De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Summary

En este artículo de vídeo, se describe un nuevo método que permite la construcción de los gradientes de olor con geometrías estable y controlable. Nos muestra brevemente cómo estos gradientes se pueden utilizar para la detección de defectos olfativos (anosmia total y parcial) y el estudio de las características más sutiles de comportamiento quimiotaxis.

Abstract

Respuestas olfativas en las larvas de Drosophila han sido tradicionalmente estudiadas en placas de Petri que comprende una sola fuente de olor periféricos. En este paradigma de conducta, el experimentador lo general se asume que la rápida difusión de las moléculas odoríferas de la fuente lleva a la creación de un gradiente estable en el plato. Para establecer una correlación cuantitativa entre los estímulos sensoriales y las respuestas de comportamiento, es necesario lograr una caracterización más detallada de las condiciones de olor estímulo. En este artículo de vídeo, se describe un nuevo método que permite la construcción de los gradientes de olor con geometrías estable y controlable. Nos muestra brevemente cómo estos gradientes se pueden utilizar para la detección de defectos olfativos (anosmia total y parcial) y el estudio de las características más sutiles de comportamiento quimiotaxis.

Protocol

1. Equipos y Reactivos

Diluciones olor:

• Aceite de parafina (Sigma, número CAS: 8012-95-1)
• Los olores de la más alta pureza disponible que provoca atracción en las larvas de Drosophila ^1. En este artículo de vídeo, los animales se pusieron a prueba con acetato de isoamilo (Sigma, número CAS: 123-92-2).
• 1,5 ml viales de vidrio con tapa de teflón (Agilent Technologies)
• Balanza digital de medición precisos para la dilución en peso

Ensayo de campo de configuración:

• Agarosa (Promega)
• Tapas de microplacas de 96 pozos (BD Falcon, número de catálogo: 353071). Nuestro campo de la conducta consta de tres tapas apilados.
• De un solo canal de 20.1 l pipeteador o multi-canal de pipeta de cargar las gotas de olor (s) en la tapa superior de la pila. Para configurar el análisis de múltiples fuentes, utilizamos 50-50 l Pipet-Lite de varios canales de pipeta de Rainin.

Preparación de las larvas de Drosophila para pruebas de comportamiento:

• 15% (w / w) una solución de sacarosa
• Regular placas de Petri (BD Falcon) para lavar y almacenar las larvas
• Brochas de pintor (4-5mm de longitud de las cerdas) para manipular y transferir las larvas

La grabación del movimiento de larvas:

• Pequeños alfileres con cabeza plana para la transferencia de las larvas en estadio
• Fórceps o un pincel para eliminar las larvas después de la grabación
• Escenario iluminado con un grupo homogéneo no se caliente la fuente de luz, "Edge Slim" Light Pad fabricado por Logan Electric
• Gabinete para rodear el área del comportamiento y control de las condiciones de luz
• Sistema de seguimiento de vídeo para la grabación de movimiento de animales. Estamos utilizando el software Ethovision (Noldus, Países Bajos).
• CCD de la cámara y de adquisición de imágenes tarjeta de video (Piccolo EureCard básica) adquiridos con Ethovision software
• Termómetro y registrador de humedad para controlar las condiciones atmosféricas durante las pruebas de comportamiento (opcional)
• Matlab (The Mathworks) para el análisis de datos personalizadas (opcional)

2. Ámbito del comportamiento

El escenario de comportamiento se compone de tres tapas de los recipientes apilados de 96 pozos. La tapa inferior se utiliza para aislar el resto del sistema de la plataforma de la luz y reducir la convección en la arena. La segunda tapa, cubierta con 25 ml de un 3% en gel de agarosa, sirve de escenario para las larvas para caminar. La tapa superior tiene el olor que las gotas permanecen suspendidas por la tensión superficial.

