eller ~20-25 kolonier, ved hjælp af mekanisk høst, og det tog ~20 min. På samme måde var det typisk vanskeligt at høste alle kolonierne ved hjælp af kollagenasefordøjelse efterfulgt af forsigtig skrabning, selvom den samlede procedure kun tog et par minutter. EDTA-baseret høst er således lige så hurtig eller hurtigere end enzymatisk høst og mere effektiv end enten mekanisk eller enzymatisk høst.
For at vurdere effekten af de forskellige høstmetoder på stamme og pluripotens udsatte vi først kolonierne opnået efter 20 passager ved hjælp af EDTA-baseret eller mekanisk høst for qPCR-analyse (figur 2) og immunocytokemisk farvning (figur 3 og figur 4) for stammemarkører. Kolonierne opnået ved hjælp af begge metoder udviste et stabilt udtryk for stammemarkører både på mRNA- og proteinniveauerne. Vi vurderede derefter pluripotens ved differentiering til de tre kimlag i embryoide kroppe (figur 5 og figur 6). De embryoidlegemer, der blev genereret fra hESC'erne eller hiPSC'erne opnået efter 20 passager ved hjælp af begge metoder, indeholdt en blanding af celler, der udtrykte almindeligt vurderede markører for ektoderm, mesoderm og endoderm.
Endelig vurderede vi forekomsten af genomiske aberrationer i hESC'er og hiPSC'er passeret ved hver metode ved hjælp af qPCR-baseret genetisk analyse (se materialetabellen). De kolonier, der blev opnået efter 20 passager ved hjælp af begge høstmetoder, udviste nogle eksempler på beskeden afvigelse fra et diploidt kromosommønster (de vurderede abnormiteter var dem, der almindeligvis er forbundet med omprogrammering af hiPSC'er, men kan også opnås i hESC'er) (figur 7). Imidlertid var mønsteret for disse afvigelser stort set det samme i kolonierne opnået efter begge høstmetoder, hvilket tyder på, at de ikke var knyttet til høstmetoden.
Figur 1: Kolonimorfologi og celletæthed efter EDTA-baseret eller mekanisk høst. (A-F) Repræsentative brightfieldbilleder af H9 hESC-kolonier etableret i føderfri kultur i 5 dage efter 20 passager ved hjælp af (A-C) EDTA-baseret eller (D-F) mekanisk høst. (G,H) Repræsentative fluorescensbilleder af celletætheden i H9 hESC-kolonier etableret efter 20 passager ved hjælp af (G) EDTA-baseret eller (H) mekanisk høst. Cellekernerne er farvet med DAPI. (I,J) Repræsentative brightfield-billeder af H9 hESC-kolonier etableret efter 20 passager ved hjælp af (I) EDTA-baseret eller (J) mekanisk høst. Bemærk den nekrotiske centrale region i kolonien høstet mekanisk (pil i J). Alle billederne blev erhvervet 5 dage efter den 20. passage. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: hESC = menneskelige embryonale stamceller; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ekspression af stemness markør mRNA i to hESC linjer (H9 og HS429) genereret efter EDTA-baseret eller mekanisk høst. Kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion af de angivne markører i H9 (øverste panel) og HS429 (nedre panel) hESC'er efter en enkelt passage ved hjælp af mekanisk høst, efter 20 passager ved hjælp af mekanisk høst og efter 20 passager ved anvendelse af EDTA-baseret høst (1:5 fortynding). Ekspressionsniveauet er relativt til husholdningsgenet ACTB (beta-actin). Fejlbjælkerne angiver standardafvigelsen. Forkortelser: hESC = menneskelige embryonale stamceller; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ekspression af stammemarkørproteiner i H9 hESC-linjen efter forskellige høstbetingelser. Repræsentativ immunfluorescensfarvning af H9 hESC-kolonier høstet mekanisk (A-E) før yderligere passage, (F-J) efter 20 passager ved hjælp af mekanisk høst og (K-O) efter 20 passager ved hjælp af EDTA-baseret høst. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: hESC = menneskelige embryonale stamceller; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Ekspression af stammemarkørproteiner i HS429 hESC-linjen efter forskellige høstbetingelser. Repræsentativ immunfluorescensfarvning af HS429 hESC-kolonier høstet mekanisk (A-E) før yderligere passage, (F-J) efter 20 passager ved mekanisk høst og (K-O) efter 20 passager ved hjælp af EDTA-baseret høst. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: hESC = menneskelige embryonale stamceller; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Ekspression af markører for de tre kimlag i embryoidlegemer, der genereres fra H9 hESC-linjen efter mekanisk eller EDTA-baseret høst. Repræsentativ immunfluorescensfarvning af markører for (A- og D-rækker) ektoderm (ECTO, TUJI), (B- og E-rækker) endoderm (ENDO, AFP) og (C- og F-rækker) mesoderm (MESO, SMA). EB'er genereret (A-C) efter 20 passager med mekanisk høst eller (D-F) efter 20 passager med EDTA-baseret høst. Skalastænger = 40 μm. Forkortelser: hESC = menneskelige embryonale stamceller; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre; EB'er = embryoide kroppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Ekspression af markører for de tre kimlag i embryoidlegemer, der genereres fra HS429 hESC-linjen efter mekanisk eller EDTA-baseret høst. Repræsentativ immunfluorescensfarvning af markører for (A- og D-rækker) ektoderm (ECTO, TUJI), (B- og E-rækker) endoderm (ENDO, AFP) og (C- og F-rækker) mesoderm (MESO, SMA). EB'er genereret (A-C) efter 20 passager med mekanisk høst (A-C) eller (D-F) efter 20 passager med EDTA-baseret høst. Skalastænger = 40 μm. Forkortelser: hESC = menneskelige embryonale stamceller; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre; EB'er = embryoide kroppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: qPCR-baseret genetisk analyse af almindelige genomiske aberrationer i HS9- og HS429 ESC-linjerne og NCS002 iPSC-linjen efter 20 passager ved hjælp af mekanisk eller EDTA-baseret høst. Baseline ved værdi 2 repræsenterer normal diploidi, ved alle kromosommarkørerne. En værdi på 1 eller 3 ville repræsentere henholdsvis et tab eller en gevinst af den angivne kromosommarkør i alle cellerne. Mellemliggende værdier mellem 1 og 2 eller mellem 2 og 3 indikerer tilstedeværelsen af et tab eller gevinst af den angivne markør i en brøkdel af cellerne. Bemærk, at mønsteret af afvigelser er ens i de to høstbetingelser. Forkortelser: ESC = embryonale stamceller; EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre; iPSC = induceret pluripotent stamcelle. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Celletæthed (celler/mm2) | ||
| H9 | betyde | stdev |
| Mekanisk høst inden yderligere passage | 3918 | 263.3 |
| Mekanisk høst 20 gange | 3868 | 197.7 |
| EDTA høst 20 gange | 4080 | 127.8 |
| HS429 | betyde | stdev |
| Mekanisk høst inden yderligere passage | 5249 | 565.4 |
| Mekanisk høst 20 gange | 5247 | 726.3 |
| EDTA høst 20 gange | 4963 | 448.8 |
Tabel 1: Sammenligning af celletæthederne i kolonierne fra de to hESC-linjer (H9 og HS429) genereret efter EDTA-baseret eller mekanisk høst. Celletæthederne blev vurderet enten efter en enkelt passage ved hjælp af mekanisk høstning, efter 20 passager ved hjælp af mekanisk høst eller efter 20 passager ved hjælp af EDTA-baseret høst (ved 1:5 fortynding). I alle tilfælde n = 5 kolonier.
Discussion
Vi har beskrevet en hurtig og omkostningseffektiv metode til høst af hESC'er og hiPSC'er dyrket på fødeceller ved hjælp af EDTA-medieret vedhæftning og sammenlignet dette primært med den konventionelle metode til mekanisk høst ved hjælp af en skalpel. Vi sammenlignede også EDTA-baseret høst med enzymatisk høst med hensyn til metodens hastighed, men ikke aspekter af den resulterende kolonikvalitet. Årsagen til dette er, at enzymatisk høst i sagens natur er mere variabel og har været forbundet med en højere forekomst af genomiske aberrationer5, hvilket kunne skjule forskellene mellem metoderne.
