De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Summary

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

Abstract

Respostas olfativas em larvas de Drosophila têm sido tradicionalmente estudado em placas de Petri compreendendo uma fonte de odor único periférico. Neste paradigma comportamental, o pesquisador geralmente assume que a rápida difusão de moléculas de odor da fonte leva à criação de um gradiente estável no prato. Estabelecer uma correlação quantitativa entre as entradas sensoriais e respostas comportamentais, é necessário para atingir uma caracterização mais aprofundada das condições de estímulo odorante. Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

Protocol

1. Equipamentos e reagentes

Diluições odor:

• Óleo de parafina (Sigma, número CAS: 8012-95-1)
• Odores dos disponíveis mais alta pureza, que provoca atração em Drosophila larvas ^1. Neste artigo de vídeo, os animais foram testados com acetato de isoamila (Sigma, número CAS: 123-92-2).
• Frascos de vidro de 1,5 ml com tampa de Teflon (Agilent Technologies)
• Escala de medição digital para diluição precisos em peso

Arena de ensaio de set-up:

• Agarose (Promega)
• Tampas de 96 poços de microplacas (BD Falcon, número de catálogo: 353071). Nossa arena comportamental consiste em três tampas empilhados.
• Single-channel pipeta 20/01 mL ou pipeta multi-canal para carregar gota odorant (s) na tampa superior da pilha. Para configurar o ensaio de múltiplas fontes, usamos 50-50 Pipete-Lite pipeta multi-canal de Rainin.

Preparação de Drosophila larvas para testes comportamentais:

• 15% (w / w) solução de sacarose
• Pratos regulares Petri (BD Falcon) para lavar e guardar as larvas
• Pincel (4-5mm de comprimento cerdas) para manipular e transferência de larvas

Gravação de movimento larval:

• Pequenos pinos com uma cabeça chata para a transferência de larvas na Arena
• Fórceps ou pincel para remover larvas após a gravação
• Palco iluminado com uma homogêneo não-aquecimento fonte de luz, "Slim Edge" Pad Luz fabricado pela Logan Elétrica
• Gabinete para cercar a área de comportamento e controle de condições de luz
• Sistema de vídeo monitoramento para a gravação de movimento animal. Estamos usando o software Ethovision (Noldus, Holanda).
• CCD da câmera e placa de vídeo de quadros grabber (Piccolo EureCard Basic) adquiridos com Ethovision software
• Termômetro e gravador de umidade para monitorar as condições atmosféricas durante os testes comportamentais (opcional)
• Matlab (The Mathworks) para análise de dados personalizado (opcional)

2. Área comportamental

A arena comportamental consiste em três empilhadas tampas de 96 poços prato. A tampa inferior é usado para isolar o resto do sistema a partir do bloco de luz e reduzir a convecção na arena. A tampa segunda, coberto com 25ml de 3% agarose gel, serve como um palco para as larvas a caminhar. A tampa superior tem o odor de gotículas que permanecem em suspensão pela tensão superficial.

Gotículas de odor são pipetados diretamente nas cavidades da tampa prato de 96 poços. Um odor fontes únicas ou múltiplas pode ser usado para gerar gradientes com distintos, perfis verificáveis ^​​2. Para testar a anosmia e defeitos de quimiotaxia em larvas, propomos usar o seguinte dois ensaios.

2.1. Ensaio única fonte odor: uma gota de odor único bem colocado no # E7 (padrão de 96 poços sistema de referência da placa).

• Estímulo: 10μl de odor diluído em óleo de parafina
• Condições iniciais: a larva único é introduzido sob a fonte de odor (ou na sua vizinhança próxima).
• Observações básicas: Para estímulos atraentes (por exemplo, acetato de isoamila), larvas de tipo selvagem acumular debaixo da fonte. Anósmico animais ou animais sujeitas a defeitos olfativa rapidamente se afaste da gota.
• Duração de um julgamento: 3 min. O movimento de um determinado animal é registrado até o tempo de julgamento tem decorrido ou assim que os contatos de animais na parede da placa.
• Métricas possíveis para a quantificação comportamental: porcentagem de tempo gasto por um animal em uma pequena zona circular centrada na fonte de odor, média distância para a fonte de odor; curso de tempo da distância à fonte de odor, etc

Este ensaio eficiente testes para anosmia básica em larvas mutantes. Também pode ser usado para fiavelmente determinar o limiar de detecção de odores particulares ^2.