Gotas de olor son una pipeta directamente en los pocillos de la tapa del plato de 96 pozos. A las fuentes de olor único o múltiple puede ser utilizado para generar gradientes con distintos perfiles, verificable ^2. Para probar la anosmia y los defectos de la quimiotaxis de las larvas, se propone utilizar los siguientes dos ensayos.

2.1. Olor único ensayo de la fuente: una gota de olor único establecido en el pozo # E7 (estándar de 96 y sistema de referencia de la placa).

• Estímulo: 10μl de olor diluido en aceite de parafina
• Las condiciones iniciales: una sola larva se introduce en la fuente de olor (o en su vecindad cercana).
• Observaciones básicas: Para los estímulos atractivos (por ejemplo, acetato de isoamilo), las larvas de tipo salvaje se acumulan debajo de la fuente. Anosmic animales o animales sometidos a los defectos olfativos rápidamente alejarse de la gota.
• Duración de un ensayo: 3 min. El movimiento de un animal dado se registra hasta el momento el juicio ha transcurrido o tan pronto como los contactos entre animales de la pared de la placa.
• Posibles métricas para la cuantificación del comportamiento: el porcentaje de tiempo dedicado por un animal en una pequeña zona circular centrado en la fuente de olor, con una media distancia a la fuente de olor, por supuesto el tiempo de la distancia a la fuente de olor, etc

Este ensayo de manera eficiente las pruebas para la anosmia básicos en las larvas mutantes. También se puede utilizar para determinar con fiabilidad el umbral de detección de olores particulares ^2.

2.2. Olor a múltiples fuentes de ensayo

Varias gotas de olor se establecen en el pozo de la tapa superior. En el artículo de vídeo actual, hemos creado a lo largo de gradientes de la fila central de E. Un total de seis gotas se introdujeron en los pozos # E2, E4 #, # E6, E8 #, # E10 y E12 # (estándar de 96 y sistema de referencia de la placa ). En contraste con la placa de Petri y los ensayos de una sola fuente de olor, el olor del ensayo de múltiples fuentes permite el control cualitativo de la geometría de la pendiente establecida a lo largo y ancho de la arena. Este ensayo se utilizó para caracterizar los mecanismos sensoriales que permite a las larvas de Drosophila chemotax ^2.

• Estímulo: las gotas de 10μl olor se establecen en la alternancia de los pozos a lo largo de una fila. Este acuerdo da lugar a la creación de un gradiente centrada fila seleccionada. Para establecer un gradiente homogéneo a lo largo del ancho de la arena, varias filas se pueden cargar con múltiples fuentes.
• Las condiciones iniciales: una sola larva se introduce en la fuente de olor entre los pozos # y # E3E4.
• Fenotipos básicos: las larvas anosmic vagan al azar desde el punto de partida. Para los estímulos atractivos (por ejemplo, acetato de isoamilo), los animales que son capaces de oler navegar a lo largo de la dirección de la concentración de olor en aumento. La precisión con que un animal asciende por la pista de olor se correlaciona con su capacidad de detectar y procesar los estímulos olfativos. Tortuosos caminos a menudo son causados ​​por defectos sensoriales. Una vez que un animal ha alcanzado el punto de mayor concentración en el juicio, permanece en las cercanías de esta posición.
• Duración de un juicio: un máximo de 3 minutos (la duración más larga de seguimiento tienden a introducir ruido en forma de larvas pierden el interés y, finalmente, abandonar el gradiente). De los gradientes se ilustra en este artículo de vídeo, el movimiento de un individuo se registró larva hasta que el animal llegó a la vecindad de la fuente de mayor concentración (y # E12). La grabación se detiene tan pronto como el animal llegó a la zona de destino o en contacto con cualquier pared de la arena.
• Posibles métricas para la cuantificación del comportamiento: el porcentaje de tiempo que un animal en la línea de olor (rectángulo azul), con una media partida con respecto a la dirección local del gradiente de olor, un puntaje combinado quimiotaxis la medición de la tendencia global de un animal para seguir el olor la línea ^2.