Vi demonstrerer, at EDTA-baseret høst er hurtigere og mere effektiv end nogen af de andre metoder og genererer mindre og morfologisk mere homogene kolonier end mekanisk høst. Denne sidstnævnte funktion er gavnlig med hensyn til celleoverlevelse, da de større klumper opnået med mekanisk høst er tilbøjelige til central nekrose, mens enzymatisk fordøjelse har tendens til at generere isolerede hESC'er og hiPSC'er, som er mere tilbøjelige til apoptose og kræver ekstra behandling, for eksempel med ROCK-hæmmere, for at overleve. EDTA-baseret høst kan bruges til mindst 20 passager. De EDTA-baserede og mekaniske høstmetoder er sammenlignelige, når det kommer til kolonicelletæthed, mRNA og proteinekspression af stammegener, differentiering af de tre kimlag i embryoidlegemer og genomiske abnormiteter. Hvis målet er effektivitet, højere udbytte, mindre variabilitet og mere skånsom håndtering af hESC'er og hiPSC'er, foretrækkes EDTA-baseret høst.
Vi bemærker også, at EDTA-baseret høst af hESC'er og hiPSC'er dyrket på fødeceller er en billig måde at opretholde en mere naiv tilstand på og giver en jævn overgang fra feederbaseret til feederfri kultur, hvor dette er ønskeligt.
Kritiske trin i protokollen
De mest kritiske trin i EDTA-medieret dis-adhæsion er protokolafsnit 3 (inkubation i EDTA-opløsningen) og afsnit 4 (trituration). Hvis eksponeringen for EDTA-opløsningen er længere end 1 min, øges risikoen for fuldstændig dissociation til enkeltceller. Dette kan også forekomme, hvis triturationen er for langvarig eller for hård. Sidstnævnte påvirkes af pipettens spidsstørrelse. Brug af 1 ml cellekulturpipetter som beskrevet her er ideel. Brug af en anden type pipette med en mindre spidsdiameter er risikabelt.
Fejlfinding
Hvis fødecellerne fortsætter med at sprede sig, har mitotisk anholdelse ikke været effektiv, og en ny batch skal tages, og proceduren genstartes. Hvis kolonierne ikke løsner sig fra fødecellelaget, skal man sørge for, at der ikke er Ca2+ i EDTA, og at dyrkningsskålen, der indeholder kolonierne, skylles godt med PBS for at fjerne eventuelt resterende cellekulturmedium, før EDTA tilsættes. For meget dissociation, som genererer isolerede celler eller celleklumper, der er for små, kan opstå på grund af overdreven trituration og kompromitterer etableringen af nye kolonier. Triturationsgraden bør bestemmes empirisk i forsøgskørsler af protokollen for at bekræfte, at de resulterende celleklumper er ~ 60 μm i diameter. Hvis føderlaget løsner sig spontant fra dyrkningslaget, især før hESC'erne/hiPSC'erne er klar til høst, kan det skyldes, at fødecellerne ikke er blevet brugt inden for ~7 dage efter tilberedning. Derfor bør tidsrammen for brug af fødercellerne overvåges nøje. Hvis føderlaget dissocieres under EDTA-eksponering (noget vi aldrig har observeret med de fødeceller, der anvendes her), skal enten typen af fødecelle eller deres dyrkningsmetode ændres.
Begrænsninger af teknikken
Den største begrænsning af teknikken er, at den kræver visuel inspektion af vedhæftningsprocessen for at opnå et vellykket resultat. Det betyder, at brugerne skal lære at identificere, hvornår kolonierne frigives fra fødecellelaget, og fødecellelaget løsner sig fra substratet. Dette er dog ikke svært, og efter vores erfaring kan nye brugere af teknikken mestre det inden for et par forsøg.
