Högupplöst Mätning av Lukt-Driven Beteende i Drosophila Larver

Summary

I denna video artikeln beskriver vi en ny metod möjliggör byggandet av luktämnen övertoningar med stabil och kontrollerbar geometrier. Vi illustrerar kortfattat hur dessa gradienter kan användas för att screena för luktsinnet defekter (fullständig och partiell luktsinne) och att studera mer subtila funktioner chemotaxis beteende.

Abstract

Olfactory svar i Drosophila larverna har traditionellt studerats i petriskålar består av en enda perifer lukt källa. I detta beteende paradigm antar försöksledaren oftast att den snabba spridningen av doftämnen från källan leder till skapandet av en stabil gradient i skålen. För att fastställa en kvantitativ samband mellan sensoriska indata och beteendemässiga reaktioner, är det nödvändigt att uppnå en mer grundlig beskrivning av villkoren luktämnen stimulans. I denna video artikeln beskriver vi en ny metod möjliggör byggandet av luktämnen övertoningar med stabil och kontrollerbar geometrier. Vi illustrerar kortfattat hur dessa gradienter kan användas för att screena för luktsinnet defekter (fullständig och partiell luktsinne) och att studera mer subtila funktioner chemotaxis beteende.

Protocol

1. Utrustning och reagenser

Lukt spädningar:

• Paraffinolja (Sigma, CAS-nummer: 8012-95-1)
• Lukt av högsta renhet som finns och som väcker attraktion i Drosophila larver ^1. I denna video artikeln har djur testats med Isoamyl acetat (Sigma, CAS-nummer: 123-92-2).
• 1,5 ml glasflaska med Teflon lock (Agilent Technologies)
• Digital mätskala för exakt utspädning i vikt

Analys arena set-up:

• Agar (Promega)
• Lock av mikroplatta med 96 brunnar (BD Falcon, katalognummer: 353.071). Vårt beteende arenan består av tre staplade lock.
• En kanal 1-20 l pipetter eller flerkanaligt pipetter att ladda luktämnen droppe (er) i locket i bunten. För att ställa in flera källor analysen använder vi 5-50 l Pipettera-Lite flerkanaligt pipetter från Rainin.

Beredning av Drosophila larver för beteende-tester:

• 15% (w / w) sackaroslösning
• Regelbunden petriskålar (BD Falcon) att tvätta och förvara larver
• Pensel (4-5mm borst längd) för att manipulera och överföra larver

Registrering av larver rörelse:

• Små stift med ett platt huvud för att överföra larver till arenan
• Pincett eller pensel för att ta bort larverna efter inspelning
• Belysta scen med ett homogent icke-värme ljuskälla, "Slim Edge" Light Pad tillverkas av Logan Electric
• Skåp att omringa beteende arenan och kontroll ljusförhållanden
• Video tracking systemet för registrering av djur rörelse. Vi använder Ethovision programvara (Noldus, Nederländerna).
• CCD-kamera och frame grabber grafikkort (EureCard Piccolo Basic) köpas med Ethovision programvara
• Termometer och fukt-brännare för att övervaka de atmosfäriska förhållandena under beteendetester (frivilligt)
• Matlab (The MathWorks) för kundanpassade dataanalys (tillval)

2. Behavioral arena

Den beteendemässiga arenan består av tre staplade 96-bra maträtt lock. Botten locket används för att isolera resten av systemet från ljuset pad och minska konvektion i arenan. Det andra locket, täckt med 25ml av en 3% agarosgel, fungerar som en scen för larverna att gå på. Locket håller lukt droppar som finns kvar upphävas av ytspänning.

Lukt droppar pipetteras direkt i brunnar på 96-håls skål lock. En eller flera lukt källor kan användas för att generera gradienter med tydliga, kontrollerbara profiler ^2. Att testa för luktsinne och kemotaxi defekter i larver, föreslår vi att använda följande två analyserna.

2,1. Enstaka lukt källa analysen: en enda lukt droppe som i brunnen # E7 (standard 96-brunnar referenssystem).

• Stimulus: 10μl av lukt utspätt i paraffinolja
• Inledande villkor: en enda larv införs under lukt källan (eller i dess omedelbara grannskap).
• Grundläggande observationer: för attraktiva stimuli (t.ex. Isoamyl acetat), wildtype larver ackumuleras under källan. Anosmic djur eller djur som utsätts för lukt defekter vandra snabbt bort från droppen.
• Varaktighet av ett försök: 3 min. Den rörelse av ett visst djur registreras tills rättegången tiden har gått eller så snart djuret kontakter väggen av plattan.
• Tänkbara mått för beteende-kvantifiering: Andelen tid som ett djur i en liten cirkulär zon centrerad på lukt källa, medelavståndet till lukten källan, tiden under avstånd till lukt källa, etc.

