Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Eencellige proteomics voorbereiding voor massaspectrometrie-analyse met behulp van freeze-heat lysis en een isobare drager

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802
Automatic Translation
*1, 1,2,3, *1
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Barnett Institute, Northeastern University, 3Department of Biology, Northeastern University
* These authors contributed equally

Summary

In dit protocol beschrijven we hoe zoogdiercellen kunnen worden voorbereid op eencellige proteomics-analyse via massaspectrometrie met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia en apparatuur, met opties voor zowel handmatig als automatisch pipetteren.

Abstract

Eencellige proteomics-analyse vereist gevoelige, kwantitatief nauwkeurige, breed toegankelijke en robuuste methoden. Om aan deze vereisten te voldoen, is het Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) -protocol ontwikkeld als een methode van de tweede generatie voor het kwantificeren van honderden tot duizenden eiwitten uit beperkte monsters, tot op het niveau van een enkele cel. Experimenten met deze methode hebben meer dan 3.000 eiwitten gekwantificeerd in 1.500 enkele zoogdiercellen (500-1.000 eiwitten per cel) in 10 dagen massaspectrometerinstrumenttijd. SCoPE2 maakt gebruik van een vrieswarmtecyclus voor cellyse, waardoor de noodzaak voor het opruimen van afzonderlijke cellen wordt vermeden en bijgevolg monsterverliezen worden verminderd, terwijl de monstervoorbereiding wordt versneld en de automatisering ervan wordt vereenvoudigd. Bovendien maakt de methode gebruik van een isobare drager, die de identificatie van eiwitten bevordert en monsterverliezen vermindert.

Dit videoprotocol biedt gedetailleerde richtlijnen om de toepassing van geautomatiseerde eencellige eiwitanalyse mogelijk te maken met alleen apparatuur en reagentia die breed toegankelijk zijn. We demonstreren kritieke stappen in de procedure voor het voorbereiden van afzonderlijke cellen voor proteomische analyse, van oogsten tot injectie tot vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) analyse. Bovendien worden kijkers geleid door de principes van experimenteel ontwerp met de isobare drager, kwaliteitscontrole voor zowel isobare drager als eencellige preparaten, en representatieve resultaten met een bespreking van de beperkingen van de aanpak.

Introduction

Eencellige analyse wordt veel gebruikt om het niveau van heterogeniteit binnen biologische systemen te bestuderen dat anders niet te onderscheiden zou zijn door bulkmetingen 1,2,3. Een dergelijke cellulaire diversiteit kan functionele gevolgen hebben die het begrip van integrale biologische processen kunnen bevorderen, van therapeutische resistentietegen kankercellen 4,5,6 tot cel-tot-cel heterogeniteit bij diabetes 7,8,9,10. Veel onderzoeken hebben zich gericht op het meten van nucleïnezuren in afzonderlijke cellen, door genetische of transcriptomische niveaus te meten en hebben de classificatie van celtypen en -toestanden mogelijk gemaakt. Een dergelijke vooruitgang in de nucleïnezuurruimte kan echter niet de kenniskloof van post-transcriptionele regulatieopvullen 11, waardoor de behoefte aan eiwitmetingen met vergelijkbare hoge doorvoer in enkele cellen 12,13,14,15 wordt gestimuleerd.

We hebben SCoPE216,17 ontwikkeld om tegemoet te komen aan de vraag naar rigoureuze en robuuste eencellige proteomica van zoogdiersystemen. Het is een multiplexmethode, die een verhoogde doorvoer mogelijk maakt door veel cellen parallel18 te labelen en te analyseren, in tegenstelling tot labelvrije mthods die één cel tegelijk analyseren19,20. De monstervoorbereidingsmethodologie, massaspectrometriebenadering en daaropvolgende gegevensanalysestappen maken een nauwkeurige kwantificering van honderden tot duizenden eiwitten per enkele cel mogelijk. Deze methode maakt massaspectrometrie-analyse van enkele cellen mogelijk via de isobare drager21, een klein bulkmonster van cellen (meestal 25-200) dat biologisch vergelijkbaar is met de eencellige populatie van belang. Dit dragermateriaal wordt gemultiplext in een set met een referentiekanaal van hetzelfde materiaal en enkele cellen door het gebruik van tandemmassatags (TMT-labels). Het dragerkanaal vermindert het verlies van monsters naar oppervlakten en biedt de ionenbackbonefragmenten voor succesvolle peptide-identificatie. Het referentiekanaal, dat in bulk wordt bereid en vervolgens wordt verdund tot 5-10 celequivalenten voor elke eencellige set, helpt de technische variabiliteit in de analyse te beheersen. In het bijzonder maakt de referentie de normalisatie mogelijk van variabiliteit veroorzaakt door LC-MS / MS-gerelateerde effecten, zoals ionenbemonstering en ionisatie-efficiëntie. Meestal worden de referentie en de dragerkanalen gemaakt van dezelfde celpopulatie.