Der er også en iboende mulighed for, at de høstede hESC'er eller hiPSC'er kan være forurenet af nogle få fødeceller. Hvis hensigten er at overføre til ikke-føderforhold eller at isolere hESC'erne eller hiPSC'erne til assays, vil en sådan kontaminering kompromittere renheden. Vi bemærker, at med de føderceller, der anvendes her (humane forhudfibroblaster), er det ekstremt vanskeligt at adskille fødercellelaget, selv med enzymatisk fordøjelse (ikke vist). Da det ikke-dissocierede fødecellelag fjernes i toto, vil kontaminering af de høstede hESC'er eller hiPSC'er sandsynligvis være ubetydelig. Da fødecellerne desuden er mitotisk arresteret, vil enhver kontaminering i sidste ende falde til nul med yderligere passage af hESC'erne eller hiPSC'erne.
Betydning i forhold til eksisterende metoder
Den nuværende norm for dyrkning af hESC'er og hiPSC'er er at gøre det under feederfrie forhold, hvor brugen af EDTA til passaging er udbredt. Feederfri kultur afhænger af brugen af specielt formulerede medier og kultursubstrater, der sikrer vedhæftning. Disse reagenser medfører en ekstra udgift, der kan overstige nogle laboratoriebudgetter. Derudover har kultur under feederfrie forhold været forbundet med et forstyrret differentieringspotentiale på grund af manglen på specifikke faktorer i de feederfrie kulturmedier og en deraf følgende overgang fra den naive tilstand til den primede tilstand. Vækst på mitotisk arresterede fødeceller undgår denne overgang og kan bringe de samlede omkostninger ned på et håndterbart niveau og dermed lette den bredere anvendelse af pluripotente stamceller i laboratorieforskning.
Disclosures
Joel C. Glover er direktør og Hege Brincker Fjerdingstad er daglig leder af den norske kernefacilitet for humane pluripotente stamceller. Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Lars Moen for hjælp under indledende forsøg og den norske kernefacilitet for humane pluripotente stamceller ved det norske center for stamcelleforskning, Oslo Universitetshospital, for brugen af faciliteter. H9 hESC linjen blev opnået fra WiCell, og HS429 hESC linjen blev opnået fra Outi Hovatta på Karolinska Institutet. Begge blev brugt i overensstemmelse med aftaler om materialeoverførsel. NCS001 og NCS002 hiPSC-linjerne blev genereret af den norske kernefacilitet for humane pluripotente stamceller. Denne omprogrammering og alt det arbejde, der rapporteres her, blev udført med godkendelse fra den sydøstlige norske regionale etiske komité (godkendelse REK 2017/110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
| Brand Bürker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
| Disposable scalpels no.15 | Susann-Morton | 505 | |
| DPBS (1x) without Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
| Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| Eppendorf pipette 1 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf pipette 200 μL | Eppendorf | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter tip 1,000 μL | Sarstedt | 70.1186.210 | |
| Filter tip 200 μL | Sarstedt | 70.760.211 | |
| Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation) | Best Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
| Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
| Growth Factor Reduced Matrixgel | Corning | 734-0269 | |
| H9 hESC line | WiCell | WAe009-A | |
| hPSC Genetic Analysis Kit | Stem Cell Technologies | #07550 | |
| HS429 hESC line | ECACC | KIe024-A | |
| Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line | ATTC | CRL2429 | |
| IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
| iPSC lines | Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells | NCS001 & NCS002 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss) | Zeiss | ||
| Microscope | CETI | ||
| Mitomycin C | Sigma Aldrich | M4287 | |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
| Pipettes, plastic 10 mL | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipettes, plastic, 5 mL | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serum Replacement (SR) | Gibco | 10828-028 | |
| Sterile filters 0.22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
| T-75 culture flask | ThermoScientific | 156499 | |
| Trypan Blue Stain (0.4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA, 500 mL | Gibco | 25300062 |
References
- Skottman, H., Hovet, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9 (2015).
- Villa-Diaz, L. G., et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).
- Watanabe, M., et al. TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids. Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307 (2015).
- Inzunza, J., et al. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117 (2020).
- Castro-Viñuelas, R., et al. Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).
- Meng, G., Rancourt, D. E. Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