2.2. Ensaio de múltiplas fontes de odor

Gotículas odor várias são colocados no poço da tampa superior. No artigo de vídeo presentes, montamos gradientes ao longo da linha central E. Um total de seis gotas foram introduzidos nos poços # E2, E4 #, # E6, E8 #, # E10 e E12 # (padrão de 96 poços sistema de referência da placa ). Em contraste com a placa de Petri e ensaios única fonte de odor, o teste de múltiplas fontes odor permite o controle qualitativo da geometria gradiente estabelecidas ao longo do comprimento e largura da arena. Este ensaio foi usado para caracterizar os mecanismos sensoriais permitindo que as larvas de Drosophila chemotax ^2.

• Estímulo: gotículas odor 10μl são colocados em poços alternados ao longo de uma linha. Este arranjo leva à criação de um gradiente centrado linha selecionada. Para estabelecer um gradiente homogênea ao longo da largura da arena, várias linhas podem ser carregados com várias fontes.
• Condições iniciais: a larva único é introduzido sob a fonte de odor entre os poços # E3 e #E4.
• Fenótipos básicos: larvas anósmico vagar a esmo sob o ponto de partida. Para estímulos atraentes (por exemplo, acetato de isoamila), animais que são capazes de cheirar navegar ao longo da direção da concentração de odor crescente. A precisão com que um animal sobe a trilha de odor está correlacionada com a sua capacidade de perceber e processar os estímulos olfativos. Caminhos tortuosos são muitas vezes causados ​​por defeitos sensoriais. Uma vez que um animal alcançou o ponto de maior concentração no julgamento, ele permanece nas proximidades desta posição.
• Duração de um julgamento: máximo de 3 min (períodos mais longos de acompanhamento tendem a introduzir ruído como larvas perdem o interesse e, eventualmente, abandonar o gradiente). Para os gradientes ilustrado neste artigo de vídeo, o movimento de um indivíduo larva foi registrada até que o animal atingiu o bairro da fonte de maior concentração (bem # E12). A gravação foi interrompida assim que o animal chegou à área-alvo ou contactado qualquer parede da arena.
• Métricas possíveis para a quantificação comportamental: porcentagem de tempo gasto por um animal abaixo da linha de odores (retângulo azul); significa título com relação à direção local do gradiente de odor; uma pontuação combinada de quimiotaxia medir a tendência mundial de um animal para seguir o odorant linha ^2.

3. Verificação do perfil do gradiente

Antes de testar as larvas em um gradiente particular, é importante para determinar a sua estabilidade ao longo do tempo. Nesta base, o pesquisador pode determinar uma duração adequada para cada ensaio eo número de larvas que podem ser rastreados em seqüência na mesma arena. Para testar a estabilidade do gradiente, temos desenvolvido um método baseado na espectroscopia de IR ^2. Este método está além do escopo deste protocolo e não será mais elaborada.

4. Protocolo para a preparação de um experimento

4.1. Preparação de agarose placa e diluições odor:

1. 1. Despeje 25ml de agarose 3% para o plano superior de uma tampa prato de 96 poços; permitir que a agarose para esfriar e solidificar (~ 30 min).
   
   Importante: Certifique-se que as tampas de 96 poços estão em uma superfície plana antes de derramar a agarose como a presença de uma encosta sobre o solidificou agarose gel pode afetar o comportamento das larvas. Ao derramar o gel, retire as bolhas que se formam na superfície.
   
   
2. 2. Diluir odores para concentrações desejadas em óleo de parafina utilizando uma balança digital para medir com precisão as quantidades de óleo de parafina e odor em cada diluição.

Notas: Quando as concentrações de baixo odor são usadas, é preferível preparar um conjunto de concentrações fonte baseado em diluições seriadas. Comece, por exemplo, com uma solução 1,0 M e realizar uma diluição de 1:02 para obter uma solução 0.5M. Ao proceder recorrentemente, obtém-se uma série de diluições após a 1.0M progressão geométrica, 0.5M, 0,25 m, 0.12M, 0,06 m, 0.03m, 0.015M.

Importante: Uma vez que muitos odores orgânicos reagem com plástico, diluições odor deve ser armazenada em frascos de vidro com Teflon caps. Idealmente, os odores deve ser preparada antes de cada experimento para reduzir as flutuações na concentração de odor reais em experimentos. Isto é especialmente verdadeiro quando se utiliza produtos químicos altamente voláteis.

4.2. Preparação de larvas:

1. 1. Prepare a solução de sacarose 15% em água destilada.
   