Dit monstervoorbereidingsprotocol is een methode van de tweede generatie die voortbouwt op SCoPE-MS22 door meerdere synergetische verbeteringen. De verbeteringen omvatten een cellysismethode die het opruimen van monsters vermijdt, wat een veel voorkomende stap is van MS-proteomics-preparaten. Het maakt gebruik van mPOP (minimale proteomic sample preparation)23, een vrieswarmtelysismethode. Deze methode maakte lysis van enkele cellen in kleinere volumes en in multiwell-platen mogelijk in plaats van in flacons, waardoor een hogere doorvoersnelheid en automatisering door thermische cyclers mogelijk werd. Al met al heeft deze methode de kosten per enkele cel verlaagd en de kwantitatieve nauwkeurigheid verhoogd in vergelijking met SCoPE-MS16,24.

Dit protocol beschrijft hoe afzonderlijke cellen moeten worden voorbereid voor proteomische analyse, inclusief hoe de drager- en referentiekanalen kunnen worden voorbereid met behulp van TMTpro 18-plex isobare labels. Zoogdiercellen die zich in eencellige suspensie bevinden en die kunnen worden geïsoleerd in platen met 384 putten, zijn waarschijnlijk vatbaar voor dit protocol. Ook inbegrepen zijn representatieve resultaten van succesvolle eencellige sets, die verschillende kwaliteitscontroleplots weergeven die zijn gegenereerd door een R Shiny-app, DO-MS25. Andere gepubliceerde softwaretools26,27 en experimentele richtlijnen17,21 hebben de adoptie van dit protocol verbeterd. We hopen dat deze visuele gids onderzoekers verder zal helpen bij het uitvoeren van eencellige proteomics-experimenten.

Protocol

OPMERKING: In dit protocol is de kamertemperatuur (RT) 18-22 °C.

1. Opwekking van drager- en referentiemateriaal

  1. Celisolatie
    1. Verzamel cellen van belang in celsuspensies in ijskoude 1x PBS.
      OPMERKING: Indien mogelijk moeten de drager en het referentiemateriaal worden bereid uit de celpopulatie(s) die zijn gekozen om op het niveau van één cel te worden bestudeerd. Vergelijkbare aantallen cellen uit de verschillende experimentele omstandigheden (zoals gestimuleerde en niet-gestimuleerde immuuncellen) moeten de drager en referentie vormen. In situaties waarin een voldoende groot aantal van deze cellen niet kan worden geoogst, moet een geschikte celpopulatie worden geselecteerd op basis van biologische gelijkenis.
    2. Met behulp van een hemocytometer of andere manier van celtelling (zoals FACS), tel het aantal cellen in de suspensie.
    3. Spin naar beneden en resuspendeer 22.000 cellen van elk celtype in 11 μL HPLC-water, afzonderlijk in PCR-buizen (standaard 250 μL PCR-buizen).
      OPMERKING: Het aantal cellen dat hier wordt geadviseerd, is voldoende voor de dragers en referenties voor het aantal sets dat kan worden bereid uit een plaat met 384 putten vol afzonderlijke cellen. De celinvoer in deze stap en de reagenshoeveelheden in de volgende stappen kunnen proportioneel worden geschaald voor grotere aantallen sets. De snelheid van het afdraaien is afhankelijk van de celkweekpraktijken van het lab. Een typische spin-down: 300 × g gedurende 5 min.
    4. Breng de monsters gedurende ten minste 30 minuten over in een vriezer van -80 °C.
      PAUZEPUNT: Monsters kunnen enkele maanden bevroren blijven zonder gevolgen voor gegevens met één cel.
  2. Cellyse
    1. Verwarm de PCR-buis met de cellen tot 90 °C gedurende 10 minuten (met het deksel van de thermische cycler ingesteld op 105 °C) en laat de buizen direct na de verwarmingscyclus afkoelen tot 12 °C.
    2. Vortex de buis kort, en spin dan naar beneden in een bench-top PCR buis spinner bij RT om alle vloeistof aan de onderkant van de buis te verzamelen.
    3. In een waterbad sonicator, soniceer de buizen gedurende 5 minuten en plaats ze vervolgens op ijs bij RT.
  3. Trypsine spijsvertering
    1. Voeg 2,2 μL van het hoofdmengsel (zie tabel 1 voor de componenten) toe aan elke monsterbuis terwijl u op ijs bent.
      LET OP: Trypsine kan huid-, ademhalings- en oogirritatie veroorzaken. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Handvat onder een chemische zuurkast.
    2. Vortex de buizen kort om te mengen en naar beneden te draaien in een bench-top PCR-buisspinner bij RT om alle vloeistof aan de onderkant van elke buis te verzamelen.
    3. Verwarm de monsters gedurende 3 uur op 37 °C (met het deksel van de thermische cycler ingesteld op 52 °C).
  4. TMT-etiketteringsreactie
    1. Spin de monsters na de spijsvertering in een bench-top PCR-buisspinner bij RT.
    2. Splits elk monster in twee gelijke volumes van elk 6,6 μL, zodat elke buis 11.000 cellen bevat.
    3. Voeg aan de buizen die bedoeld zijn voor de drager 3,3 μL TMT-label 126 toe dat is geresuspendeerd in een concentratie van 85 mM.
    4. Voeg aan de buizen die bedoeld zijn voor de referentie 3,3 μL TMT-label 127N toe dat is geresuspendeerd in een concentratie van 85 mM.
    5. Vortex de buizen kort en draai naar beneden in een bench-top PCR buis spinner bij RT om de vloeistof aan de onderkant op te vangen.
    6. Laat de buizen 1 uur op RT staan.
  5. Blussen van TMT-etiketteringsreactie
    1. Voeg 1,65 μL 0,5% hydroxylamine toe aan elke buis.
      LET OP: Hydroxylamine kan huidirritatie veroorzaken. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
    2. Vortex de buizen kort en draai naar beneden in een bench-top PCR buis spinner bij RT om de vloeistof aan de onderkant op te vangen.
    3. Laat de buizen 30 min op RT staan.
  6. Combinatie van drager en referentie
    1. Als monsters die de drager vormen afzonderlijk zijn geëtiketteerd, meng ze dan in gelijke verhoudingen.
    2. Als monsters die de referentie vormen afzonderlijk zijn geëtiketteerd, meng ze dan in gelijke verhoudingen.
    3. Meng de drager en referentie zodat de uiteindelijke concentratie van de drager 100-200 cellen/μL is en de referentieconcentratie 5-10 cellen/μL.
    4. Beoordeel de kwaliteit van de drager en referentiematerialen voordat u ze combineert met sets met één cel.
      OPMERKING: Kwaliteitscontrole van de drager en het referentiemateriaal kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, maar het wordt aanbevolen om de DO-MS-software te gebruiken, beschikbaar op do-ms.slavovlab.net17. Kritische metingen van kwaliteit omvatten miscleavage rate (<25%, een metriek berekend als het aantal zelfverzekerd geïdentificeerde peptiden met een gemiste splitsing gedeeld door het aantal zelfverzekerd geïdentificeerde peptiden in totaal) en etiketteringsefficiëntie (>99%, een metriek berekend als het aantal labeling sites, namelijk het peptide N-terminus en Lysine, met een label gedeeld door het totale aantal labeling sites).
      PAUZEPUNT: De drager en referentiematerialen kunnen tot het nodig bij -80 °C worden bewaard.
Bestanddeel Mix concentratie Eindconcentratie per buis
Trypsine Goud 50 ng/μL 8,33 ng/μL
TEAB, pH = 8,5 500m 83,33 mM
Benzonase nuclease 1.2 eenheden 0,2 eenheden