Denna analys tester effektivt för grundläggande luktsinne i mutant larver. Den kan också användas för att tillförlitligt bestämma detektionsgränsen för vissa lukter ^2.

2,2. Flera lukt källa analys

Flera lukt droppar läggs i brunnen i topplocket. I det aktuella videon artikeln satte vi upp gradienter längs mittraden E. Totalt sex droppar infördes i brunnar # E2, # E4, # E6, # E8, # E10 och # E12 (standard 96-brunnar referenssystem ). I motsats till petriskålen och enda lukt analyser källa tillåter flera lukt källan analys kvalitativ kontroll av lutning geometri etablerade längs längden och bredden på arenan. Denna analys har använts för att karaktärisera sensoriska mekanismer för Drosophila larver till chemotax ^2.

• Stimulus: 10μl lukt droppar är lagda i alternerande brunnar längs en rad. Detta arrangemang leder till skapandet av en lutning centrerad vald rad. Att etablera en homogen lutning längs bredden på arenan, kan flera rader laddas med flera källor.
• Inledande villkor: en enda larv införs under lukten källan mellan brunnar # E3 och #E4.
• Grundläggande fenotyper: anosmic larver vandra på måfå från startpunkten. För attraktiva stimuli (t.ex. Isoamyl acetat), djur som kan lukta navigera längs riktningen av ökande lukt koncentration. Den noggrannhet med vilken ett djur stiger lukten leden är korrelerad med dess förmåga att känna och bearbeta luktämnen stimulans. Slingrande stigar är ofta orsakade av sensoriska defekter. När ett djur har nått en punkt av högsta koncentrationen i rättegången, är den i närheten av denna position.
• Varaktighet av ett försök: 3 min max (längre spårning löptider tenderar att införa brus som larver tappar intresset och så småningom överge lutning). För gradienter illustreras i denna video artikeln var rörelse en enskild larv registreras tills djuret nått trakten av den högsta koncentrationen källa (nåja # E12). Inspelningen avbröts så snart djuret nått målet område eller kontaktat någon vägg arenan.
• Tänkbara mått för beteende-kvantifiering: Andelen tid som ett djur under luktämnen linjen (blå rektangel), menar rubriken i förhållande till den lokala inriktningen av lukten lutning, en kombinerad chemotaxis poäng mäta den globala tendensen hos ett djur att följa luktämnen Linje ^2.

3. Gradient profil verifiering

Innan du testar larver i en viss lutning, är det viktigt att avgöra dess stabilitet över tiden. På grundval av detta kan försöksledaren bestämma en lämplig tid för varje prövning och antalet larver som kan spåras sekventiellt i samma arena. För att testa stabiliteten i lutning, har vi utvecklat en metod baserad på IR-spektroskopi ^2. Denna metod är utanför ramen för detta protokoll och kommer inte att preciseras närmare.

4. Protokoll för beredning av ett experiment

4,1. Beredning av agarosen plattan och spädningar lukt:

1. 1. Häll 25ml 3% agaros på den flata toppen av ett 96-bra maträtt locket, låta agarosen svalna och stelna (~ 30 min).
   
   Viktigt: Se till att 96 brunnar lock är på en plan yta innan du häller den agarosen som förekomsten av en sluttning på den stelnat agarosgel kan påverka beteendet hos de larver. Då häller gelen, ta bort alla bubblor som bildas på ytan.
   
   
2. 2. Späd lukter till önskat koncentrationer i paraffinolja använder en digital skala för att exakt mäta mängder av paraffinolja och lukt i varje utspädning.

Anteckningar: När nästan luktfri koncentrationer används, är det bättre att förbereda en uppsättning källa koncentrationer baserade på seriespädningar. Start, till exempel med ett 1.0M lösning och göra en 1:02 spädning för att erhålla en lösning 0,5. Genom förfarandet återkommande, får man en spädningsserie efter geometrisk progression 1.0M, 0,5 m, 0,25 m, 0.12M, 0.06M, 0.03M, 0.015M.

OBS: Eftersom många organiska lukter reagerar med plast, måste lukt spädningar förvaras i glasflaska med Teflon mössor. Helst bör lukter beredas på nytt före varje försök att minska svängningarna i själva lukt koncentration över experiment. Detta gäller särskilt när man använder mycket flyktiga kemikalier.

4,2. Larver förberedelser:

1. 1. Förbered 15% sackaros lösning i destillerat vatten.
   
   Anteckningar: En 15% sackaroslösning är tätare än larver och kommer att få dem att vara flytande med hjälp till ytan av lösningen. Men oupplösta flyga mat bitar har större densitet än den lösning och snabbt sjunka till botten. Därför använder denna sackaroslösning är ett effektivt sätt att skilja larver från maten. Sackaroslösning är ett utmärkt medium för biologiska föroreningar, om lösningen blir grumlig kan det vara filtersteriliserad att ta bort föroreningar.
   
   
2. Skaffa en injektionsflaska med 6-dagar gamla larver eller larver vid önskad utvecklingsstadiet.
   
   Anmärkningar: Alla våra experimenten utförs med 6-dagar gamla larver (mitten av tredje INSTAR utvecklingsstadiet), larver i det här utvecklingsstadiet är tillräckligt stora för att underlätta upptäckt med vår mjukvara, men också mycket aktiv.
   
   
3. Häll sackaros i maten injektionsflaskan som innehåller larver.
4. Med hjälp av en spatel, bryta upp och lös flugan maten försiktigt för att frigöra larver. Släppt larver flyter upp till ytan.
5. Låt ett par minuter för att flyga maten bitar att sjunka till botten av flaskan, sedan, häll sackaros och larver i en petriskål. Om förval av larverna är nödvändig, kan djuren samlas in genom att hälla sackaros genom ett filter. Larverna kan sedan överföras till en maträtt för val med en pensel.
6. Låt larverna i cirka 30 minuter i Sucrose lösning innan du fortsätter med beteendevetenskaplig tester för att låta djuren att vänja till sackaroslösning. Som larver inte verkar livnära sig på sackaros, kommer djuren upplever ett tillstånd av svält som förbättrar chemotaxis prestanda.
7. Locket petriskålen kan fyllas med vatten (eller sackaros) och används som en behållare för kasserade djur efter beteendevetenskaplig tester.

5. Protokoll för att utföra beteende-inspelningar

5,1. Arena set-up:

1. 1. Applicera lukt droppar på undersidan (vällde sidan) av en ny 96-bra maträtt lock.
   
   Viktigt: För att undvika kontamination från olika dofter och koncentrationer lukt, måste ett nytt lock användas för varje lastning set-up. Ingen av lock med lukt källor återvinns efter experimentet. Beroende på lukten koncentration som används olika, har luktämnen lutningar visat sig vara stabila bara för 10 till 20 minuter i ett slutet system. Det är därför viktigt att minimera tiden mellan gradienten set-up och den faktiska början av beteendemässiga testet.
   
   
2. Vänd locket och stack den ovanför ett andra lock belagd med 3% agaros lager.
   
   Viktigt: Vänd locket försiktigt för att förhindra lukt droppar från att sprida sig till intilliggande brunnar.
   
   
3. Vid omkastning av locket på agaros ytan, låt lukt att sprida i 30 sekunder innan införa larv.

5,2. Laddar larver:

1. Lyft locket innehåller luktämnen dropparna precis tillräckligt för att möjliggöra lastning av larven.
2. Överför en larv från sackaros lösning till agaros lagret. Utgångsläget av djuret beror på analysen som används:
   
   För den enda lukt källa analys, är larver släppt under luktämnen droppen.
   
   För flera lukt källan analys är larver frigörs mellan brunnar # E3 och # E4.
   
   Viktigt: Rikta in nyligen införda djur på ett konsekvent sätt. Vi orientera våra djur i riktning mot gradienten, se till att djuret kroppen och huvudet ansikte den högsta koncentrationen. Djur som förts in en orientering motsatt den i lutning inleda en sökning beteende. Enligt vår uppfattning är denna första sökning period en onödig källa till buller. Styra huvudet riktning minskar antalet djur som kontaktar arenan väggen under sin undersökande beteende. Denna praxis inte prima riktning som djuret eller avsevärt öka antalet anosmic djur chemotaxing längs luktämnen linjen av en slump (dvs. falskt positiva i lukt tester).
   
   
3. Sätt tillbaka locket och starta inspelningen omedelbart.
   
   Anteckningar: Friska larver börjar krypa omedelbart efter deras införande i arenan och kan omfatta ett avstånd av 1 cm inom de första 10 sekunder. Om försöksledaren är långsam på att inleda inspelningen, kommer första datapunkter förlorade. Av detta skäl rekommenderar vi att försöksledaren blir väl förtrogen med programvaran kommandon för att påbörja inspelning innan du försöker köra ett experiment.
   
   
4. Låt larven att uppföra sig under hela inspelningen (vanligtvis 3 minuter).
   
   Anteckningar: Inspelningar avslutas före slutet på 3 min om larven träffar arenan väggen eller når ett målområde (till exempel i övertoningen test).
   
5. I slutet av inspelningen, omedelbart lyft på locket och ta bort larven med pincett eller en pensel. Placera spårade djur i petriskålen locket med vatten (eller sackaros).
   
   Viktigt: Inspelade djur inte återanvändas. Vattnet skålen är bara en praktisk behållare för att separera registreras och un-inspelade djur när du kör experiment.
   
6. Om spårning av flera djur i en arena set-up, snabbt ladda nästa larv och starta inspelningen som visas ovan.
   
   Viktigt: Hur många försök som utförs på samma arena set-up bör fattas på grundval av den lutning stabilitet som bör kontrolleras innan du utför någon beteendevetenskaplig experiment ^2.
   
7. När alla larverna som ska testas under arenan set-up har spårats och bort från arenan, kassera den övre locket och agaros lager. De mellanliggande lock (dvs agaros lock) kan återvinnas.
   
   Observera: Vi rekommenderar Ethovision användare att välja "Bakgrund subtraktion" detektionsmetod.

6. Exempel på experiment som demonstreras i videon artikeln

6,1. Enstaka lukt källa analysen med 1.0M av Isoamyl acetat.

Vi testade blint tio Or83b-/ - mutanter och tio vild typ (W1118) larver till envar av vilka ett antal hade tilldelats. Spårningen experimentER har inte fått någon information om genotypen av varje djur. Efter varje inspelning var en prediktiv fenotyp tilldelas varje djur som testats: smellers om ackumulering observerades under källa för hela försöksperioden, icke-smellers, om sökvägen snabbt lämnade området av lukt källa. Efter att ha spelat in beteendet hos 20 djur, var vägar grupperade enligt fenotyp. Resultatet av denna gruppering sedan jämförts med de faktiska genotyp av larver: gjordes alla uppdrag visar sig vara korrekt.

6,2. Flera lukt källa analysen med exponentiell och linjära gradienter av Isoamyl acetat.

I detta experiment jämförde vi föreställningar av vildtyp larver chemotaxing längs en linjär och en exponentiell lutning. Kemotaxi beteenden noterades för två gradienter inrättas med samma högsta koncentration av 0,5. Som förklaras i artikeln, varierade lukten källorna den exponentiella gradient mellan 0,015 och 0,5. Källorna till linjär övertoning varierade mellan 0,25 och 0,5 m (aritmetisk med gemensamma skillnad 0,05).

Den linjär övertoning representerade en mer utmanande chemotaxis miljön som den lokala skillnaden i koncentrationen var konstant och relativt små, och det koncentrationsintervall smal (0,25 m). Däremot var koncentrationen utbudet av den exponentiella gradienten större med ökande lokala skillnader i koncentration längs leden.

Femton larver noterades för de två lutning geometrier och stigar ovanpå i ett diagram. En visuell inspektion av de två diagrammen visar att vildtyp larver kunde säkert gå upp lutningen för både geometrier, men att mängden slingrande var större för linjär gradient skick. Detta tyder på att signalen fram längs gradienten längd är mer tillförlitligt upptäcks en exponentiell form än en linjär ett.

6,3. Flera lukt källa analysen med Isoamyl acetat gradient i ett "tak" geometri.

Här kan vi kontrollera att larver infördes en lukt lutning är känsliga för lokala förändringar i lukt koncentration snarare än bara närvaron eller frånvaron av lukt. En Isoamyl lutning fastställdes genom tillämpning av lukt droplets med följande koncentrationer: 0,06, 0,12, 0,25, 0,5, 0,25, 0.12M. Den påföljande lutning geometri liknade ett asymmetriskt "tak" topp på 0,5.

Larver släpptes mellan 0.06M och 0.12M lukt droppar. Vår hypotes var att om larverna bara var att beräkna förekomsten av lukt att de skulle följa hela gradienten utan en viss förkärlek för koncentrationen maximal. Om däremot larver är känsliga för lokala förändringar i koncentrationen att de skulle samlas under 0,5 droppen. Femton larver spelades in, och man fann att efter en kort förberedande period alla larver ackumulerade under högre koncentration väl. Detta tyder på att lokala förändringar i lukt koncentration beräknas och informera kemotaxi beteende Drosophila larver.