   Notas: A solução de sacarose 15% é mais denso do que as larvas e fará com que eles sejam impulsionadas para a superfície da solução. No entanto, pedaços de alimentos não dissolvido voam têm uma densidade maior do que a solução e rapidamente vão para o fundo. Assim, usando esta solução de sacarose fornece um meio eficiente de separar as larvas dos alimentos. Solução de sacarose é um excelente meio de contaminantes biológicos, se a solução ficar turva que pode ser esterilizado por filtração para remover a contaminação.
   
   
2. Obter um frasco com 6 dias de idade larvas ou larvas no estágio de desenvolvimento desejado.
   
   Notas: Todas as nossas experiências sejam realizadas com 6 dias de larvas de idade (metade do terceiro estágio de desenvolvimento instar); larvas nesta fase de desenvolvimento são grandes o suficiente para facilitar a detecção com o nosso software de rastreamento, mas também altamente ativos.
   
   
3. Despeje a sacarose para dentro do frasco de alimentos contendo as larvas.
4. Usando uma espátula, quebrar e dissolver os alimentos voar suavemente para liberar as larvas. Larvas liberado vai flutuar até a superfície.
5. Aguarde alguns minutos para os blocos de alimentos voar para desviar para o fundo do frasco, então, despeje a sacarose e larvas em uma placa de Petri. Se a pré-selecção das larvas é necessário, os animais podem ser recolhidos por derramar o de sacarose através de um filtro. Larvas podem então ser transferidos para um prato de seleção com um pincel.
6. Deixe as larvas por aproximadamente 30 minutos na ssolução ucrose antes de prosseguir com testes comportamentais para permitir que os animais se habituam à solução de sacarose. Como larvas não aparecem para se alimentar de sacarose, os animais vão experimentar um estado de fome, que melhora o desempenho quimiotaxia.
7. A tampa da placa de Petri pode ser preenchido com água (ou sacarose) e usado como um receptáculo para animais descartados após testes comportamentais.

5. Protocolo para realizar gravações de comportamento

5.1. Set-up Arena:

1. 1. Aplique gotas de odor para o lado de baixo (lado brotou) de uma tampa prato fresco de 96 poços.
   
   Importante: Para evitar a contaminação de odores e concentrações diferentes odor, uma tampa fresca deve ser usada para cada carregamento de set-up. Nenhuma das tampas contendo fontes de odor são reciclados após o experimento. Dependendo da faixa de concentração utilizada odor, gradientes odorant foram encontrados para ser estável somente por 10 a 20 minutos em um sistema fechado. Portanto, é importante para minimizar o tempo entre gradiente set-up eo início real do teste comportamental.
   
   
2. Inverter a tampa e empilhá-la acima de uma tampa segunda revestido com a camada de agarose 3%.
   
   Importante: Inverter a tampa com cuidado para evitar gotículas odor se espalhe para poços adjacentes.
   
   
3. Após a inversão da pálpebra superior na superfície agarose, permitem que o odor se difundir por 30 segundos antes de introduzir a larva.

5.2. Larvas de carregamento:

1. Levante a tampa superior contendo as gotas odorant apenas o suficiente para permitir o carregamento da larva.
2. Transferência de uma larva da solução de sacarose para a camada de agarose. A posição inicial do animal depende do ensaio a ser utilizado:
   
   Para o ensaio único odor fonte, as larvas são liberadas sob a gota de odores.
   
   Para o ensaio múltiplas odor fonte, as larvas são liberadas entre os poços # # E3 e E4.
   
   Importante: Orient os animais recém-introduzidos de forma consistente. Orientamos nossos animais na direção do gradiente, garantindo que o corpo do animal e cabeça, rosto a maior concentração. Animais introduzidos em um oposto orientação para que o gradiente de iniciar um comportamento de procura. Em nossa opinião, este período inicial de pesquisa representa uma fonte desnecessária de ruído. Controlar a orientação da cabeça reduz o número de animais que em contato com o muro arena durante o seu comportamento exploratório. Esta prática não a direção principal do movimento do animal ou aumentar significativamente o número de animais anósmico chemotaxing ao longo da linha odorant por acaso (ou seja, resultados falso-positivos em testes de cheiro).
   
   
3. Recoloque a tampa superior e iniciar a gravação prontamente.
   
   Notas: larvas saudáveis ​​iniciar o rastreamento imediatamente após a sua introdução na arena e pode cobrir uma distância de um centímetro nos primeiros 10 segundos. Se o experimentador é lento em iniciar a gravação, datapoints inicial será perdido. Por este motivo, recomendamos que o pesquisador se torna bem familiarizado com os comandos de software para iniciar a gravação antes de tentar executar um experimento.
   
   
4. Permitir que a larva se comportar durante o tempo da gravação (normalmente 3 minutos).
   
   Notas: As gravações são terminadas antes do final do 3 min se a larva atinge a parede arena ou atinge uma área-alvo (como no ensaio de gradiente).
   
5. No final da gravação, prontamente levantar a tampa e retire a larva com uma pinça ou um pincel. Colocar os animais rastreados na água tampa placa de Petri contendo (ou sacarose).
   
   Importante: Gravado animais não são reutilizados. O prato de água é apenas um receptáculo conveniente separar animais registrados e não-registradas durante a execução dos experimentos.
   
6. Se o controle de vários animais sob uma arena set-up, prontamente carregar a larva seguinte e iniciar a gravação como mostrado acima.
   
   Importante: O número de ensaios realizados na mesma arena set-up deve ser decidida com base na estabilidade gradiente que deve ser verificado antes de realizar qualquer experimento comportamental ^2.
   
7. Uma vez que todas as larvas a serem testadas sob a arena set-up foram rastreados e retirado da arena, descarte a tampa superior e camada de agarose. A tampa intermediária (isto é, a tampa agarose) podem ser reciclados.
   
   Nota: Aconselhamos os usuários Ethovision para escolher o método de "subtração de fundo" de detecção.

6. Experimentos de exemplo demonstrado no artigo de vídeo

6.1. Ensaio única fonte de odor com 1.0M de acetato de isoamila.

Nós cegamente testaram dez Or83b-/ - mutantes e dez do tipo selvagem (W1118) larvas para cada um dos quais um número tinha sido atribuído. O experimento de rastreamentoer não recebeu qualquer informação sobre o genótipo de cada animal. Depois de cada gravação, um fenótipo preditivo foi atribuído a cada animal testado: smellers, se foi observada acumulação sob a fonte de todo o julgamento, não smellers, se o caminho rapidamente deixou o bairro da fonte de odor. Depois de ter registrado o comportamento de 20 animais, os caminhos foram agrupados de acordo com o fenótipo. O resultado deste agrupamento foi então comparada com o genótipo real das larvas: todas as atribuições feitas foram encontrados para ser correto.

6.2. Ensaio de múltiplas fontes de odor com gradientes exponencial e linear de acetato de isoamila.

Neste experimento, foram comparados os desempenhos de larvas do tipo selvagem chemotaxing ao longo de um gradiente linear e uma exponencial. Comportamentos quimiotáticos foram registrados por dois gradientes configurado com a maior concentração de 0,5 M mesmo. Como explicado no artigo, as fontes de odor do gradiente exponencial variou entre 0,015 e 0.5M. As fontes do gradiente linear variaram entre 0,25 e 0,5 M (progressão aritmética com a diferença comum 0,05 M).

O gradiente linear representado um ambiente mais desafiador quimiotaxia como a diferença na concentração de locais era constante e relativamente pequena, ea faixa de concentração estreito (0,25 m). Em contraste, a faixa de concentração do gradiente exponencial foi maior com o aumento diferenças locais de concentração ao longo da trilha.

Quinze larvas foram registrados para cada uma das duas geometrias gradiente e os caminhos sobrepostos em um gráfico. A inspeção visual dos dois gráficos mostra que larvas do tipo selvagem foram capazes de subir de forma confiável o gradiente para ambas as geometrias, mas que a quantidade de meandros foi maior para a condição de gradiente linear. Isto sugere que o sinal presente ao longo da extensão de gradiente é mais confiável para detectar uma forma exponencial do que para uma linear.

6.3. Ensaio de múltiplas fontes de odor com gradiente de acetato de isoamila em um "teto" de geometria.

Aqui verificamos que as larvas introduzido em um gradiente de odor são sensíveis às mudanças locais da concentração de odor, em vez de apenas a presença ou ausência de odor. Um gradiente isoamílico foi estabelecido pela aplicação de gotas de odor com as seguintes concentrações: 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 0,25, 0.12M. A geometria gradiente que se seguiu parecia um "teto" assimétrica atingindo um máximo de 0.5M.

As larvas foram lançados entre as gotas de odor 0,06 m e 0.12M. Nossa hipótese era que, se as larvas eram meramente de computação a presença de odor que se seguiria o gradiente inteiro sem uma preferência especial para o máximo de concentração. Em contraste, as larvas se são sensíveis às mudanças locais da concentração que se acumularia sob a gota de 0.5M. Quinze larvas foram registradas, e verificou-se que, após um curto período exploratório todas as larvas acumuladas por baixo da maior concentração também. Isto sugere que as mudanças locais da concentração de odor são computados e informar o comportamento de larvas de Drosophila quimiotáticos.