Tabel 1: Reagenshoeveelheid mastermix. De uiteindelijke concentraties van reagentia die nodig zijn voor trypsinevertering worden vermeld.

2. Bereiding van het SCoPE2-monster

  1. Celisolatie
    1. Vul HPLC-kwaliteit water aan met 25 fmol per peptide per μL van een synthetische peptide-oplossing.
      OPMERKING: Waters MassPrep peptide-oplossing is een voorbeeld van wat kan worden gebruikt. Het is samengesteld uit zeven peptiden die niet erg goed ioniseren. Dit is een belangrijk aspect van deze oplossing: deze peptiden interfereren niet met nauwkeurige massaspectrometrie kwantificering van afzonderlijke cellen. Elk sterk gezuiverd mengsel van een paar peptiden die waarschijnlijk niet in de interessante monsters zitten, is geschikt.
    2. Voeg 1 μL van dit mengsel toe aan elke put van een 384-well plaat met behulp van een vloeistofdoseerrobot of handmatige pipet.
    3. Sluit de plaat af en draai deze naar beneden in een bench-top plate spinner bij RT om de vloeistof aan de onderkant op te vangen.
      PAUZEPUNT: Platen met deze oplossing kunnen tot het nodig bij -80 °C worden bewaard.
    4. Verkrijg een opschorting van niet-gefixeerde cellen die zijn uitgesplitst.
      OPMERKING: Hoe de celsuspensie precies wordt verkregen, is gebaseerd op het celtype van belang. Hier zijn brede voorbeelden:
      1. Suspensiecellen: spin de cellen in een pellet en verwijder het celkweekmedium.
      2. Aanhangcellen: verwijder de cellen uit de schaal of kolf door trypsinisatie of schrapen. Draai ze vervolgens naar beneden om het celkweekmedium te verwijderen.
    5. Was de celsuspensie twee keer met 1x ijskoude PBS. Laat de cellen na de tweede wasbeurt in 1x PBS hangen.
    6. Als de 384-well plaat bevroren was, ontdooi deze dan bij RT. Draai het naar beneden om ervoor te zorgen dat alle vloeistof zich op de bodem van de putten bevindt.
    7. Gebruik een celsorteerder of andere beschikbare middelen, zoals handmatig handmatige handmatige selectie, om afzonderlijke cellen in de respectieve putten te verdelen.
      OPMERKING: Voeg enkele cellen toe aan putten terwijl u sommige putten leeg laat voor negatieve en positieve controles (zie discussie). Gebruik bij het gebruik van flowcytometrie de laagst mogelijke stroomsnelheid voor de flowcytometer. Er wordt gedacht dat een lager debiet zachter is voor de verwerking van cellen. Bovendien moet de grootte van het mondstuk geschikt zijn voor gebruik met de cellen van belang. Het wordt aanbevolen om samen te werken met een flowcytometriefaciliteit.
    8. Voeg positieve controles van 2-5 celequivalenten lysaat toe aan geselecteerde putten die handmatig of met vloeistofbehandelingsrobots worden gepipetteerd.
    9. Sluit en draai de plaat af met gesorteerde cellen in een bench-top plate spinner bij RT om de vloeistof aan de onderkant te verzamelen. Vries de plaat zo snel mogelijk in bij -80 °C.
      PAUZEPUNT: Platen met gesorteerde enkele cellen kunnen totdat dit nodig is bij -80 °C worden bewaard.
  2. Cellyse
    1. Neem de 384-well plaat met de gesorteerde enkele cellen en plaats deze zo snel mogelijk in de thermische cycler.
    2. Verwarm de plaat gedurende 10 minuten tot 90 °C (met de dekseltemperatuur ingesteld op 105 °C) en laat de plaat vervolgens afkoelen tot 12 °C.
    3. Draai de plaat kort naar beneden in een bench-top plate spinner bij RT.
    4. Sonicator in een waterbad soniceer de plaat gedurende 5 minuten bij RT en plaats hem vervolgens op ijs.
  3. Trypsine spijsvertering
    1. Bereid 100 μL van het hoofdmengsel (zie tabel 1 voor componenten) per plaat met 384 putjes.
    2. Voeg aan elk putje van de 384-well plaat 0,2 μL van het in stap 2.3.1 bereide hoofdmengsel toe met behulp van een vloeistofbehandelingskast.
      OPMERKING: Gebruik grotere volumes als handmatig pipetteren wordt gebruikt, zorg ervoor dat de uiteindelijke concentraties reagentia nog steeds hetzelfde zijn per put.
    3. Sluit de plaat af, vortex gedurende 5 s en spin naar beneden in een bench-top plate spinner bij RT.
    4. Verwarm de 384-wells plaat op 37 °C (met de dekseltemperatuur ingesteld op 52 °C) gedurende 3 uur.
  4. TMT-etiketteringsreactie
    1. Haal de 85 mM voorraden TMT labels (128N tot en met 135N) uit de -80 °C vriezer. Verwarm de buizen tot kamertemperatuur voordat u ze opent.
    2. Verdun de etiketten tot 22 mM in watervrije acetonitril.
