ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Summary

במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.

Abstract

התגובות חוש הריח של הזחלים תסיסנית נחקרו באופן מסורתי בצלחות פטרי המהווים מקור יחיד ריח היקפי. בתוך פרדיגמה זו התנהגות, בדרך כלל הניסוי מניח כי דיפוזיה מהירה של מולקולות odorant ממקור מוביל ליצירת שיפוע יציב בצלחת. כדי ליצור התאמה כמותית בין תשומות חושי תגובות התנהגותיות, יש צורך להשיג אפיון מעמיק יותר של תנאי גירוי odorant. במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.

Protocol

1. ציוד ריאגנטים

ריח דילולים:

• שמן פרפין (Sigma, מספר CAS: 8012-95-1)
• ריחות של הזמין את הטוהר הגבוהה ביותר אשר מעורר משיכה הזחלים תסיסנית ^1. במאמר זה וידאו, בעלי חיים נבדקו עם אצטט isoamyl (Sigma, מספר CAS: 123-92-2).
• 1.5ml צלוחיות זכוכית עם מכסה טפלון (Agilent Technologies)
• סולם מדידה דיגיטלי עבור דילול מדויקת לפי משקל

Assay בזירה הגדרת:

• Agarose (Promega)
• מכסים היטב של 96-microplate (BD פלקון, מס 'קטלוגי: 353071). בזירה התנהגותיים שלנו מורכב משלושה מכסים בערימה.
• סינגל ערוצים 1-20 pipetter μl או Multi-channel pipetter לטעון אגל odorant (ים) לתוך המכסה העליון של הערימה. כדי להגדיר את assay מקור מרובים, אנו משתמשים 5-50 μl Pipet-Lite מרובת ערוצים pipetter מן שיורד גשם.

הכנת תסיסנית הזחלים לבדיקות התנהגותיים:

• 15% (w / w) פתרון סוכרוז
• רגיל צלחות פטרי (BD פלקון) לשטוף ולאחסן הזחלים
• צבע מברשת (4-5mm אורך זיפים) לתמרן ולהעביר הזחלים

הקלטה של ​​תנועה הזחל:

• סיכות קטן בעל ראש שטוח להעברת הזחלים לזירה
• מלקחיים או מכחול כדי להסיר את הזחלים לאחר הקלטה
• בשלב מואר עם מקור הומוגנית ללא חימום קל, "Edge Slim" Pad אור שיוצרו על ידי לוגן החשמל
• הקבינט להקיף את הזירה התנהגותי ושליטה בתנאי אור
• וידאו מערכת מעקב הקלטה של ​​תנועת בעלי חיים. אנחנו משתמשים בתוכנה Ethovision (Noldus, הולנד).
• מצלמת CCD ו grabber מסגרת כרטיס הווידאו (פיקולו EureCard היסוד) רכש עם Ethovision תוכנה
• מדחום ומצלמת לחות כדי לנטר את התנאים האטמוספריים במהלך בדיקות התנהגותיות (אופציונלי)
• Matlab (Mathworks) לניתוח נתונים מותאמים אישית (לא חובה)

2. ההתנהגות בזירה

הזירה התנהגות מורכבת משלושה מוערמים 96-היטב מכסים בצלחת. המכסה התחתון משמש כדי לבודד את שאר המערכת מהפנקס אור להפחית הסעה בזירה. המכסה השני, מכוסה 25ml של 3% agarose ג'ל, המשמש כבמה הזחלים ללכת. המכסה העליון מחזיק את טיפות ריח אשר נותרו תלויים על ידי מתח הפנים.

טיפות ריח הם pipetted ישירות לתוך הבארות של מכסה צלחת 96-היטב. מקורות ריח בודדות או מרובות ניתן להשתמש כדי ליצור מעברים הדרגתיים עם פרופילים שונים לאימות ^2. כדי לבדוק תתרנות פגמים chemotaxis של זחלים, אנו מציעים להשתמש לאחר שני מבחני.

2.1. ריח יחיד assay מקור: טיפה ריח יחיד הניח את הבאר # E7 (תקן 96, גם מערכת התייחסות צלחת).