3. Gradiente de verificación de perfil

Antes de la prueba en un gradiente de larvas en particular, es importante para determinar su estabilidad en el tiempo. Sobre esta base, el experimentador puede determinar una duración adecuada para cada ensayo y el número de larvas que se puede controlar de forma secuencial en el mismo escenario. Para probar la estabilidad de la pendiente, hemos desarrollado un método basado en la espectroscopia IR ^2. Este método está fuera del alcance de este protocolo y no se desarrollarán.

4. Protocolo para la preparación de un experimento

4.1. Preparación de la placa de agarosa y diluciones olor:

1. 1. Verter 25 ml de agarosa al 3% en la parte superior plana de una tapa de plato de 96 pozos, permitir que la agarosa se enfríe y solidifique (~ 30 min).
   
   Importante: Asegúrese de que las tapas de 96 pozos se encuentran en una superficie plana antes de verter la agarosa como la presencia de una pendiente en el gel de agarosa solidificada puede afectar al comportamiento de las larvas. Al verter el gel, eliminar las burbujas que se forman en la superficie.
   
   
2. 2. Diluir los olores de las concentraciones deseadas en aceite de parafina con una balanza digital para medir con precisión las cantidades de aceite de parafina y el olor de cada dilución.

Notas: Cuando las concentraciones de bajo olor se utilizan, es preferible preparar una serie de concentraciones de fuente basado en diluciones seriadas. Inicio, por ejemplo, con una solución 1,0 M y realizar una dilución 1:02 para obtener una solución 0.5M. Al proceder de forma recurrente, se obtiene una serie de dilución de 1,0 M después de la progresión geométrica, 0.5M, 0.25M, 0.12M, 0.06M, 0,03 M, 0,015 M.

Importante: Debido a que muchos olores orgánicos reaccionan con el plástico, las diluciones olor debe ser almacenado en frascos de vidrio con tapas de teflón. Idealmente, los olores deben estar preparados frescos antes de cada experimento para reducir las fluctuaciones en la concentración de olor a través de experimentos reales. Esto es especialmente cierto cuando se utilizan productos químicos muy volátiles.

4.2. Las larvas de preparación:

1. 1. Prepare una solución de sacarosa al 15% en agua destilada.
   
   Notas: Una solución de sacarosa al 15% es más denso que las larvas y hará que debe ser un estímulo a la superficie de la solución. Sin embargo, sin disolver trozos de alimentos mosca tiene una densidad superior a la solución rápida y hundirse hasta el fondo. Así, utilizando esta solución de sacarosa es un medio eficaz de separar las larvas de los alimentos. Solución de sacarosa es un medio excelente para los contaminantes biológicos, si la solución se vuelve turbia puede ser esterilizado por filtración para eliminar la contaminación.
   
   
2. Obtener un vial con 6 días de edad, larvas o larvas en la etapa de desarrollo deseado.
   
   Notas: Todos los experimentos se llevan a cabo con larvas de edad de 6 días (mediados del tercer estadio etapa de desarrollo), las larvas en esta etapa del desarrollo son lo suficientemente grandes para facilitar la detección con nuestro software de seguimiento, pero también muy activos.
   
   
3. Vierta la sacarosa en el vial de los alimentos que contienen las larvas.
4. Usando una espátula, romper y disolver los alimentos volar suavemente para liberar las larvas. Larvas liberadas flotará hasta la superficie.
5. Deje pasar unos minutos para los bloques de alimentos volar a hundirse hasta el fondo del frasco, luego, vierta la sacarosa y la larva se convierte en una placa de Petri. Si la pre-selección de las larvas es necesario, los animales pueden ser recogidos mediante el vertido de la sacarosa por un filtro. Las larvas se pueden transferir a un plato para la selección con un pincel.
6. Deja que las larvas durante aproximadamente 30 minutos en el sucrose solución antes de proceder con las pruebas de comportamiento para permitir que los animales se habitúan a la solución de sacarosa. Como las larvas no parece que se alimentan de sacarosa, los animales experimentan un estado de inanición, que mejora el rendimiento de la quimiotaxis.
7. La tapa de la placa de Petri se puede llenar con agua (o sacarosa) y se utiliza como un receptáculo para los animales desechados después de las pruebas de comportamiento.