      LET OP: Acetonitril is een brandbare vloeistof. Het kan de huid, ogen, luchtwegen en het centrale zenuwstelsel irriteren. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Handvat onder een chemische zuurkast.
    3. Gebruik deze etiketteringsstrategie om 0,5 μL verdunde TMT-labels toe te voegen aan elk putje van de 384-wellplaat. Gebruik een vloeistofdoseerrobot (als u een vloeistofhandler gebruikt, zorg er dan voor dat u bijbehorende apparatuur gebruikt die geschikt is voor organische oplosmiddelen) of een handmatige pipet.
      OPMERKING: Zie tabel 2 voor de etiketteringsstrategie. Zie tabel 3 voor een voorbeeld van de plaatindeling.
    4. Sluit de plaat af, vortex gedurende 5 s en spin naar beneden in een bench-top plate spinner bij RT.
    5. Laat de etiketteringsreactie 1 uur op RT doorgaan.
  5. Blussen van TMT-etiketteringsreactie
    1. Voeg aan elk putje van de 384-well plaat 0,2 μL 0,5% hydroxylamine (verdund in HPLC-water) toe met behulp van een vloeibare handler.
      OPMERKING: Gebruik grotere volumes als handmatig pipetteren wordt gebruikt, zorg ervoor dat de uiteindelijke concentraties reagentia nog steeds hetzelfde zijn per put.
    2. Sluit de plaat af, vortex gedurende 5 s en spin naar beneden in een bench-top plate spinner bij RT.
    3. Houd de plaat 30 min op RT.
  6. Voorbereiding voor LC-MS/MS-analyse: combinatie van enkele cellen en controleputten met drager/referentiemateriaal
    1. Haal de gecombineerde drager/het referentiemateriaal uit de vriezer -80 °C.
    2. Pipetteer voor elke set 1 μL drager en referentiemateriaal in de eerste put die deel uitmaakt van een enkele set. Pipetteer het volledige volume van de eerste put naar de volgende put. Ga door met het pipetteren van het volledige volume van de ene cel naar de volgende totdat alle putten die in een enkele set moeten worden opgenomen, in de uiteindelijke put zijn gecombineerd.
      OPMERKING: De drager en het referentiemateriaal moeten een concentratie van respectievelijk 200- en 5-celequivalenten hebben, maar zoals eerder besproken21, kunnen deze hoeveelheden variëren. Elke set, zoals beschreven in de etiketteringsstrategie (zie tabel 2), moet drager, referentie en maximaal 12 of 14 eencellige of controlemonsters bevatten bij gebruik van respectievelijk TMTpro-16plex of TMTpro-18plex (zie stap 2.4.3).
    3. Voeg voor elke set 5 μL 50% acetonitril (verdund in water van HPLC-kwaliteit) toe aan de eerste eencellige put die in elke set moet worden opgenomen. Pipetteer het volledige volume van de eerste put naar de volgende put. Ga door met het pipetteren van het volledige volume van de ene cel naar de volgende totdat alle putten die in een enkele set moeten worden opgenomen, in de uiteindelijke put zijn gecombineerd.
      OPMERKING: Deze wasstap kan helpen bij het herstel van monsters uit de putten.
    4. Breng elke set over in hun individuele autosampler glazen inzetstukken.
      OPMERKING: Deze sets kunnen ook worden gecombineerd in enkele putten van een 384-well plaat en direct in de autosampler worden geplaatst voor injectie28.
    5. Zodra alle sets zijn gecombineerd en in glazen inzetstukken zijn geplaatst, droogt u de monsters.
      PAUZEPUNT: Gedroogde sets kunnen ten minste 1 week bij -80 °C worden bewaard voordat ze op een massaspectrometer worden uitgevoerd.
    6. Voeg voorafgaand aan de LC-MS/MS-analyse 1,2 μL mierenzuur (verdund in HPLC-water) toe aan elke set om de gelabelde peptiden te resuspenderen.
      LET OP: Mierenzuur is een brandbare vloeistof. Het kan ernstige oogbeschadiging of brandwonden op de huid veroorzaken. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Handvat in een goed geventileerde ruimte.
    7. Plaats de autosampler-inzetstukken in glazen autosampler-injectieflacons en sluit elk monster met een dop.
    8. Vortex elke injectieflacon gedurende 5 s om ervoor te zorgen dat de resuspensie voltooid is en draai vervolgens naar beneden in een injectieflaconspinner bij RT.
    9. Zorg ervoor dat elk monster zich aan de onderkant van de insert bevindt, in plaats van aan de zijkanten te spatten.
    10. Plaats de injectieflacons in de autosampler-lade.
    11. Injecteer voor elke set 1 μL voor LC-MS/MS-analyse.
Etiket 126 127N 127C 128N 128C 129N 129C 130N 130c .... 135N
Type voorbeeld Vervoerder Referentie Leeg Leeg SC/Besturing SC/Besturing SC/Besturing SC/Besturing SC/Besturing .... SC/Besturing

