Summary
Om de beperkingen te vermijden die gepaard gaan met het enzymatisch of mechanisch passeren van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) gekweekt op feedercellen, hebben we een snelle, effectieve, kostenefficiënte methode met een hoge opbrengst ontwikkeld voor het oogsten van hESC- of hiPSC-kolonies die worden onderhouden op een voedingscellaag van menselijke voorhuidfibroblasten met behulp van EDTA-gemedieerde kkleefkracht.
Abstract
Menselijke pluripotente stamcellen (menselijke embryonale stamcellen, hESC's en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen, hiPSC's) werden oorspronkelijk gekweekt op verschillende soorten voedingscellen voor onderhoud in een ongedifferentieerde toestand in langdurige kweek. Deze aanpak is voor een groot deel verdrongen door feedervrije kweekprotocollen, maar deze omvatten duurdere reagentia en kunnen een overgang naar een geprimeerde toestand bevorderen, wat de differentiatiecapaciteit van de cellen beperkt. Zowel in voeder- als in voedervrije omstandigheden is het oogsten van hESC- of hiPSC-kolonies voor passage een noodzakelijke procedure voor het uitbreiden van de culturen.
Om een eenvoudige procedure met een hoog rendement te bieden voor het passeren van hESC's/hiPSC's die op voedingscellen worden gekweekt, hebben we een oogstmethode ontwikkeld met behulp van onthechting die wordt opgewekt door het calciumchelatorethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). We hebben de opbrengst en kwaliteit van de resulterende gepassagede cellen beoordeeld door deze benadering te vergelijken met de oorspronkelijke mechanische oogstbenadering, waarbij kolonies worden geïsoleerd met een scalpel onder een microscoop (mechanisch oogsten werd gekozen als vergelijkingsmiddel om de variabiliteit van reagens geassocieerd met enzymatisch oogsten te vermijden).
In één reeks experimenten werden twee verschillende hESC-lijnen gehandhaafd op een voedingscellaag van menselijke voorhuidfibroblasten. Elke lijn werd onderworpen aan meerdere passages met behulp van EDTA-gebaseerde of mechanische oogst en beoordeeld op koloniegrootte en morfologie, celdichtheid, expressie van stammarkers, differentiatie naar de drie kiemlagen in embryoïde lichamen en genomische afwijkingen. In een andere reeks experimenten gebruikten we EDTA-gebaseerde oogst op twee verschillende hiPSC-lijnen en verkregen we vergelijkbare resultaten. EDTA-geïnduceerde onthechting bespaarde tijd en gaf een hogere opbrengst van kolonies met een gunstigere grootte en een meer uniforme morfologie in vergelijking met mechanisch oogsten. Het was ook sneller dan enzymatisch oogsten en niet vatbaar voor variabiliteit van enzymbatches. De EDTA-geïnduceerde onthechtingsmethode vergemakkelijkt ook de overdracht van hESC/hiPSC-lijnen van op feedercellen gebaseerde cultuur naar feedervrije omstandigheden, indien gewenst voor stroomafwaarts gebruik en analyse.
Introduction
Het juiste onderhoud van hESC's en hiPSC's in vitro is een fundamentele en handige methodologie voor verschillende onderzoeksrichtingen in de menselijke cel- en ontwikkelingsbiologie. Vanwege de inherente drang van hESC's en hiPSC's om te differentiëren, vereist het handhaven van de ongedifferentieerde toestand in vitro bijzondere zorg en aandacht. Het ontwikkelen van kostenefficiënte protocollen voor het onderhoud en de doorgifte van hESC's en hiPSC's met zo min mogelijk methodologische variabiliteit is dus van groot algemeen nut.
Oorspronkelijk werden hESC's en hiPSC's gekweekt op verschillende soorten voedingscellen om te helpen bij de kweek op lange termijn en het behoud van de ongedifferentieerde toestand 1,2,3. Meer recentelijk is kweek onder feedervrije omstandigheden de norm geworden, omdat het omgaan met feedercellen helemaal wordt vermeden4. Sommige laboratoria en kernfaciliteiten kweken echter nog steeds hESC's of hiPSC's op feedercellen. Feedervrije kweek is duurder omdat het gebruik van kweekmedia met speciale samenstellingen en een of andere vorm van coating van het kweekoppervlak vereist om de hechting van de kolonie te garanderen (belangrijke extracellulaire matrix [ECM]-componenten of een commerciële ECM-verbinding, of het gebruik van in de handel verkrijgbare gecoate platen). De kosten zijn niet triviaal en vormen een potentiële financiële belemmering voor sommige laboratoria die geïnteresseerd zijn in het nastreven van hESC- of hiPSC-gebaseerd onderzoek en ontwikkeling. Bovendien heeft kweek onder voedervrije omstandigheden de neiging om de hESC's en hiPSC's in een minder naïeve toestand te brengen dan op voedercellenwordt gehandhaafd 5, en dit kan de latere differentiatie in gevaar brengen en leiden tot genetische variaties6.