5. Protocolo para realizar grabaciones de comportamiento

5.1. Puesta en marcha Arena:

1. 1. Aplique las gotas de olor en la parte inferior (lado llenaron) de una tapa de plato fresco de 96 pozos.
   
   Importante: Para evitar la contaminación de olores diferentes y las concentraciones de olor, una tapa de dulce se deben utilizar para cada carga de puesta a punto. Ninguna de las tapas que contengan fuentes de olor son reciclados después del experimento. Dependiendo del rango de concentración de olor utilizados, los gradientes de olor se han encontrado para ser estable sólo durante 10 a 20 minutos en un sistema cerrado. Por tanto, es importante reducir al mínimo el tiempo entre la gradiente de set-up y el comienzo real de la prueba de comportamiento.
   
   
2. Invertir la tapa y la pila por encima de una segunda tapa recubierta con la capa de agarosa al 3%.
   
   Importante: Invertir la tapa con cuidado para evitar que las gotas de olor se extienda a los pozos adyacentes.
   
   
3. Tras la inversión de la tapa superior de la superficie de agarosa, permita que el olor a difundir durante 30 segundos antes de introducir la larva.

5.2. Las larvas de carga:

1. Levante la tapa superior que contiene las gotas de olor sólo lo suficiente para permitir la carga de la larva.
2. Transferencia de una larva de la solución de sacarosa a la capa de agarosa. La posición inicial del animal depende de la prueba que se utiliza:
   
   Para la prueba de olor sola fuente, las larvas se liberan en la gota de olor.
   
   Para la prueba de olor de múltiples fuentes, las larvas se liberan entre los pozos # # E3 y E4.
   
   Importante: Orientar a los animales de reciente introducción de una manera consistente. Nos orientamos a nuestros animales en la dirección del gradiente, asegurando que el cuerpo del animal y la cabeza frente a la mayor concentración. Los animales introducidos en una orientación opuesta a la del gradiente de iniciar un comportamiento de búsqueda. En nuestra opinión, este período de búsqueda inicial representa una fuente innecesaria de ruido. El control de la orientación de la cabeza reduce el número de animales que en contacto con la pared de arena en su comportamiento exploratorio. Esta práctica no se ceba la dirección del movimiento de los animales o aumentar significativamente el número de animales anosmic chemotaxing a lo largo de la línea de olor al azar (es decir, falsos positivos en las pruebas de olor).
   
   
3. Vuelva a colocar la tapa superior y comenzar a grabar inmediatamente.
   
   Notas: las larvas sanas iniciar el rastreo inmediatamente después de su introducción en la arena y puede cubrir una distancia de 1 cm en los primeros 10 segundos. Si el experimentador es lento en iniciar la grabación, puntos de datos inicial se perderán. Por esta razón se recomienda que el investigador se convierte en bien familiarizado con los comandos de software para iniciar la grabación antes de intentar realizar un experimento.
   
   
4. Deje que la larva que se comporten de la duración de la grabación (normalmente de 3 minutos).
   
   Notas: Las grabaciones se termina antes de la final de la 3 minutos si la larva llega a la pared de arena o llega a un área de destino (como en el ensayo de gradiente).
   
5. Al final de la grabación, inmediatamente levantar la tapa y retire la larva con una pinza o un pincel. Coloque el seguimiento de los animales en el agua tapa placa de Petri que contiene (o sacarosa).
   
   Importante: Los grabados no se reutilizan. El plato del agua no es más que un receptáculo conveniente separar a los animales registrados y grabados de la ONU, durante la ejecución de los experimentos.
   
6. Si el seguimiento de varios animales en un campo de puesta en marcha, sin demora la carga de la larva al lado y empezar a grabar como se muestra arriba.
   
   Importante: El número de ensayos realizados en el mismo escenario de configuración debe decidirse sobre la base de la estabilidad pendiente que debe ser verificada antes de realizar cualquier experimento conductual ^2.
   
7. Una vez que todas las larvas que se prueba en el ámbito de configuración han sido rastreados y eliminados de la arena, deseche la tapa superior y la capa de agarosa. La tapa intermedia (es decir, la tapa de agarosa) pueden ser reciclados.
   
   Nota: Se recomienda a los usuarios Ethovision para elegir el método de "sustracción de fondo" de detección.

6. Experimentos de ejemplo que se muestra en el artículo de vídeo

6.1. Olor único ensayo de la fuente con 1,0 M de acetato de isoamilo.

Ciegamente a prueba diez Or83b-/ - mutantes y diez de tipo salvaje (W1118) larvas de cada una de ellas un número se le había asignado. El experimento de seguimientoer no ha recibido ninguna información sobre el genotipo de cada animal. Después de cada grabación, un fenotipo de predicción se asignó a cada animal en prueba: smellers, si se observó acumulación en la fuente de todo el juicio, no smellers, si el camino rápidamente hacia la izquierda el barrio de la fuente de olor. Después de haber grabado el comportamiento de los 20 animales, los caminos fueron agrupados de acuerdo con el fenotipo. El resultado de este grupo fue comparado con el genotipo real de las larvas: todos los trabajos realizados se encontró que ser correcto.

6.2. Olor a múltiples análisis de código fuente con gradientes exponencial y lineal de acetato de isoamilo.

En este experimento, se comparó el rendimiento de las larvas de tipo salvaje chemotaxing a lo largo de un gradiente lineal y exponencial. Comportamientos quimiotáctica se registraron dos gradientes establecer con la mayor concentración de 0.5M mismo. Como se explica en el artículo, las fuentes de olor de la pendiente exponencial osciló entre 0,015 y 0,5. Las fuentes del degradado lineal osciló entre 0,25 y 0,5 M (progresión aritmética con diferencia común 0,05).

El gradiente lineal representado un ambiente más desafiante quimiotaxis como la diferencia en la concentración de locales se mantuvo constante y relativamente pequeño, y el estrecho rango de concentraciones (0,25 M). Por el contrario, el rango de concentración del gradiente exponencial fue mayor con el aumento de las diferencias locales en la concentración a lo largo del camino.

Quince larvas se registraron para cada una de las dos geometrías la pendiente y las vías superpuestas en un mismo gráfico. Una inspección visual de los dos gráficos que muestran que las larvas de tipo salvaje fueron capaces de ascender de forma fiable el gradiente de ambas geometrías, sino que la cantidad de meandros fue mayor para la condición de gradiente lineal. Esto sugiere que la presencia de la señal a lo largo del gradiente es más fiable para detectar una forma exponencial de un lineal.

6.3. Olor a múltiples análisis de código fuente con gradiente de acetato de isoamilo en un "techo" de geometría.

Aquí se verifica que las larvas introducidas en un gradiente de olor son sensibles a los cambios locales en la concentración de olor y no sólo la presencia o ausencia de olor. Un gradiente de isoamilo se estableció mediante la aplicación de gotas de olor con las siguientes concentraciones: 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 0.25, 0.12M. La geometría resultante se asemejaba a un gradiente de asimetría "techo" alcanzando un máximo de 0,5.

Las larvas fueron puestos en libertad entre las gotas olor 0.06M y 0.12M. Nuestra hipótesis era que si las larvas no eran más que calcular la presencia de olores que se siga el gradiente completo sin una preferencia especial por la concentración máxima. Por el contrario, si las larvas son sensibles a los cambios locales en la concentración que se acumulan debajo de la gota de 0,5. Quince larvas se registraron, y se encontró que después de un período corto de exploración que todas las larvas acumulada debajo de la concentración más alta también. Esto sugiere que los cambios locales en la concentración de olor se calculan e informar el comportamiento quimiotáctico de las larvas de Drosophila.