Tabel 2: Voorbeeld SCoPE2 TMTpro-18plex etiketteringsschema. De drager en referentie worden meestal gelabeld in de eerste twee TMT-labels. Vervolgens worden de volgende twee labels overgeslagen vanwege mogelijke isotopische verontreiniging die de kwantificering minder nauwkeurig zou maken. De andere labels die overblijven, zijn voor afzonderlijke cellen of besturingselementen.

128C 129N 129C 130N 130c 131n 131C 132N 132C 133N 133C 134N 128C 129N 129C 130N 130c 131n 131C 132N 132C 133N 133C 134N
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Een SC SC - SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC + SC SC SC
B SC + SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC +
C SC - SC - SC SC SC + SC - SC SC SC SC + SC - SC SC SC SC SC SC -
D SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC + SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
E SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC - SC SC
F SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC + SC SC SC + SC SC SC + SC SC
G SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC
H SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC
Ik SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
J - SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC SC
K SC SC SC SC - SC SC SC SC - SC SC + SC - - SC SC SC SC SC SC SC SC
L SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC
M SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC
N + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
O SC SC SC SC + SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
P SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC - SC

Tabel 3: Voorbeeld plaat lay-out voor labeling met TMTpro-16plex. Met behulp van een 384-well plaatformaat (of een ander plaatformaat), is het belangrijk om de putten waarin cellen worden gesorteerd te randomiseren. Voor TMTpro-18plex wordt een andere plaatindeling gebruikt.

Representative Results

Positieve resultaten van het protocol houden in dat wordt gecontroleerd of een aantal kritieke stappen in het protocol met succes zijn uitgevoerd; deze omvatten de voorbereiding van de drager, eencellige isolatie, lysis, spijsvertering, barcode-etikettering en MS-parameteroptimalisatie. DO-MS-plots maken het gemakkelijk om de voltooiing van elke kritieke stap in het protocol te beoordelen. Een succesvol bereide drager, die meestal overeenkomt met 25 en 200 cellen in hoeveelheid (per set), is goed verteerd en goed gelabeld. Plots van DO-MS maken het mogelijk om de intensiteit van het monster te kwantificeren (om de hoeveelheid te schatten), de verteringsefficiëntie (idealiter <25% miscleavages) en de etiketteringsefficiëntie (moet worden >99%). Het meest kritieke is dat dragermonsters die niet volledig zijn gelabeld, de kruisreactie met de barcodes die bedoeld zijn voor enkele cellen mogelijk maken en een vals signaal toevoegen aan de kwantificering van eencellige peptiden.