Historisch gezien ging het passeren van hESC's en hiPSC's die op voedercellen werden gekweekt gepaard met mechanische oogst - met behulp van een scalpel om kolonies onder een microscoop te snijden7 - maar dit werd later grotendeels verdrongen door enzymatische vertering met of zonder zacht schrapen om kolonies of gedissocieerde cellen te isoleren. Mechanisch oogsten is vervelend en vereist precisiemicrochirurgie. Enzymatisch oogsten kan variëren in efficiëntie als gevolg van enzymverschillen van batch tot batch en neigt naar volledige dissociatie, wat celdood bevordert, tenzij het wordt tegengegaan door ROCK-remmers 8,9 en de incidentie van abnormale karyotypen verhoogt9.
Om te profiteren van de lagere kosten en het grotere differentiatiepotentieel van het kweken van hESC's en hiPSC's op voedingscellen en tegelijkertijd de nadelen van mechanisch en enzymatisch oogsten te vermijden, hebben we een snelle, effectieve, kostenefficiënte methode met een hoge opbrengst ontwikkeld voor het oogsten van hESC- en hiPSC-kolonies die worden onderhouden op een voedingslaag van menselijke voorhuidfibroblasten met behulp van EDTA-gemedieerde kleven. We hebben de opbrengst, variabiliteit en stamcelkwaliteit vergeleken met die verkregen met mechanisch oogsten (we hebben niet vergeleken met enzymatische vertering vanwege de extra variabiliteit die deze aanpak met zich meebrengt). We merken op dat EDTA-gemedieerde onthechting ook goed werkt voor het overbrengen van kolonies van op feeder gebaseerde cultuur naar feedervrije omstandigheden, indien gewenst voor stroomafwaarts gebruik en analyses. Deze methode biedt een overgang met een consistente passaging-methode, aangezien EDTA-geïnduceerde dis-adhesie een populaire benadering is die wordt gebruikt voor feedervrije culturen.
Protocol
Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Kweek van menselijke fibroblastcellen en voorbereiding van de voedercellaag
- Zaad 0,5 × 106 menselijke voorhuidfibroblasten (hierna "feedercellen" genoemd) per T-75-kweekkolf (aantal kolven naar behoefte) met 20 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) met (w/) 10% foetaal runderserum (FBS), hierna "feedercelmedium" genoemd.
- Wanneer de voedingscellen 90% samenvloeiing bereiken, verwijdert u het medium en wast u 3x met 10 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) per kolf om remming van trypsine door factoren in het medium te voorkomen. Voeg 2 ml trypsine-EDTA toe aan elke kolf en plaats de kolf(len) gedurende 5 minuten in een incubator van 37 °C/5% CO2 of totdat de toevoercellen van de kolf(len) zijn losgekomen. Observeer het loskomen van de cellen onder een microscoop als zwevende aggregaten van cellen of afzonderlijke cellen.
- Voeg 5 ml vers, voorverwarmd toevoercelmedium toe aan elke kolf om de trypsine-EDTA te inactiveren en hang de toevoercellen voorzichtig op door te pipetteren.
- Breng de toevoercellen over in een centrifugebuis van 15 ml. Sluit de buis af en pellet de voedingscellen door ze gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 200 × g .
- Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de pellet van de voedingscel te verstoren. Resuspendeer de pellet vervolgens voorzichtig in 4 ml vers voedingscelmedium. Zorg ervoor dat de toevoercellen grondig opnieuw worden gesuspendeerd voordat u gaat tellen met behulp van een celtelkamer of ander celtelapparaat.
- Voeg 0,5 × 106 feedercellen toe aan het vereiste aantal nieuwe T-75 kweekkolven voor expansie en voeg 20 ml vers voedercelmedium toe aan elke kolf. Incubeer de kweekkolf(en) in een incubator van 37 °C/5% CO2 totdat de samenvloeiing van de voedercellen 90% heeft bereikt.
OPMERKING: Feedercellen kunnen worden gebruikt tot ten minste doorgang 25. - Bereken het aantal voedercellen dat nodig is voor het aantal weefselkweekschaaltjes van 35 mm dat zal worden gebruikt voor het kweken van de hESC's/hiPSC's.