• Stimulus: 10μl ריח מדולל בשמן פרפין
• תנאי ראשון: הזחל יחיד הוא הציג תחת מקור הריח (או בשכונה קרובה שלה).
• תצפיות יסוד: עבור גירויים אטרקטיביים (למשל אצטט isoamyl), הזחלים wildtype להצטבר מתחת למקור. בעלי חיים תתרן או חיות נתון פגמים הריח במהירות לנדוד הרחק אגל.
• משך במשפט: 3 דקות. תנועה של בעלי חיים מסוימת היא רשמה עד הזמן שחלף המשפט או ברגע המגעים החיה הקיר של הצלחת.
• מדדים אפשריים כימות התנהגות: אחוז הזמן המושקע על ידי חיה באזור מעגלי קטן שבמרכזו מקור הריח, כלומר המרחק אל מקור הריח, כמובן זמן של המרחק אל מקור הריח, וכו '

Assay זה ביעילות בדיקות תתרנות בסיסי הזחלים מוטציה. זה גם יכול לשמש כדי לקבוע באופן אמין את הסף לגילוי ריחות מסוימים ^2.

2.2. ריח מרובים מקור assay

כמה טיפות ריח מוטלות היטב את המכסה העליון. במאמר הנוכחי וידאו, הקמנו הדרגתיים לאורך שורה E. מרכזי הכולל של שש טיפות הוכנסו בארות # E2, E4 #, # E6, # E8, E10 ו - # # E12 (תקן 96, גם מערכת התייחסות צלחת ). לעומת זאת עם צלחת פטרי אחת מבחני מקור הריח, assay מרובים מקור הריח מאפשרת שליטה איכותית של הגיאומטריה שיפוע הוקמה לאורך ורוחב של הזירה. Assay זה שימש כדי לאפיין את המנגנונים התחושתיים המאפשר הזחלים תסיסנית כדי chemotax ^2.

• Stimulus: טיפות ריח 10μl מוטלות לסירוגין בארות לאורך השורה. הסדר זה מוביל ליצירת מפל במרכז השורה הנבחרת. כדי ליצור שיפוע אחיד לרוחב של הזירה, כמה שורות ניתן לטעון עם מקורות מרובים.
• תנאי ראשון: הזחל יחיד הוא הציג תחת מקור הריח בין בארות # # ו-E3E4.
• פנוטיפים יסוד: הזחלים תתרן לשוטט באקראי מנקודת ההתחלה. עבור גירויים אטרקטיביים (למשל אצטט isoamyl), בעלי חיים אשר מסוגלים להריח לנווט לאורך בכיוון של הגדלת ריכוז ריח. הדיוק שבה חיה עולה השביל ריח הוא בקורלציה עם יכולתה לחוש ולעבד את הגירוי odorant. השבילים המתפתלים נגרמות בדרך כלל עקב ליקויים חושיים. לאחר חיה הגיעה לנקודת הריכוז הגבוה ביותר במשפט, הוא נשאר בסביבה של עמדה זו.
• משך במשפט: 3 דקות לכל היותר (משכי זמן מעקב נוטים להציג רעש הזחלים מאבדים עניין, ובסופו של דבר לנטוש את שיפוע). עבור הדרגתיים מאויר במאמר זה וידאו, תנועה של זחל בודד נרשם עד שהחיה הגיעה לשכונת מקור הריכוז הגבוה ביותר (טוב # E12). ההקלטה הופסקה ברגע בעלי חיים הגיעו לאזור היעד או קשר כלשהו הקיר של הזירה.
• מדדים אפשריים כימות התנהגות: אחוז הזמן המושקע על ידי חיה מתחת לקו odorant (מלבן כחול); אומרת הכותרת ביחס לכיוון מקומית של צבע וריח; ציון chemotaxis בשילוב מדידת מגמה עולמית של חיה לעקוב odorant קו ^2.

3. פרופיל צבע אימות

לפני בדיקות זחלים ב שיפוע מסוים, חשוב לקבוע את יציבותו לאורך זמן. על בסיס זה, הנסיין יכול לקבוע את משך נאותה במשפט אחד ומספר הזחלים כי ניתן לעקוב ברצף בזירה אותו. כדי לבדוק את היציבות של השיפוע, פיתחנו שיטה המבוססת על ספקטרוסקופיית IR ^2. שיטה זו היא מעבר להיקף של פרוטוקול זה לא יהיה עיבוד נוסף.