Negatieve controleputten omvatten alle experimentele reagentia, maar missen een cel. Hierdoor kan niet alleen achtergrondgeluid worden beoordeeld, maar kan ook de efficiëntie van celisolatie worden bepaald door een representatief signaal van een lege put te geven. Het DO-MS-rapport biedt plots om het gemeten signaal van de controleput naast de eencellige putten te beoordelen om het succes van celisolatie en achtergrondgeluid te bepalen. Daarnaast kan de kwaliteit van kwantificering worden beoordeeld met behulp van de SCoPE2-pijplijn (beschikbaar op GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) of het SCP Bioconductor-pakket29.

De verterings- en etiketteringsefficiëntie van de afzonderlijke cellen wordt misschien niet direct getest zoals bij de drager, maar DO-MS biedt opnieuw plots die de schatting van de vertering en etiketteringsefficiëntie mogelijk maken. Door een controle van 100-200 cellen op te nemen naast de voorbereiding van de afzonderlijke cellen (d.w.z. dezelfde reagenstoevoegingen ontvangen), kunnen de verterings- en etiketteringsefficiënties voor die controle worden beoordeeld en worden verondersteld te worden gedeeld door de afzonderlijke cellen die ernaast zijn bereid. Een slechte spijsvertering wordt aangegeven door een hoge verhouding van de intensiteit van miscleaved peptiden tot hun volledig gespleten tegenhangers (figuur 1).

Een andere factor om te overwegen in de sets is de fractie van ontbrekende gegevens en de mediane intensiteit van de reporterionen in elk TMT-kanaal (figuur 2). Wanneer afzonderlijke cellen met succes worden voorbereid, is de hoeveelheid ontbrekende gegevens per cel en positieve controle veel lager dan in negatieve controlemonsters. Evenzo is de mediane intensiteit van precursoren veel hoger in afzonderlijke cellen en positieve controles dan bij negatieve controles. De optimalisatie van MS-parameters is elders uitgebreid besproken21, en optimale parameters kunnen worden bepaald met behulp van tools zoals DO-MS of SCP Companion25,27.

Figure 1
Figuur 1: Kwaliteitscontrole van de dragervoorbereiding. DO-MS-plots die (A) etiketteringsefficiëntie van een succesvol bereide drager op plaatsen van etikettering met TMT weergeven: het primaire amine aan de zijketen van lysine en het peptide N-terminus, en (B) de verteringsefficiëntie bij aminozuurresiduen van tryptische splitsing. Afkorting: TMT = tandem mass tag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Kwaliteitscontrole van de eencellige bereiding. DO-MS-plots die (A) de fractie van ontbrekende gegevens in afzonderlijke cellen (C5-10), controles (C13,16), drager (C1) en referentie (C2) en (B) de intensiteit van afzonderlijke cellen en controles weergeven. Tags 127C, 128N, 131C, 132N, 133N en 133C, die overeenkomen met C3, C4, C11, C12 en C15, zijn ongebruikt in deze specifieke set. De positieve controle bestaat uit cellulair materiaal dat in bulk wordt verwerkt tot peptiden en vervolgens wordt verdund tot een niveau van 2-5 cellen / μL voorafgaand aan etikettering. De negatieve controle bestaat uit een put onderworpen aan alle voorbereidende stappen die worden gebruikt voor enkele cellen, alleen zonder de toevoeging van een enkele cel. Afkorting: TMT = tandem mass tag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Een van de sleutels tot succesvolle voorbereiding en analyse van afzonderlijke cellen door SCoPE2 is de voorbereiding van de drager en referentiekanalen. De voorgestelde dragergrootte is 100 tot 200 cellen; het aantal cellen dat nodig is voor een bepaald eencellig experiment kan echter worden bepaald op basis van principes zoals elders besproken21. Voor de voorgestelde grootte zijn ten minste ~ 11.275 cellen nodig per 384-well plaat, waardoor een 200-cel drager en 5-cel referentie in elke set mogelijk is. Het kan voordelig zijn om meer cellen te isoleren als de gewenste celpopulaties geen beperkende factor zijn, om gewoon extra materiaal te hebben in geval van fouten (zoals in dit protocol werd gedaan, waarbij 22.000 cellen worden geïsoleerd in plaats van 11.275 cellen). De hoeveelheid drager en referentie die nodig is voor het aantal gewenste platen moet in één batch worden bereid om elke batch-tot-batchvariatie te minimaliseren die ertoe kan leiden dat peptide-identificatie of kwantificering tussen batches verschilt.

