Summary
このビデオの記事では、安定かつ制御可能なジオメトリを持つ匂い勾配の構築を可能にする新しい方法を説明します。我々は、簡単にこれらの勾配が嗅覚の欠陥のために画面に使用することができます（フルおよび部分的な臭覚障害）と走化性行動のより微妙な特徴を研究する方法を示しています。
Abstract
ショウジョウバエの幼虫の嗅覚応答は、伝統的に、単一の末梢臭気源を構成するペトリ皿に研究されている。この行動のパラダイムでは、実験者は通常、ソースからの匂い分子の急速な普及は、皿の安定勾配の創造につながることを前提としています。感覚入力と行動反応の間に定量的な相関関係を確立するには、それは、匂いの刺激条件のより完全な特性評価を達成するために必要です。このビデオの記事では、安定かつ制御可能なジオメトリを持つ匂い勾配の構築を可能にする新しい方法を説明します。我々は、簡単にこれらの勾配が嗅覚の欠陥のために画面に使用することができます（フルおよび部分的な臭覚障害）と走化性行動のより微妙な特徴を研究する方法を示しています。
Protocol
1。機器と試薬
臭気の希釈：
- パラフィン油（シグマ、CAS番号：8012-95-1）
- ショウジョウバエの幼虫1の魅力を引き出す可能な最高純度の匂い。このビデオの記事では、動物は、酢酸イソアミル（：123-92-2シグマ、CAS番号）でテストされました。
- テフロンキャップ付き1.5ミリリットルのガラスバイアル（アジレントテクノロジー）
- 重量で正確な希釈用デジタル測定尺度
セットアップアッセイの分野：
- アガロース（プロメガ社製）
- 96ウェルマイクロプレート（：353071 BDファルコン、カタログ番号）の蓋。私たちの行動のアリーナは、3つのスタックされた蓋で構成されています。
- シングルチャネルスタックの最上部蓋に匂いの液滴（s）をロードするために10から20μlをピペッターまたはマルチチャンネルピペッター。複数のソースのアッセイを設定するには、我々は、レイニンから5〜50μlをピペットライトマルチチャンネルピペッターを使用してください。
行動テストのためのショウジョウバエの幼虫の調製：
- 15％（w / w）のショ糖溶液
- 幼虫を洗浄し、保存するために、通常のペトリ皿（BDファルコン）
- 幼虫を操作して転送するためにペイントブラシ（4〜5ミリメートル毛の長さ）
幼虫の動きの記録：
- アリーナに幼虫を転送するための平らな頭と小さなピン
- 鉗子または録音後に幼虫を除去する絵筆
- 均質な非加熱光源、ローガンエレクトリック社製"スリムエッジ"ライトパッド付きバックライトステージ
- 内閣は、行動アリーナと制御光の条件を囲むために
- 動物の動きの記録のためのビデオトラッキングシステム。我々はEthovisionソフトウェア（Noldus、オランダ）を使用しています。
- Ethovisionソフトウェアと一緒に購入したCCDカメラとフレームグラバのビデオカード（EureCardのピッコロの基本）
- 行動テスト（オプション）の間に大気の状態を監視する温度計と湿度記録計
- カスタマイズされたデータ解析のためのMATLAB（Mathworks社）（オプション）
2。行動アリーナ
行動のアリーナは、3つのスタックされた96ウェルディッシュの蓋で構成されています。底部の蓋は、光パッドからシステムの残りの部分を分離し、舞台で対流を低減するために使用されます。 3％アガロースゲルの25ミリリットルで覆われた第二蓋は、、の上を歩くために幼虫のための舞台としての役割を果たします。上蓋は、表面張力によって中断されたまま臭気の液滴を保持しています。
臭いの液滴は、96ウェルディッシュのフタのウェルに直接ピペッティングしている。単一または複数の悪臭源が明確な、検証可能なプロファイル2と勾配を生成するために使用することができます。臭覚障害と幼虫の走化性の欠陥をテストするために、我々は、次の2つのアッセイを使用することを提案。
2.1。単一の臭気源の検定：よく＃E7に敷設された単一の臭いの液滴（標準96ウェルプレートの参照システム）。
- 刺激：パラフィンオイルで希釈した臭気の10μlを
- 初期条件：単一の幼虫は、臭気源（またはその近くに近所の）の下に導入されています。
- 基本的な観察：魅力的な刺激のためには、（例えば酢酸イソアミル）、野生型幼虫は、ソースの下に蓄積する。嗅覚の欠陥にさらさ無嗅覚の動物または動物はすぐに離れて液滴からさまよう。
- トライアルの期間：3分。試行時間が経過するか、すぐに動物の接点板の壁などまで、与えられた動物の動きが記録されます。
- 行動の定量化の可能なメトリクス：臭気源を中心に小さな円形のゾーンの動物によって費やされる時間の割合、臭気源への距離を意味する、臭気源までの距離の経時変化、等
このアッセイでは、効率的に変異体の幼虫の基本的な臭覚障害のためにテストします。また、確実に特定の臭気2の検出のしきい値を決定するために使用することができます。
2.2。複数の臭気源の分析
いくつかの臭いの液滴は上部蓋のウェルに配置されます。現在のビデオの記事では、我々は6つの液滴の合計が井戸＃E2、＃E4、＃E10＃E6、＃E8、および＃E12（標準的な96ウェルプレートのリファレンスシステムで導入された中央の行E.に沿ってグラデーションを設定）。ペトリ皿とsingle臭気源のアッセイとは対照的に、複数の臭気源のアッセイは、アリーナの長さと幅に沿ってestablished勾配のジオメトリの質的な制御が可能になります。このアッセイはchemotax 2〜ショウジョウバエの幼虫を可能にする感覚のメカニズムを特徴づけるために使用されていました。
- 刺激：10μlの臭いの液滴は、行に沿って井戸を交互に配置されます。この配置は、グラデーションの中央に選択された行の作成につながります。アリーナの幅に沿って均一な勾配を確立するには、いくつかの行が複数の情報ソースをロードすることができます。
- 初期条件：単一の幼虫は、井戸＃E3と＃の間に臭気源の下に導入されていますE4。
- 基本的な表現型：無嗅覚の幼虫は、出発点からランダムにさまよう。にとって魅力的な刺激（例えば酢酸イソアミル）、増加する臭気濃度の方向に沿ってナビゲートをかぐすることができる動物。動物は匂い道を上昇する精度は、匂いの刺激を感知し、処理する能力と相関している。曲がりくねったパスはしばしば感覚の欠陥によって引き起こされます。動物は、試験で最も高い濃度の地点に達すると、それはこの位置の近傍に残ります。
- トライアルの期間：3分の最大値（より長い追跡期間は幼虫のようなノイズが興味を失った、最終的に勾配を放棄導入する傾向がある）。動物は、最高濃度のソース（よく＃E12）の近傍に達するまでこのビデオの記事に示されているグラデーションの場合は、個々の幼虫の動きを記録した。録音は、すぐに動物がターゲット領域に達するか、アリーナのいずれかの壁に接触して停止した。
- 行動の定量化の可能なメトリクス：嗅覚ライン（青い四角形）の下で動物が費やす時間の割合、臭気の勾配の局所方向に対して見出しを意味し、嗅覚に従うように動物の世界的な傾向を測定する複合走化性のスコア2行目。
3。勾配のプロファイルの検証
特に勾配の幼虫をテストする前に、それは時間が経過すると、その安定性を判断することが重要です。これに基づき、実験者は、それぞれの試験のための十分な期間と同じ分野で連続して追跡できる幼虫の数を決定することができます。勾配の安定性をテストするために、我々は、IR分光法2に基づく手法を開発した。このメソッドは、このプロトコルの範囲を超えていますし、さらに精緻化されることはありません。
4。実験の準備のためのプロトコル
4.1。アガロースプレートと臭気の希釈液の調製：
- 1。 96ウェルディッシュのフタのフラットトップの上に3％アガロースの25ミリリットルを注ぎ、アガロースがダウンして冷却固化（〜30分）することができます。
重要：96ウェル蓋が固化したアガロースゲル上の斜面の存在は、幼虫の動作に影響を与える可能性があるため、アガロースを注ぐ前に、平らな場所にあることを確認してください。ゲルを注ぐときに、表面に形成する気泡を取り除く。 - 2。正確にそれぞれの希釈でパラフィン油と臭気の量を測定するためにデジタルスケールを用いてパラフィンオイルで所望の濃度に臭気を希釈する。
ノート：低臭気の濃度が使用されている場合、それは連続希釈に基づいてソースの濃度の集合を準備するのが好ましい。 1.0M溶液を、例えば、起動して、0.5M溶液を得るため、1:2希釈を行う。反復的に進めることによって、人は0.5M等比数列の1.0M、0.25M、0.12M、0.06M、0.03M、0.015M以下の希釈系列を取得します。
重要：多くの有機悪臭はプラスチックと反応するので、臭気の希釈液をテフロンキャップのガラスバイアルに格納する必要があります。各実験は、実験全体で実際の臭気濃度の変動を軽減する前に、理想的には、悪臭が新鮮準備する必要があります。非常に揮発性の薬品を使用している場合に特に当てはまります。
4.2。幼虫の準備：
- 1。蒸留水に15％ショ糖溶液を調製します。
ノート：15％ショ糖溶液は幼虫よりも高密度であり、それらが溶液の表面に支えられることになります。しかし、未溶解のフライ食品のチャンクは、ソリューションよりも大きな密度を持ち、急速に底に沈む。従って、このショ糖溶液を使用すると、食べ物から幼虫を分離する効率的な手段を提供します。ショ糖溶液は、生物学的汚染物質のための優れた媒体である、溶液は濁りとなる場合には、フィルターの汚染を除去するために滅菌することができる。 - 目的の発達段階での6日齢幼虫または幼虫でバイアルを取得します。
注意：すべての我々の実験は、6日齢幼虫（三齢発達の段階の真ん中）で実施され、この発達段階での幼虫は、私たちのトラッキングソフトウェアで検出を容易にするために十分な大きさだけでなく、非常にアクティブになります。 - 幼虫を含む食品のバイアルにショ糖を注ぐ。
- スパチュラを用いて、分割し、幼虫を解放するためにそっとフライ食品を溶かす。リリース幼虫が表面に浮かび上がるだろう。
- フライ食品のチャンクの数分がバイアルの底に沈むことを許可し、次に、ペトリ皿にショ糖と幼虫を注ぐ。幼虫の事前選択が必要な場合、動物はフィルターを通してスクロースを注ぐことによって収集することができます。幼虫はその後、絵筆を持つ選択のための皿に転送することができます。
- sの約30分間、幼虫を残す動物はショ糖溶液に慣らすようにする行動試験を進める前にucroseソリューション。幼虫はショ糖を餌に表示されないように、動物は、走化性、パフォーマンスを向上させる飢餓の状態を経験するでしょう。
- ペトリ皿の蓋は、水（またはスクロース）を充填し、行動テスト後に破棄動物のための容器として使用することができます。
5。行動の記録を実行するためのプロトコル
5.1。アリーナのセットアップ：
- 1。新しい96ウェルディッシュのフタの裏側（welled側）に臭いの液滴を適用する。
重要：別の匂いと臭気濃度からの汚染を避けるために、新鮮な蓋がそれぞれの負荷のセットアップのために使用されている必要があります。悪臭源を含む蓋は、いずれも実験後にリサイクルされていません。使用される臭気の濃度範囲に応じて、匂いの勾配は、閉鎖系でのみ10〜20分間安定であることが判明している。勾配のセットアップおよび行動試験の実際の先頭との間の時間を最小限にすることが重要です。 - 蓋を逆さにして3％アガロース層で被覆された第二ふたの上にスタック。
重要：隣接するウェルに広がってから臭いの液滴を防ぐために慎重にふたを反転。 - アガロースの表面上に上部蓋の反転時には、臭気が幼虫を導入する前に、30秒間拡散させることができます。
5.2。ローディング幼虫：
- 幼虫の読み込みを可能にするためにちょうど足りるだけの匂いの液滴を含む上部蓋を持ち上げます。
- アガロースの層へのショ糖溶液から幼虫を移す。動物の開始位置は、使用されているアッセイによって異なります。
単一の臭気源アッセイのために、幼虫は、匂いの液滴の下でリリースされています。
複数の臭気源アッセイのために、幼虫をウェル＃E3と＃E4の間にリリースされています。
重要事項：オリエント一貫した方法で新しく導入された動物。我々東洋勾配の方向に私たちの動物、動物の体と頭が最高濃度に直面していることを確認。勾配のように方向の反対側に導入された動物が探索行動を開始する。我々の見解では、この最初の検索期間は、ノイズの不必要なソースを表します。ヘッドの向きを制御することは彼らの探索行動中に競技場の壁に連絡し、動物の数を減らすことができます。この練習では、動物の動きの方向を素数または著しくチャンス（すなわち偽陽性の香りのテストで）匂いのラインに沿ってchemotaxing無嗅覚の動物の数を増加させない。 - 上蓋を交換し、速やかに記録を開始します。
ノート：健康な幼虫は、アリーナでの導入直後にクロールを開始し、最初の10秒以内に1cmの距離をカバーするかもしれない。実験者が録音を開始する時に遅い場合、最初のデータポイントは失われます。このため、我々は、実験者はよく実験を実行する前に録音を開始するには、ソフトウェアコマンドと知り合いになることをお勧めします。 - 幼虫は、記録の期間（通常は3分）のために動作することができます。
注意：幼虫は、アリーナの壁に当たったり、ターゲット領域（例えば、グラデーションの検定のように）に達すると録音は3分間の終了前に終了されます。 - 録音の終了時に、速やかに蓋を持ち上げ、ピンセットや絵筆で幼虫を取り除く。水（またはスクロース）を含むペトリ皿の蓋に追跡された動物を置きます。
重要：録画動物は再利用されません。水皿は、単に実験の実行中に記録されたと非記録された動物を分離するのに便利な容器です。 - アリーナのセットアップの下に複数の動物を追跡する場合、速やかに次の幼虫をロードし、上記のように録音を開始します。
重要：同じアリーナのセットアップで実行した試験の数は、任意の行動実験2を実行する前に確認する必要がある勾配の安定性に基づいて決定されるべきである。 - 一度アリーナセットアップ追跡とアリーナから削除されている下でテストされるすべての幼虫は、上部蓋とアガロースの層を捨てる。中間蓋は、（アガロースの蓋すなわち）リサイクルすることができます。
注：私たちは、"背景差分"検出方法を選択するEthovisionのユーザーにアドバイス。
6。ビデオの記事で紹介するサンプル実験
6.1。酢酸イソアミルの1.0Mを持つ単一の臭気源アッセイ。
番号が割り当てられていたそのうちの各々に変異し、10の野生型（W1118）の幼虫 - 我々は盲目的にten Or83b - /をテストした。追跡実験ERは、それぞれの動物の遺伝子型に関する情報を受信しませんでした。非smellers、パスがすぐに臭気源の近傍を残した場合、蓄積が全体の試験のためのソースで観察した場合、smellers：各記録した後、予測表現型が試験された各動物に配属されました。 20匹の行動を記録した後、パスは表現型に基づいて分類した。このグループ分けの結果は、幼虫の実際の遺伝子型と比較した。行われたすべての割り当てが正しいことが分かった。
6.2。酢酸イソアミルの指数関数と線形グラデーションを持つ複数の臭気源アッセイ。
この実験では、線形と指数関数的勾配に沿ってchemotaxing野生型幼虫の性能を比較した。走化性行動は、0.5Mの同じ最高濃度の設定2つのグラデーションを記録した。として記事で説明したように、指数関数の勾配の悪臭源は0.015と0.5Mの範囲であった。線形グラデーションの源は、0.25と0.5M（一般的な違いが0.05Mと等差数列）の範囲であった。
濃度の局所差が一定と比較的小規模だったので、線形グラデーションでは、より挑戦的な走化性の環境を表現され、濃度範囲が狭い（0.25M）。対照的に、指数関数の勾配の濃度範囲は、トレイルに沿った濃度の地域差の増加とともに大きくなった。
十五幼虫は、2つの勾配のジオメトリと1つのグラフに重ね合わせたそれぞれのパスを記録した。二つのグラフの目視検査では、野生型の幼虫は、両方のジオメトリのための勾配を確実に上昇することができたことが蛇行の量は、線形グラデーションの条件のための大きいことを示しています。これは、グラデーションの長さに沿って信号の存在がより確実に線形いずれかのより指数関数的な形状のために検出されることを示唆している。
6.3。 "屋根"幾何学における酢酸イソアミルの勾配を持つ複数の臭気源アッセイ。
ここでは、臭気の勾配に導入された幼虫はかなり匂いのちょうど有無より臭気濃度の局所的な変化に敏感であることを確認してください。 0.06、0.12、0.25、0.5、0.25、0.12M：イソアミル勾配は、以下の濃度と臭気の液滴のアプリケーションによって設立されました。その後の勾配の形状は、0.5Mでピーク非対称"屋根"に似ていた。
幼虫は、0.06Mと0.12M臭液滴の間にリリースされました。我々の仮説は、幼虫が単に臭気の存在を計算された場合には濃度の最大値のための特定の好みなしで全体の勾配に従うというものでした。対照的に、場合幼虫は、0.5M液滴の下に蓄積するという濃度の局所的な変化に敏感です。十五幼虫が記録され、そしてそれは短い探索期間の後、すべての幼虫がよく、より高濃度の下に蓄積されたことがわかった。これは、臭気濃度の局所的な変化が計算され、ショウジョウバエの幼虫の走化性行動を通知していることを示唆している。
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Acknowledgments
我々は、T.フーバーと有用な議論のためのTP Sakmarに感謝しています。この作品は、米国国立衛生研究所からLBVとベルギー系アメリカ人の教育財団とMLへレヴソン財団への補助金によって支えられて
References
- Fishilevich, E., et al. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nature Neuroscience advance online publication. , (2007).