OPMERKING: Gewoonlijk zijn 3,0 × 105 feedercellen per weefselkweekschaal voldoende om een confluente laag feedercellen te genereren. - Om de proliferatie van de voedingscellen te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat ze op een van de twee manieren mitotisch worden gestopt.
OPMERKING: Voor beide methoden kan een grote partij mitotisch gestopte feedercellen worden gegenereerd en ingevroren in aliquots voor later gebruik.- Voer mitotische arrestatie uit door gammastraling door alle benodigde voedingscellen over te brengen naar een centrifugebuis van 50 ml en bij te vullen met voedingscelmedium tot een totaal volume van 5 ml. Transporteer onmiddellijk bij kamertemperatuur naar een gamma-bestralingsmachine en bestraal om de voedingscellen mitotisch te stoppen (300 kV en 10 mA gedurende 20 min).
OPMERKING: Een vertraging in het transport kan leiden tot ongewenste bevestiging van de toevoercellen aan de wand van de centrifugebuis van 50 ml. Als het transport langer dan een paar minuten duurt, zorg er dan voor dat de voedingscellen tijdens het transport blijven hangen door de buis continu te roeren. - Voer mitotische arrestatie uit met behulp van mitomycine C door alle benodigde voedingscellen in 5 ml voedingscelmedium over te brengen naar een centrifugebuis van 50 ml, en voeg vervolgens 15 ml voedingscelmedium met 20 μg/ml mitomycine C toe en incubeer gedurende 3 uur in een incubator van 37 °C/5% CO2. Voeg 20 ml PBS 37 °C toe, pelleteer de cellen door centrifugeren bij 200 × g gedurende 5 minuten, herhaal de PBS-was nog twee keer en resuspendeer in het medium van de voedingscel.
- Voer mitotische arrestatie uit door gammastraling door alle benodigde voedingscellen over te brengen naar een centrifugebuis van 50 ml en bij te vullen met voedingscelmedium tot een totaal volume van 5 ml. Transporteer onmiddellijk bij kamertemperatuur naar een gamma-bestralingsmachine en bestraal om de voedingscellen mitotisch te stoppen (300 kV en 10 mA gedurende 20 min).
- Nadat de feedercellen mitotisch zijn gestopt, keert u terug naar de weefselkweekkap en plaatst u de feedercellen bij 3,0 × 105 cellen per weefselkweekschaal van 35 mm, als volgt. Zorg ervoor dat de voedingscellen volledig geresuspendeerd zijn, voeg het voedercelmedium toe om een voedercelconcentratie van 1,5 × 105 per ml te bereiken en voeg 2 ml van deze voedingscelsuspensie toe aan elk weefselkweekschaaltje van 35 mm.
- Breng de kweekschalen over naar een incubator van 37 °C/5% CO2 . Om een gelijkmatige verdeling van de voedingscellen te garanderen, beweegt u de kweekschalen langzaam maar stevig op de broedmachineplank 3x naar voren en naar achteren, gevolgd door een pauze, en voert u vervolgens 3x dezelfde handeling van links naar rechts uit. Verplaats de vaat niet meer en sluit voorzichtig de deur van de couveuse.
- Schakel na 24 uur over van feedercelmedium naar IMDM met 10% serumvervanging (SR). Vervang dit medium daarna om de drie dagen. De feedercellen zijn na de eerste 3 dagen klaar voor gebruik.
2. Mechanisch oogsten van de hESC- of hiPSC-kolonies
- Voorwarm hESC-medium bestaande uit 80% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 20% SR, 1 mM glutaminevervanger 100x, 1 mM niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1 mM penicilline/streptomycine (P/S), 0,1 mM 2-mercaptoethanol en 10 ng/ml basisfibroblastgroeifactor (bFGF). Het hESC-medium wordt gebruikt voor de kweek van de hESC's of hiPSC's op de voedingscellen.
- Neem verse weefselkweekschaaltjes van 35 mm met mitotisch gestopte voedingscellen en vervang het voedingscelmedium door 1,2 ml hESC-medium dat bFGF bevat, ten minste 30 minuten voor de overdracht van de hESC/hiPSC-kolonies.
- Plaats een kweekschaal met hESC/hiPSC-kolonies op mitotisch gestopte voedingscellen onder een microscoop met een vergroting van 10x die in een laminaire stroomkap is geplaatst. Gebruik een steriel scalpel om voorzichtig rond de omtrek van elke kolonie te snijden en snijd vervolgens elke kolonie in 5-6 ongeveer gelijke stukken. Til de koloniestukken voorzichtig op met de punt van het scalpelmesje zodat ze loskomen van de voedercellaag en vrij in het medium drijven.
- Probeer regio's van de kolonies te vermijden die differentiërende cellen bevatten, die verschijnen als eilanden van kleinere cellen met minder verschillende kernen in vergelijking met hESC's/hiPSC's binnen een kolonie.
- Breng de vrij zwevende kolonies met een pipet van 1 ml over naar de nieuwe kweekschaaltjes met daarin de voedercellen. Probeer de kolonies gescheiden te houden zodat ze later niet in elkaar groeien. Verplaats de kweekschalen voorzichtig naar een celincubator en verstoor de vaatjes niet tot de volgende dag.
- Voeg de volgende dag voorzichtig 600 μL hESC-medium met bFGF toe tot een eindvolume van 1,8 ml. Vervang daarna elke dag het hESC + bFGF-medium tot de volgende passage (meestal na 1 week).
3. Oogsten van de hESC- of hiPSC-kolonies met behulp van EDTA-gemedieerde kkleefkracht
- Neem verse kweekschalen met mitotisch gestopte voedingscellen en schakel ten minste 30 minuten voor de overdracht van de kolonies over van IMDM met 10% SR naar 1,2 ml voorverwarmd hESC + bFGF-medium.
- Behandel één kweekschaal met hESC- of hiPSC-kolonies tegelijk. Verwijder het hESC + bFGF-medium en was de kolonies met 1 ml DPBS op kamertemperatuur om eventuele losse cellen en celresten te verwijderen. Voeg 1 ml 0,5 mM EDTA toe en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 °C. Als de laminaire stromingskap een warmhoudplaat heeft, voert u deze stap en de stappen in sectie 4 uit op de warmhoudplaat voor een betere hechting.
- Verwijder na de incubatie van 1 minuut de EDTA-oplossing en voeg voorzichtig 1 ml hESC + bFGF-medium toe met behulp van een pipet van 1 ml. Driemaal voorzichtig met dezelfde pipet om de kolonies los te maken van de cellaag van de feeder. Blijf voorzichtig tritureren totdat de cellaag van de feeder loskomt en zich in een aparte klomp opvouwt. Trek de cellaag van de feeder weg met de pipetpunt.
- Breng de gesuspendeerde hESC/hiPSC-kolonies met een nieuwe pipet van 1 ml over naar nieuwe kweekschalen met de voedingscellen en hESC + bFGF-medium, en splits ze in een verhouding van 1:5. De kolonies hebben de neiging om zich gelijkmatig te verdelen binnen elke nieuwe kweekschaal, maar vergemakkelijken dit door de schaal voorzichtig heen en weer te bewegen. Vervang daarna elke dag het hESC + bFGF-medium tot de volgende passage (meestal na 1 week).
Representative Results
In de hieronder gedocumenteerde tests en vergelijkingen gebruikten we twee hESC-lijnen (H9 en HS429, respectievelijk van WiCell en het Karolinska Instituut) en twee hiPSC-lijnen (NCS001 en NCS002, beide gegenereerd door de Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells). De gegevens in de figuren en tabellen zijn afkomstig van de hESC-lijnen, maar van de hiPSC-lijnen zijn volledig vergelijkbare resultaten verkregen.
In onze handen resulteerde mechanisch oogsten erin dat de kolonies werden opgesplitst in ongeveer vijf tot zes klompen met een diameter van ~200-250 μm, terwijl met EDTA-geïnduceerde kkleefing gevolgd door trituratie, elke kolonie werd opgesplitst in ~10-20 klompen met een diameter van ~60 μm. We schatten dat het aantal cellen in elke door EDTA geoogste klomp ~20 is. Omdat het onpraktisch is om een kolonie met een scalpel in klonten van deze grootte te splitsen, is in dit opzicht EDTA-geïnduceerde klevende onthechting superieur, omdat het klonten genereert van een grootte die gunstiger is voor de overleving van koloniecellen10,11.
De hESC/hiPSC-kolonies die met EDTA werden geoogst, waren ook homogener in grootte en vorm in vergelijking met de kolonies die mechanisch werden geoogst (Figuur 1A-F). Dit komt omdat het snijden dat nodig is voor mechanisch oogsten ongelijke randen en verschillende klontgroottes genereert. Om dit kwantitatief te evalueren, beoordeelden we de cirkelvormigheid van de kolonie (als een maat voor hoe afgerond de kolonieranden waren; een waarde van 1 geeft een perfecte cirkel aan) 5 dagen na het passeren met behulp van het ImageJ-win64-protocol12. De cirkelmatigheid van de kolonie was significant lager in de kolonies die machinaal werden geoogst (mechanisch oogsten: 0,61 ± 0,10; Oogsten op basis van EDTA: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, Mann-Whitney U-test, U = 10).
De celdichtheid in de geoogste en opnieuw geplateerde kolonies, die een maat is voor de interacties tussen cellen na het oogsten tijdens de vorming van kolonies, was vergelijkbaar met op EDTA gebaseerde oogst en mechanisch oogsten (tabel 1 en figuur 1G,H). De mechanisch geoogste kolonies hadden een grotere neiging om necrose te ontwikkelen in hun centrale regio's (Figuur 1J). Dit was waarschijnlijk te wijten aan variabiliteit in de vorm en, in het bijzonder, de grootte van de mechanisch geïsoleerde celklonten, want wanneer deze klonten te groot zijn, kunnen ze gemakkelijk op zichzelf vouwen wanneer ze worden overgebracht naar nieuwe kweekschalen. Dit was niet het geval bij de kolonies die werden geoogst met behulp van EDTA, die uniform een doorschijnend uiterlijk vertoonden met duidelijke randen (figuur 1I).
Met behulp van EDTA-gebaseerde oogst waren we in staat om vrijwel alle kolonies die in een put waren gevestigd binnen 2-3 minuten te verzamelen. Met behulp van mechanisch oogsten zou het verzamelen van alle kolonies in een put vervelend en tijdrovend zijn. We slaagden er meestal in om slechts ~30%, of ~20-25 kolonies te verzamelen, met behulp van mechanisch oogsten, en dit duurde ~20 minuten. Evenzo was het met behulp van collagenase-vertering gevolgd door zacht schrapen meestal moeilijk om alle kolonies te oogsten, hoewel de totale procedure slechts een paar minuten duurde. Oogsten op basis van EDTA is dus net zo snel of sneller dan enzymatisch oogsten en efficiënter dan mechanisch of enzymatisch oogsten.
Om het effect van de verschillende oogstmethoden op stamheid en pluripotentie te beoordelen, onderwierpen we eerst de kolonies verkregen na 20 passages met behulp van EDTA-gebaseerde of mechanische oogst aan qPCR-analyse (Figuur 2) en immunocytochemische kleuring (Figuur 3 en Figuur 4) voor stamheidsmarkers. De kolonies die met beide methoden werden verkregen, vertoonden een stabiele expressie van stammarkers, zowel op mRNA- als op eiwitniveau. Vervolgens beoordeelden we de pluripotentie door differentiatie naar de drie kiemlagen in embryoïde lichamen (Figuur 5 en Figuur 6). De embryoïde lichamen die werden gegenereerd uit de hESC's of hiPSC's die na 20 passages met behulp van beide methoden werden verkregen, bevatten een mengsel van cellen die algemeen beoordeelde markers voor ectoderm, mesoderm en endoderm tot expressie brachten.
Ten slotte beoordeelden we de incidentie van genomische afwijkingen in hESC's en hiPSC's die door elke methode werden gepasseerd met behulp van qPCR-gebaseerde genetische analyse (zie de materiaaltabel). De kolonies die na 20 passages met behulp van een van beide oogstmethoden werden verkregen, vertoonden enkele voorbeelden van een bescheiden afwijking van een referentie diploïde chromosomaal patroon (de beoordeelde afwijkingen waren die welke gewoonlijk geassocieerd werden met de herprogrammering van hiPSC's, maar kunnen ook worden verkregen in hESC's) (Figuur 7). Het patroon van deze afwijkingen was echter in wezen hetzelfde in de kolonies die na een van beide oogstmethoden werden verkregen, wat erop wijst dat zij geen verband hielden met de oogstmethode.
Figuur 1: Morfologie van de kolonie en celdichtheid na EDTA-gebaseerde of mechanische oogst. (A-F) Representatieve helderveldbeelden van H9 hESC-kolonies die gedurende 5 dagen na 20 passages in voedervrije cultuur zijn gevestigd met behulp van (A-C) EDTA-gebaseerde of (DF) mechanische oogst. (G,H) Representatieve fluorescentiebeelden van de celdichtheid in H9 hESC-kolonies die na 20 passages zijn vastgesteld met behulp van (G) EDTA-gebaseerde of (H) mechanische oogst. De celkernen zijn gekleurd met DAPI. (I,J) Representatieve helderveldbeelden van H9 hESC-kolonies die na 20 passages zijn vastgesteld met behulp van (I) EDTA-gebaseerde of (J) mechanische oogst. Let op het necrotische centrale gebied in de kolonie dat mechanisch wordt geoogst (pijl in J). Alle beelden werden 5 dagen na de 20e passage verkregen. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: hESC = humane embryonale stamcel; EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Expressie van stamness marker mRNA in twee hESC-lijnen (H9 en HS429) gegenereerd na EDTA-gebaseerde of mechanische oogst. Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie van de aangegeven markers in H9 (bovenste paneel) en HS429 (onderste paneel) hESC's na een enkele passage met behulp van mechanisch oogsten, na 20 passages met mechanisch oogsten en na 20 passages met behulp van op EDTA gebaseerd oogsten (1:5 verdunning). Het expressieniveau is relatief ten opzichte van dat van het huishoudgen ACTB (bèta-actine). De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: hESC = humane embryonale stamcel; EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Expressie van stamness marker eiwitten in de H9 hESC-lijn na verschillende oogstomstandigheden. Representatieve immunofluorescentiekleuring van H9 hESC-kolonies die mechanisch zijn geoogst (A-E) vóór verdere passing, (F-J) na 20 passages met behulp van mechanisch oogsten en (K-O) na 20 passages met behulp van op EDTA gebaseerde oogst. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: hESC = humane embryonale stamcel; EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Expressie van stamness marker eiwitten in de HS429 hESC-lijn na verschillende oogstomstandigheden. Representatieve immunofluorescentiekleuring van HS429 hESC-kolonies die mechanisch zijn geoogst (A-E) vóór verdere passing, (F-J) na 20 passages met behulp van mechanisch oogsten en (K-O) na 20 passages met behulp van EDTA-gebaseerde oogst. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: hESC = humane embryonale stamcel; EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Expressie van merkers voor de drie kiemlagen in embryoïde lichamen gegenereerd uit de H9 hESC-lijn na mechanisch of EDTA-gebaseerd oogsten. Representatieve immunofluorescentiekleuring van markers voor (A- en D-rijen) ectoderm (ECTO, TUJI), (B- en E-rijen) endoderm (ENDO, AFP) en (C- en F-rijen) mesoderm (MESO, SMA). EB's gegenereerd (A-C) na 20 passages mechanisch oogsten of (D-F) na 20 passages van EDTA-gebaseerde oogst. Schaalbalken = 40 μm. Afkortingen: hESC = humane embryonale stamcel; EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur; EB's = embryoïde lichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Expressie van merkers voor de drie kiemlagen in embryoïde lichamen gegenereerd uit de HS429 hESC-lijn na mechanisch of EDTA-gebaseerd oogsten. Representatieve immunofluorescentiekleuring van markers voor (A- en D-rijen) ectoderm (ECTO, TUJI), (B- en E-rijen) endoderm (ENDO, AFP) en (C- en F-rijen) mesoderm (MESO, SMA). EB's gegenereerd (A-C) na 20 passages mechanisch oogsten (A-C) of (D-F) na 20 passages van EDTA-gebaseerde oogst. Schaalbalken = 40 μm. Afkortingen: hESC = humane embryonale stamcel; EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur; EB's = embryoïde lichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: qPCR-gebaseerde genetische analyse van veel voorkomende genomische afwijkingen in de HS9- en HS429 ESC-lijnen en de NCS002 iPSC-lijn na 20 passages met behulp van mechanische of EDTA-gebaseerde oogst. De basislijn op waarde 2 vertegenwoordigt normale diploïdie op alle chromosomale markers. Een waarde van 1 of 3 zou respectievelijk een verlies of winst van de aangegeven chromosomale marker in alle cellen vertegenwoordigen. Tussenliggende waarden tussen 1 en 2 of tussen 2 en 3 duiden op de aanwezigheid van een verlies of winst van de aangegeven marker in een fractie van de cellen. Merk op dat het patroon van aberraties vergelijkbaar is in de twee oogstomstandigheden. Afkortingen: ESC = embryonale stamcel; EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Celdichtheid (cellen/mm2) | ||
| H9 | bedoelen | stdev |
| Mechanische oogst voor verdere doorgifte | 3918 | 263.3 |
| Mechanische oogst 20 keer | 3868 | 197.7 |
| EDTA-oogst 20 keer | 4080 | 127.8 |
| HS429 | bedoelen | stdev |
| Mechanische oogst voor verdere doorgifte | 5249 | 565.4 |
| Mechanische oogst 20 keer | 5247 | 726.3 |
| EDTA-oogst 20 keer | 4963 | 448.8 |
Tabel 1: Vergelijking van de celdichtheden in de kolonies van de twee hESC-lijnen (H9 en HS429) gegenereerd na EDTA-gebaseerde of mechanische oogst. De celdichtheden werden beoordeeld na een enkele passage met behulp van mechanisch oogsten, na 20 passages met mechanisch oogsten of na 20 passages met behulp van op EDTA gebaseerde oogst (bij verdunning van 1:5). In alle gevallen geldt n = 5 kolonies.
Discussion
We hebben een snelle en kostenefficiënte methode beschreven voor het oogsten van hESC's en hiPSC's gekweekt op feedercellen met behulp van EDTA-gemedieerde kkleefkracht en vergeleken dit voornamelijk met de conventionele methode van mechanisch oogsten met behulp van een scalpel. We vergeleken ook EDTA-gebaseerde oogst met enzymatisch oogsten met betrekking tot de snelheid van de methode, maar niet met betrekking tot aspecten van de resulterende koloniekwaliteit. De reden hiervoor is dat enzymatische oogst inherent variabeler is en in verband is gebracht met een hogere prevalentie van genomische aberraties5, wat de verschillen tussen de methoden zou kunnen verdoezelen.
We tonen aan dat oogsten op basis van EDTA sneller en efficiënter is dan elk van de andere methoden en kleinere en morfologisch homogenere kolonies genereert dan mechanisch oogsten. Dit laatste kenmerk is gunstig voor de overleving van cellen, aangezien de grotere klonten die worden verkregen met mechanisch oogsten vatbaar zijn voor centrale necrose, terwijl enzymatische vertering de neiging heeft om geïsoleerde hESC's en hiPSC's te genereren, die vatbaarder zijn voor apoptose en extra behandeling vereisen, bijvoorbeeld met ROCK-remmers, om te overleven. Oogsten op basis van EDTA kan worden gebruikt voor ten minste 20 passages. De op EDTA gebaseerde en mechanische oogstmethoden zijn vergelijkbaar als het gaat om kolonieceldichtheid, mRNA- en eiwitexpressie van stamgenen, differentiatie van de drie kiemlagen in embryoïde lichamen en genomische afwijkingen. Als het doel efficiëntie, hogere opbrengst, minder variabiliteit en een zachtere behandeling van de hESC's en hiPSC's is, verdient oogsten op basis van EDTA de voorkeur.
We merken ook op dat het oogsten op basis van EDTA van hESC's en hiPSC's die op feedercellen zijn gekweekt, een goedkope manier is om een meer naïeve toestand te behouden en zorgt voor een soepele overgang van feeder-gebaseerde naar feeder-vrije cultuur waar dit wenselijk is.
Kritische stappen binnen het protocol
De meest kritieke stappen van EDTA-gemedieerde dis-adhesie zijn protocolsectie 3 (incubatie in de EDTA-oplossing) en sectie 4 (trituratie). Als de blootstelling aan de EDTA-oplossing langer dan 1 minuut duurt, neemt het risico op volledige dissociatie van afzonderlijke cellen toe. Dit kan ook gebeuren als de trituratie te lang of te hard is. Dit laatste wordt beïnvloed door de grootte van de pipetpunt. Het gebruik van celkweekpipetten van 1 ml zoals hier beschreven is ideaal. Het gebruik van een ander type pipet met een kleinere tipdiameter is riskant.
Probleemoplossing
Als de voedingscellen zich blijven vermenigvuldigen, is mitotische arrestatie niet effectief geweest en moet een nieuwe batch worden genomen en moet de procedure opnieuw worden gestart. Als de kolonies niet loskomen van de voedingscellaag, moet men ervoor zorgen dat er geen Ca2+ in de EDTA zit en dat het kweekschaaltje met de kolonies goed wordt gespoeld met PBS om eventueel achtergebleven celkweekmedium te verwijderen voordat de EDTA wordt toegevoegd. Te veel dissociatie, die geïsoleerde cellen of te kleine celklonten genereert, kan ontstaan als gevolg van overmatige trituratie en brengt de vestiging van nieuwe kolonies in gevaar. De mate van trituratie moet empirisch worden bepaald in proefruns van het protocol om te bevestigen dat de resulterende celklonten een diameter van ~60 μm hebben. Als de feederlaag spontaan loskomt van de kweekschaal, vooral voordat de hESC's/hiPSC's klaar zijn om te oogsten, kan het zijn dat de feedercellen niet binnen ~7 dagen na bereiding zijn gebruikt. Daarom moet het tijdsbestek van gebruik van de feedercellen zorgvuldig worden gecontroleerd. Als de voedingslaag dissocieert tijdens blootstelling aan EDTA (iets wat we nog nooit hebben waargenomen met de voedercellen die hier worden gebruikt), moet het type voedercel of hun kweekmethode worden gewijzigd.
Beperkingen van de techniek
De belangrijkste beperking van de techniek is dat het visuele inspectie van het khechtingsproces vereist om een succesvol resultaat te bereiken. Dit betekent dat gebruikers moeten leren hoe ze kunnen identificeren wanneer de kolonies loskomen van de feedercellaag en de feedercellaag loskomt van het substraat. Dit is echter niet moeilijk, en onze ervaring is dat nieuwe gebruikers van de techniek deze binnen een paar proeven onder de knie kunnen krijgen.
Er is ook een inherente mogelijkheid dat de geoogste hESC's of hiPSC's besmet zijn door enkele voedercellen. Als het de bedoeling is om over te gaan naar niet-feederomstandigheden of om de hESC's of hiPSC's te isoleren voor tests, zou een dergelijke verontreiniging de zuiverheid in gevaar brengen. We merken op dat het met de hier gebruikte voedingscellen (menselijke voorhuidfibroblasten) uiterst moeilijk is om de voedingscellaag te dissociëren, zelfs met enzymatische vertering (niet afgebeeld). Aangezien de niet-gedissocieerde voedingscellaag in zijn geheel wordt verwijderd, is de besmetting van de geoogste hESC's of hiPSC's waarschijnlijk verwaarloosbaar. Omdat de voedingscellen bovendien mitotisch worden gestopt, zou elke besmetting uiteindelijk tot nul afnemen bij verdere passaging van de hESC's of hiPSC's.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
De huidige norm voor het kweken van hESC's en hiPSC's is om dit te doen onder voedervrije omstandigheden, waarvoor het gebruik van EDTA voor passaging wijdverbreid is. Feedervrije kweek is afhankelijk van het gebruik van speciaal samengestelde media en kweeksubstraten die hechting garanderen. Deze reagentia brengen extra kosten met zich mee die sommige laboratoriumbudgetten kunnen overschrijden. Bovendien is kweek onder voedervrije omstandigheden in verband gebracht met een verstoord differentiatiepotentieel als gevolg van het ontbreken van specifieke factoren in de voedervrije kweekmedia en een daaruit voortvloeiende overgang van de naïeve toestand naar de geprimeerde toestand. Groei op mitotisch gestopte voedingscellen vermijdt deze overgang en kan de totale kosten terugbrengen tot een beheersbaar niveau, waardoor het bredere gebruik van pluripotente stamcellen in laboratoriumonderzoek wordt vergemakkelijkt.
Disclosures
Joel C. Glover is de directeur en Hege Brincker Fjerdingstad is de dagelijkse manager van de Noorse kernfaciliteit voor menselijke pluripotente stamcellen. De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
We danken Lars Moen voor zijn hulp bij voorbereidende experimenten en de Noorse kernfaciliteit voor menselijke pluripotente stamcellen van het Noorse Centrum voor Stamcelonderzoek, het Universitair Ziekenhuis van Oslo, voor het gebruik van de faciliteiten. De H9 hESC-lijn werd verkregen van WiCell en de HS429 hESC-lijn werd verkregen van Outi Hovatta van het Karolinska Instituut. Beide werden gebruikt in overeenstemming met Material Transfer Agreements. De hiPSC-lijnen NCS001 en NCS002 zijn gegenereerd door de Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells. Die herprogrammering en al het werk dat hier wordt gerapporteerd, werden uitgevoerd met de goedkeuring van de regionale ethische commissie van Zuidoost-Noorwegen (goedkeuring REK 2017/110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
| Brand Bürker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
| Disposable scalpels no.15 | Susann-Morton | 505 | |
| DPBS (1x) without Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
| Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| Eppendorf pipette 1 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf pipette 200 μL | Eppendorf | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter tip 1,000 μL | Sarstedt | 70.1186.210 | |
| Filter tip 200 μL | Sarstedt | 70.760.211 | |
| Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation) | Best Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
| Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
| Growth Factor Reduced Matrixgel | Corning | 734-0269 | |
| H9 hESC line | WiCell | WAe009-A | |
| hPSC Genetic Analysis Kit | Stem Cell Technologies | #07550 | |
| HS429 hESC line | ECACC | KIe024-A | |
| Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line | ATTC | CRL2429 | |
| IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
| iPSC lines | Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells | NCS001 & NCS002 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss) | Zeiss | ||
| Microscope | CETI | ||
| Mitomycin C | Sigma Aldrich | M4287 | |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
| Pipettes, plastic 10 mL | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipettes, plastic, 5 mL | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serum Replacement (SR) | Gibco | 10828-028 | |
| Sterile filters 0.22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
| T-75 culture flask | ThermoScientific | 156499 | |
| Trypan Blue Stain (0.4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA, 500 mL | Gibco | 25300062 |
References
- Skottman, H., Hovet, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9 (2015).
- Villa-Diaz, L. G., et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).
- Watanabe, M., et al. TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids. Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307 (2015).
- Inzunza, J., et al. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117 (2020).
- Castro-Viñuelas, R., et al. Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).
- Meng, G., Rancourt, D. E. Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