Voordat u enkele cellen isoleert in putten van een 384-well plaat, is het belangrijk om het ontwerp van de plaatlay-out te overwegen. Binnen elke 384-well plaat wordt aanbevolen om zowel positieve als negatieve controles te implementeren. Negatieve controles zijn putten waarin geen cellen worden toegevoegd, maar dezelfde reagenstoevoegingen en procedures ondergaan als de eencellige putten. Positieve controles zijn putten waarin cellysaat verdund tot 2-5 cellen / μL wordt toegevoegd in plaats van enkele cellen. Dit is vooral belangrijk om te implementeren wanneer eencellige isolatiemethoden niet goed gevalideerd zijn. Elke 384-well plaat zou idealiter een gerandomiseerde verdeling van enkele cellen en controles moeten hebben (bijvoorbeeld geen negatieve of positieve controles in slechts één rij). Elke plaat moet een gelijke verdeling hebben van alle celpopulaties van belang, in plaats van het isoleren van één celtype in één plaat en een tweede celtype in een tweede plaat. Dit voorkomt dat batcheffecten worden gekoppeld aan celtypen van belang. Bovendien, als er meer dan één 384-well plaat nodig is voor analyse, is het raadzaam om cellen in één sessie te isoleren, in plaats van de isolatiestap over meerdere dagen te spreiden, indien mogelijk.

Lysis van zowel enkele cellen als drager/referentie vindt plaats in water via een vrieswarmtecyclus23. Verwacht wordt dat de meeste proteasen tijdens deze stap zijn gedenatureerd. Trypsine wordt dan onmiddellijk na de denaturatiestap toegevoegd in een hoge concentratie, vele ordes van grootte groter in concentratie dan zelfs de meest voorkomende cellulaire proteasen. Door massale actie zullen de meeste producten van protease-activiteit te wijten zijn aan trypsine.

Reductie/alkylering van cysteïneresiduen wordt in dit protocol niet uitgevoerd vóór trypsinevertering. Cysteïnebevattende peptiden vertegenwoordigen ongeveer 10% van de tryptische peptiden uit het menselijke proteoom. We zien minder cysteïnebevattende peptiden met behulp van een aanpak zonder reductie / alkylering. Deze stappen gebruiken reagentia die niet compatibel zijn met etikettering door TMT (NHS-esterchemie) onmiddellijk na de spijsvertering.

In deze TMT-etiketteringsstrategie worden de drager en referenties gelabeld met respectievelijk 126 en 127N, terwijl eencellige en controleputten worden gelabeld met 128C tot en met 135N. De twee labels na de referentie, 127C en 128N, worden niet gebruikt vanwege isotopische kruisbesmetting als gevolg van de drager en referentiekanalen, die duidelijk veel overvloediger zijn in peptidemateriaal dan de afzonderlijke cellen. In totaal zijn er 12 TMT-kanalen per set die kunnen worden gebruikt voor het labelen van afzonderlijke cellen of controleputten met TMTpro-16plex, of 14 TMT-kanalen per set met TMTpro-18plex.

De kritieke stappen in het protocol om eencellige proteomics-metingen uit te voeren met behulp van dit protocol omvatten voorbereiding van de drager, eencellige isolatie, lysis, spijsvertering, barcode-etikettering en de juiste massaspectrometrieparameters. Deze stappen zijn in dit document beschreven en zijn elders uitgebreid beschreven 17,21,25. Elke stap heeft een overeenkomstig perceel of set percelen in DO-MS die een eenvoudige kwaliteitscontrole mogelijk maken. In het geval van een succesvolle creatie van de drager, maken plots met het aantal geïdentificeerde peptiden, de etiketteringsefficiëntie en het percentage miscleavage-snelheid bijvoorbeeld verificatie van de succesvolle bereiding mogelijk. Representatieve DO-MS-rapporten zijn opgenomen in deze publicatie en zijn te zien op http://scope2.slavovlab.net/ voor de oorspronkelijke gegevens16. Deze DO-MS-rapporten maken het mogelijk om de optimalisatie van de methode te beoordelen in richtingen die nog niet door de auteurs zijn onderzocht, zoals langere LC-gradiënten, verschillende spijsverteringsenzymen of alternatieve chemische barcodes.

Momenteel beperkt de seriële analyse van peptiden door gegevensafhankelijke acquisitie-algoritmen het aantal peptiden dat kan worden geanalyseerd in een LC-run van een redelijke lengte. Dit is deels te wijten aan de langere vultijden die nodig zijn voor de succesvolle verwerving van voldoende ionen voor betrouwbare eencellige kwantificering21. Een inherente beperking van het gebruik van de drager is het gebrek aan directe beoordeling van de spijsvertering en etiketteringsefficiëntie van de afzonderlijke cellen. Momenteel is een oplossing voor deze beperking het uitvoeren van kwaliteitscontrole op een groter monster dat naast de afzonderlijke cellen wordt verwerkt.