4. פרוטוקול להכנת ניסוי

4.1. הכנת צלחת agarose ו דילולים ריח:

1. 1. יוצקים 25ml agarose של 3% על החלק העליון השטוח של מכסה צלחת 96-היטב; לאפשר agarose להתקרר להתמצק (~ 30 דקות).
   
   חשוב: ודא מכסים 96, גם הם על משטח שטוח לפני מזיגת agarose כנוכחות של מדרון על הקרושה agarose ג'ל עשוי להשפיע על ההתנהגות של הזחלים. כאשר מוזג את הג'ל, להסיר כל הבועות כי הטופס על פני השטח.
   
   
2. 2. מדולל ריחות לריכוזים הרצוי שמן פרפין באמצעות סולם דיגיטלית כדי למדוד במדויק את הכמויות של שמן פרפין וריח בדילול כל אחד.

הערות: כאשר ריכוזים נמוכים משמשים ריח, עדיף להכין סט של ריכוזי מקור המבוססת על דילולים סדרתי. התחל, למשל, עם פתרון 1.0m ולבצע דילול 01:02 כדי להשיג פתרון 0.5m. לפי הליך חוזר ונשנה, אחד מקבל סדרה דילול בעקבות 1.0m גיאומטרי, 0.5m, 0.25M, 0.12M, 0.06M, 0.03M, 0.015M.

חשוב: מאז ריחות אורגניים רבים מגיבים עם פלסטיק, דילולים ריח חייב להיות מאוחסן צלוחיות זכוכית עם טפלון כמוסות. באופן אידיאלי, ריחות יש להכין טרי לפני כל ניסוי כדי לצמצם תנודות ריכוז ריח בפועל על ניסויים. הדבר נכון במיוחד כאשר באמצעות כימיקלים נדיפים מאוד.

4.2. הזחלים הכנה:

1. 1. הכן פתרון סוכרוז 15% מים מזוקקים.
   
   הערות: פתרון סוכרוז 15% הוא צפוף יותר מאשר זחלים יגרום להם להיות צף אל פני השטח של הפתרון. עם זאת, שלא נמס מזון נתחי לעוף יש צפיפות גדולה יותר לפתרון במהירות לשקוע לקרקעית. כך, באמצעות פתרון זה סוכרוז מספק אמצעי יעיל של הפרדת הזחלים מהמזון. פתרון סוכרוז הוא מדיום מצוין עבור מזהמים ביולוגיים, אם הפתרון הופך עכור זה יכול להיות מעוקר מסנן כדי להסיר את הזיהום.
   
   
2. השג בקבוקון עם זחלים 6 ימים בת או זחלים בשלב ההתפתחותי הרצוי.
   
   הערות: כל הניסויים שלנו מתבצעות עם זחלים בן 6 ימים (באמצע השלב השלישי בהתפתחות instar); זחלים בשלב התפתחותי הם גדולים מספיק על מנת להקל על זיהוי עם תוכנת מעקב שלנו, אבל גם מאוד פעיל.
   
   
3. שופכים לתוך בקבוקון סוכרוז המזון המכילים את הזחלים.
4. בעזרת מרית, לשבור מעלה לפרק את המזון לעוף בעדינות כדי לשחרר את הזחלים. הזחלים פורסם יצוף למעלה אל פני השטח.
5. אפשר כמה דקות את נתחי מזון לטוס לשקוע בתחתית המכל, ואז, ויוצקים את סוכרוז הזחלים לתוך צלחת פטרי. אם הבחירה מראש של הזחלים הוא הכרחי, בעלי חיים יכול להיות שנאספו על ידי מזיגת סוכרוז דרך פילטר. הזחלים לאחר מכן ניתן להעביר מנה לבחירה עם מכחול.
6. השאירו את הזחלים במשך כ 30 דקות בשנות הucrose פתרון לפני שתמשיך בדיקות התנהגותיות כדי לאפשר החיות להרגיל לפתרון סוכרוז. כמו הזחלים אינם מופיעים כדי להאכיל על סוכרוז, החיות יחוו מצב של רעב, אשר משפר את הביצועים chemotaxis.
7. המכסה של צלחת פטרי יכול להיות מלא במים (או סוכרוז) ומשמש ככלי קיבול לבעלי חיים מושלך לאחר בדיקות התנהגותיות.

5. פרוטוקול לבצע הקלטות התנהגותית

5.1. הגדרת ארנה:

1. 1. החל טיפות ריח לחלק התחתון (צד הציפו) המכסה מאכל טרי 96-היטב.
   
   חשוב: כדי למנוע זיהום ריחות שונים ריכוזים ריח, מכסה טרי חייב לשמש לטעינת כל הגדרת. אף אחד העפעפיים המכיל מקורות ריח ממוחזרות לאחר הניסוי. בהתאם לטווח ריח ריכוז בשימוש, מילויים odorant נמצאו להיות יציב רק 10 עד 20 דקות במערכת סגורה. לכן חשוב לצמצם את הזמן בין שיפוע הגדרת ותחילת בפועל של מבחן התנהגותי.
   
   
2. הפוך את המכסה מעל ערימה זה מכסה שני מצופה בשכבת agarose 3%.
   
   חשוב: ללא מרחב את המכסה בזהירות כדי למנוע את התפשטות טיפות ריח לבארות הסמוכות.
   
   
3. עם היפוך של המכסה העליון על פני השטח agarose, לאפשר לריח לנטרל למשך 30 שניות לפני מציגה את הזחל.

5.2. טוען זחלים:

1. הרם את המכסה העליון המכיל את טיפות odorant מספיק כדי לאפשר טעינה של הזחל.
2. העברת הזחל מפתרון סוכרוז לשכבה agarose. עמדת המוצא של החיה תלויה assay בשימוש:
   
   עבור assay ריח מקור יחיד, הזחלים משתחררים תחת אגל odorant.
   
   עבור assay ריח מרובים מקור, הזחלים משתחררים בין בארות # # ו-E3 E4.
   
   חשוב: אוריינט החיות החדש הציג באופן עקבי. אנחנו מכוונים חיות שלנו לכיוון השיפוע, להבטיח כי הגוף החי בראש מול הריכוז הגבוה ביותר. בעלי חיים הציג מול אוריינטציה לזה של שיפוע ליזום התנהגות חיפוש. לדעתנו, זו תקופה החיפוש הראשוני מהווה מקור של רעש מיותר. שליטה על האוריינטציה הראש מפחית את מספר בעלי החיים אשר פנה קיר הזירה במהלך התנהגות גישוש שלהם. נוהג זה אינו הכיוון העיקרי של תנועה של החיה או להגדיל באופן משמעותי את מספר בעלי החיים תתרן chemotaxing לאורך קו odorant במקרה (כלומר חיוביות שגויות במבחנים ריח).
   
   
3. החלף את המכסה העליון להתחיל מיד את ההקלטה.
   
   הערות: זחלים בריאים מתחילים לזחול מיד עם הקדמה שלהם בזירה ועשוי לכסות מרחק של 1cm בתוך 10 השניות הראשונות. אם הניסוי הוא איטי על ייזום ההקלטה datapoints הראשונית יאבדו. מסיבה זו אנו ממליצים כי הניסוי נעשה מכירים היטב את הפקודות תוכנה ליזום הקלטה לפני שתנסה להפעיל ניסוי.
   
   
4. אפשר הזחל להתנהג למשך ההקלטה (בדרך כלל 3 דקות).
   
   הערות: הקלטות הן הסתיים לפני תום 3 דקות אם הזחל פוגע בקיר בזירה או מגיע לאזור היעד (כגון assay שיפוע).
   
5. בסיום ההקלטה, מיד להרים את המכסה והסר את הזחל עם מלקחיים או במכחול. מניחים את החיות במעקב המים מכסה צלחת פטרי המכילה (או סוכרוז).
   
   חשוב: חיות הוקלט לא לעשות בה שימוש חוזר. קערת המים הוא רק כלי קיבול נוח להפריד חיות מוקלטות בלתי נרשם תוך כדי ריצה את הניסויים.
   
6. אם מעקב אחר בעלי חיים מרובים תחת זירה הגדרת, מיד לטעון את הזחל הבאה ולהתחיל את ההקלטה כמתואר לעיל.
   
   חשוב: מספר ניסויים שבוצעו בזירה באותו הגדרת ייקבע על בסיס של יציבות הדרגתי אשר יש לוודא לפני ביצוע כל ניסוי התנהגותי ^2.
   
7. לאחר כל הזחלים להיבדק תחת בזירה הגדרת נספרו והוציאו מן הזירה, לבטל את המכסה העליון שכבת agarose. המכסה ביניים (כלומר מכסה agarose) יכולים להיות ממוחזרים.
   
   הערה: אנו ממליצים למשתמשים Ethovision לבחור שיטה לגילוי "הרקע חיסור".

6. לדוגמה הניסויים הדגימו במאמר וידאו

6.1. ריח יחיד מקור assay עם 1.0m של אצטט isoamyl.

אנו בעיוורון נבדק ten Or83b-/ - מוטנטים ועשרה סוג הזחלים בר (W1118) כדי שכל אחד מהם מספר הוטל. הניסוי מעקבאה לא קיבלו שום מידע על הגנוטיפ של כל חיה. לאחר הקלטת כל פנוטיפ חזוי הוצב כל חיה נבדק: smellers, אם הצטברות נצפתה תחת המקור למשפט כולו; הלא smellers, אם הנתיב במהירות עזבו את השכונה של מקור הריח. לאחר הקליטה את התנהגותם של 20 בעלי חיים, שבילים קובצו לפי הפנוטיפ. התוצאה של קיבוץ זה הושווה אז עם גנוטיפ בפועל של הזחלים: עשה את כל המטלות נמצאו נכונים.

6.2. ריח מרובים מקור assay עם מילויים מעריכי ו ליניארי של אצטט isoamyl.

בניסוי זה, השווינו את הביצועים של הזחלים סוג בר chemotaxing לאורך ליניארי שיפוע אקספוננציאלי. התנהגויות Chemotactic נרשמו שתי gradients להגדיר עם הריכוז הגבוה ביותר של אותו 0.5m. כפי שהוסבר במאמר, מקורות ריח של שיפוע אקספוננציאלי נע בין 0.015 ו 0.5m. מקורות שיפוע ליניארית נע בין 0.25 ו - 0.5m (התקדמות חשבון משותף עם הבדל 0.05M).

שיפוע ליניארית ייצג chemotaxis סביבה מאתגרת יותר כמו ההבדל המקומית הריכוז היה קבוע קטן יחסית, וטווח ריכוז צר (0.25M). לעומת זאת, את טווח הריכוז של שיפוע אקספוננציאלי היה גדול עם הגדלת הבדלים מקומיים ריכוז לאורך השביל.

חמש עשרה זחלים נרשמו עבור כל אחד משני הגיאומטריות שיפוע ואת הנתיבים על גבי בגרף אחד. בדיקה ויזואלית של שני הגרפים מראה, כי הזחלים סוג בר הצליחו לעלות באופן מהימן את צבע עבור הגיאומטריות הן אלא כי כמות המתפתל היה גדול יותר עבור למצב שיפוע ליניארית. הדבר מצביע על כך נוכח אותות לאורך שיפוע מזוהה בצורה מהימנה יותר עבור צורה מעריכית מאשר אחד ליניארי.

6.3. ריח מרובים מקור assay עם שיפוע אצטט isoamyl בתוך הגיאומטריה "גג".

כאן אנו לוודא כי הזחלים הציג שיפוע ריח הרגישים לשינויים מקומיים ריכוז ריח ולא רק נוכחות או העדר ריח. שיפוע isoamyl הוקמה על ידי יישום של טיפות ריח עם הריכוזים הבאים: 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 0.25, 0.12M. הגיאומטריה הדרגתי שהתפתח דמה "גג" סימטרית peaking ב 0.5m.

הזחלים שוחררו בין טיפות ריח 0.06M לבין 0.12M. ההשערה שלנו הייתה שאם הזחלים היו רק מחשוב נוכחות של ריח הם יתחקו שיפוע כולו ללא העדפה מסוימת לכל היותר הריכוז. לעומת זאת, אם הזחלים רגישים לשינויים מקומיים בריכוז הם היו להצטבר מתחת אגל 0.5m. חמש עשרה זחלים נרשמו, נמצא כי לאחר תקופה קצרה גישוש הזחלים כל שהצטבר מתחת לריכוז גבוה יותר טוב. הדבר מצביע על שינויים מקומיים בריכוז ריח מחושבים ולהודיע ​​התנהגות chemotactic של הזחלים תסיסנית.