We stelden een aantal mogelijkheden voor om eencellige proteomics te verbeteren, zoals het bouwen van massaspectrometers met meerdere analyzers. De huidige methode maakt de kwantificering mogelijk van duizenden eiwitten uit afzonderlijke zoogdiercellen met een snelheid van ongeveer 100 cellen per dag met in de handel verkrijgbare reagentia en apparatuur. SCoPE2, de tweede generatie van de SCoPE-MS-benadering, verbeterde aanzienlijk ten opzichte van zijn voorganger met betrekking tot het aantal cellen dat per tijdseenheid kan worden geanalyseerd, het aantal eiwitten dat per tijdseenheid kan worden geanalyseerd, de tijd die nodig is voor monstervoorbereiding, de toegankelijkheid van reagentia en apparatuur, en de totale kosten van voorbereiding en analyse per enkele cel. Membraangebonden eiwitten zijn toegankelijk met behulp van de vrieswarmtelyse en proteasevertering, zoals blijkt uit vergelijking met ureumlysis23. De methode identificeert veel eiwitten uit het bovenste derde deel van het proteoom met betrekking tot abundantie16. Als de gemodificeerde proteoform zich in het bovenste derde deel van het proteoom bevindt en het gemodificeerde peptide vatbaar is voor massaspectrometrie-analyse (ioniseert goed, heeft een massaverschil met ongewijzigd peptide), zal het waarschijnlijker ontvankelijk zijn voor dit protocol. Deze methode kan vruchtbaar worden toegepast in biologische systemen waar sprake is van betekenisvolle heterogeniteit tussen cellen, zoals in differentiatie, senescentie of immunologische reacties (d.w.z. fagocytose).

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

We willen graag de herfst 2021 NSF I-Corps Program (Northeastern University site) award erkennen die deze publicatie heeft gefinancierd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plate, standard PCR plate Thermo Fisher Scientific AB1384 Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific A955-1 This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 271004-100ML This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils Thermo Fisher Scientific AB0626
Autosampler vial screw thread caps Thermo Fisher Scientific C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) MTC Bio C2595 This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease Sigma Aldrich E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm Thermo Fisher Scientific 60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade Thermo Fisher Scientific 85178 Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm Thermo Fisher Scientific C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol Sigma Aldrich 467804-50ML Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips Formulatrix MCLVPR2 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips Formulatrix MCLVS12 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler Formulatrix Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling Formulatrix 232400
MassPREP peptide mixture Waters 186002337 Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) USA Scientific 2621-0016 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips USA Scientific 1402-3900 If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free Thermo Fisher Scientific AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) Benchmark Scientific Model C2000 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) Biorad 1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg Thermo Fisher Scientific A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 Sigma Aldrich T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade Promega V5280 This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results.

Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer) VWR Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) VWR 97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific W6-1 All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Symmons, O., Raj, A. What's luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism. Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).
  2. Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics. The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).
  3. Levy, E., Slavov, N. Single cell protein analysis for systems biology. Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).
  4. Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition. Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22 (2021).
  5. Shaffer, S. M., et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature. 555 (7695), 274 (2018).
  6. Pan, D., Jia, D. Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024 (2021).
  7. Segerstolpe, Å, et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  8. Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas. Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).
  9. Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity. Frontiers in Immunology. 12, 751701 (2021).
  10. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  11. Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. Post-transcriptional regulation across human tissues. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535 (2017).
  12. Slavov, N. Unpicking the proteome in single cells. Science. 367 (6477), 512-513 (2020).
  13. Specht, H., Slavov, N. Transformative opportunities for single-cell proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).
  14. Slavov, N. Learning from natural variation across the proteomes of single cells. PLoS Biology. , (2021).
  15. Slavov, N. Driving single cell proteomics forward with innovation. Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).
  16. Specht, H., et al. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology. 22 (1), 50 (2021).
  17. Petelski, A. A., et al. Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2. Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).
  18. Slavov, N. Scaling up single-cell proteomics. Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179 (2022).
  19. Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
  20. Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).
  21. Specht, H., Slavov, N. Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers. Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).
  22. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161 (2018).
  23. Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics. BioRxiv. , at https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1.abstract (2018).
  24. Singh, A. Towards resolving proteomes in single cells. Nature Methods. 18 (8), 856 (2021).
  25. Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods. Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).
  26. Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. DART-ID increases single-cell proteome coverage. PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082 (2019).
  27. Cheung, T. K., et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).
  28. Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v1.abstract (2021).
  29. Vanderaa, C., Gatto, L. Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data. bioRxiv. , (2021).

Tags

Biologie Nummer 190
Eencellige proteomics voorbereiding voor massaspectrometrie-analyse met behulp van freeze-heat lysis en een isobare drager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petelski, A. A., Slavov, N., Specht, … More

Petelski, A. A., Slavov, N., Specht, H. Single-Cell Proteomics Preparation for Mass Spectrometry Analysis Using Freeze-Heat Lysis and an Isobaric Carrier. J. Vis. Exp. (190), e63802, doi:10.3791/63802 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter