Biology

Encellet proteomikkfremstilling for massespektrometrianalyse ved bruk av frysevarmelyse og en isobarisk bærer

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802

Aleksandra A. Petelski*¹, Nikolai Slavov^1,2,3, Harrison Specht*¹

¹Department of Bioengineering, Northeastern University, ²Barnett Institute, Northeastern University, ³Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

Summary

I denne protokollen beskriver vi hvordan man kan forberede pattedyrceller for encellet proteomikkanalyse via massespektrometri ved bruk av kommersielt tilgjengelige reagenser og utstyr, med muligheter for både manuell og automatisk pipettering.

Abstract

Encellet proteomikkanalyse krever sensitive, kvantitativt nøyaktige, allment tilgjengelige og robuste metoder. For å møte disse kravene ble Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) -protokollen utviklet som en andre generasjons metode for å kvantifisere hundrevis til tusenvis av proteiner fra begrensede prøver, ned til nivået av en enkelt celle. Eksperimenter ved hjelp av denne metoden har oppnådd kvantifisering av over 3,000 proteiner over 1,500 enkeltpattedyrceller (500-1,000 proteiner per celle) på 10 dager med massespektrometerinstrumenttid. SCoPE2 utnytter en frysevarmesyklus for cellelyse, unngår behovet for opprydding av enkeltceller og reduserer dermed prøvetap, samtidig som prøvepreparering fremskyndes og forenkling av automatiseringen. I tillegg bruker metoden en isobarisk bærer, som hjelper proteinidentifikasjon og reduserer prøvetap.

Denne videoprotokollen gir detaljert veiledning for å muliggjøre bruk av automatisert enkeltcellet proteinanalyse ved bruk av bare utstyr og reagenser som er allment tilgjengelige. Vi demonstrerer kritiske trinn i prosedyren for å forberede enkeltceller for proteomisk analyse, fra høsting til injeksjon til væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse. I tillegg blir seerne guidet gjennom prinsippene for eksperimentell design med isobarisk bærer, kvalitetskontroll for både isobarisk bærer og enkeltcellepreparater, og representative resultater med en diskusjon av begrensninger i tilnærmingen.

Introduction

Enkeltcelleanalyse er mye brukt til å studere nivået av heterogenitet i biologiske systemer som ellers ville være umerkelig ved bulkmålinger ^1,2,3. Et slikt cellulært mangfold kan ha funksjonelle konsekvenser som kan fremme forståelsen av integrerte biologiske prosesser, fra kreftcelleterapeutisk resistens ^4,5,6 til celle-til-celle heterogenitet i diabetes 7,8,9,10. Mange undersøkelser har fokusert på å måle nukleinsyrer i enkeltceller, ved å måle genetiske eller transkriptomiske nivåer og har gjort det mulig å klassifisere celletyper og tilstander. Slike fremskritt i nukleinsyrerommet kan imidlertid ikke fylle kunnskapsgapet i posttranskripsjonsregulering¹¹, noe som driver behovet for tilsvarende proteinmålinger med høy gjennomstrømning i enkeltceller^12,13,14,15.

Vi har utviklet SCoPE2^16,17 for å møte etterspørselen etter streng og robust encellet proteomikk av pattedyrsystemer. Det er en multiplekset metode, noe som muliggjør økt gjennomstrømning ved å merke og analysere mange celler parallelt¹⁸, i motsetning til etikettfrie mthods som analyserer en celle på tidspunktet^19,20. Prøveprepareringsmetoden, massespektrometritilnærmingen og påfølgende dataanalysetrinn muliggjør nøyaktig kvantifisering av hundrevis til tusenvis av proteiner per enkelt celle. Denne metoden gjør massespektrometrianalyse av enkeltceller mulig gjennom isobarisk bærer²¹, en liten bulkprøve av celler (vanligvis 25-200) som er biologisk lik enkeltcellepopulasjonen av interesse. Dette bærermaterialet er multiplekset i et sett med en referansekanal av samme materiale og enkeltceller ved bruk av tandemmassekoder (TMT-etiketter). Bærerkanalen reduserer prøvetapet til overflateområder og gir ioneryggradsfragmentene for vellykket peptididentifikasjon. Referansekanalen, som fremstilles i bulk og deretter fortynnes ned til 5-10 celleekvivalenter for hvert enkeltcellesett, bidrar til å kontrollere teknisk variabilitet i analysen. Spesielt tillater referansen normalisering av variabilitet forårsaket av LC-MS / MS-relaterte effekter, for eksempel ionprøvetaking og ioniseringseffektivitet. Vanligvis er referansen og bærerkanalene laget av samme cellepopulasjon.

Denne prøveprepareringsprotokollen er en andre generasjons metode som bygger på SCoPE-MS²² ved flere synergistiske forbedringer. Forbedringene inkluderer en cellelysemetode som unngår prøveopprydding, som er et vanlig trinn i MS-proteomikkpreparater. Den bruker mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)²³, som er en frysevarmelysemetode. Denne metoden muliggjorde lysis av enkeltceller i mindre volumer og i multiwellplater i stedet for i hetteglass, noe som muliggjorde en høyere gjennomstrømningshastighet og automatisering av termiske syklister. Til sammen har denne metoden senket kostnaden per enkelt celle og økt kvantitativ nøyaktighet sammenlignet med SCoPE-MS^16,24.

Denne protokollen beskriver hvordan man klargjør enkeltceller for proteomisk analyse, inkludert hvordan man klargjør bærer- og referansekanalene ved hjelp av TMTpro 18-plex isobariske etiketter. Pattedyrceller som er i encellet suspensjon og som kan isoleres i 384-brønnplater, er sannsynligvis mottagelige for denne protokollen. Også inkludert er representative resultater av vellykkede enkeltcellesett, som viser flere kvalitetskontrollplott generert av en R Shiny-app, DO-MS²⁵. Andre publiserte programvareverktøy 26,27 og eksperimentelle retningslinjer ^17,21 har forbedret vedtakelsen av denne protokollen. Vi håper denne visuelle veiledningen vil hjelpe forskere med å utføre encellede proteomikkeksperimenter.

Protocol

MERK: I denne protokollen er romtemperaturen (RT) 18-22 °C.

1. Generering av transportør og referansemateriale

Celle isolasjon
1. Samle celler av interesse i cellesuspensjoner i iskald 1x PBS.
  MERK: Om mulig bør bærer- og referansematerialet fremstilles fra cellepopulasjonen(e) som er valgt for å bli studert på enkeltcellenivå. Tilsvarende antall celler fra de forskjellige eksperimentelle tilstandene (som stimulerte og ustimulerte immunceller) bør utgjøre bæreren og referansen. I situasjoner der et stort nok antall av disse cellene ikke kan høstes, bør en egnet cellepopulasjon velges basert på biologisk likhet.
2. Ved hjelp av et hemocytometer eller andre metoder for celletelling (for eksempel FACS), telle antall celler i suspensjonen.
3. Spinn ned og resuspender 22 000 celler av hver celletype i 11 μL HPLC-klasse vann, separat i PCR-rør (standard 250 μL PCR-rør).
  MERK: Antall celler som anbefales her, er tilstrekkelig for bærerne og referansene for antall sett som kan fremstilles fra en 384-brønnplate full av enkeltceller. Celleinndataene i dette trinnet og reagensmengdene i påfølgende trinn kan skaleres proporsjonalt for et større antall sett. Hastigheten til å spinne ned er avhengig av cellekulturpraksisen til laboratoriet. En typisk spin down: 300 × g i 5 min.
4. Overfør prøvene til en fryser på -80 °C i minst 30 minutter.
  PAUSEPUNKT: Prøver kan forbli frosset i flere måneder uten konsekvenser for enkeltcelledata.
Cellelyse
1. Varm PCR-røret med cellene til 90 °C i 10 minutter (med termisk sykluslokk satt til 105 °C), og la deretter rørene avkjøles til 12 °C rett etter oppvarmingssyklusen.
2. Vortex røret kort, og deretter spinne ned i en benk-top PCR rør spinner på RT for å samle all væske i bunnen av røret.
3. I en vannbad sonicator, sonikere rørene i 5 minutter, og legg dem på is ved RT.
Trypsin fordøyelse
1. Tilsett 2,2 μL av masterblandingen (se tabell 1 for komponentene) til hvert prøverør mens du er på is.
  FORSIKTIG: Trypsin kan forårsake hud-, luftveis- og øyeirritasjon. Sørg for å bruke personlig verneutstyr. Håndtak under en kjemisk avtrekkshette.
2. Vortex rørene kort for å blande og spinne ned i en benk-topp PCR rør spinner på RT for å samle all væske på bunnen av hvert rør.
3. Varm opp prøvene ved 37 °C i 3 timer (med det termiske sykkellokket satt til 52 °C).
TMT merking reaksjon
1. Spinn ned prøvene etter fordøyelsen i en benk PCR-rørspinner på RT.
2. Del hver prøve i to like store mengder på 6,6 μL hver, slik at hvert rør inneholder 11 000 celler.
3. Til rørene som er ment for bæreren, tilsett 3,3 μL TMT-etikett 126 som har blitt resuspendert i en konsentrasjon på 85 mM.
4. Til rørene ment for referansen, tilsett 3,3 μL TMT-etikett 127N som har blitt resuspendert i en konsentrasjon på 85 mM.
5. Vortex rørene kort og spinn ned i en benk-top PCR rør spinner på RT for å samle væsken i bunnen.
6. La rørene stå i RT i 1 time.
Slukking av TMT-merkingsreaksjon
1. Tilsett 1,65 μL 0,5% hydroksylamin til hvert rør.
  FORSIKTIG: Hydroksylamin kan forårsake hudirritasjon. Sørg for å bruke personlig verneutstyr.
2. Vortex rørene kort og spinn ned i en benk-top PCR rør spinner på RT for å samle væsken i bunnen.
3. La rørene stå på RT i 30 min.
Kombinasjon av bærer og referanse
1. Hvis prøver som skal utgjøre bæreren er merket separat, bland dem i like forhold.
2. Hvis prøver som skal utgjøre referansen er merket separat, bland dem i like forhold.
3. Bland bæreren og referansen slik at den endelige konsentrasjonen av bæreren er 100-200 celler / μL, og referansekonsentrasjonen er 5-10 celler / μL.
4. Vurder kvaliteten på bære- og referansematerialene før du kombinerer dem med enkeltcellesett.
  MERK: Kvalitetskontroll av transportør og referansemateriale kan utføres ved hjelp av en rekke metoder, men det anbefales å bruke DO-MS-programvaren, tilgjengelig på do-ms.slavovlab.net¹⁷. Kritiske målinger av kvalitet inkluderer feilspaltningshastighet (<25%, en beregning beregnet som antall trygt identifiserte peptider med en savnet spaltning delt på antall trygt identifiserte peptider totalt) og merkingseffektivitet (>99%, en beregning beregnet som antall merkingssteder, nemlig peptidet N-terminus og lysin, med en etikett delt på totalt antall merkingssteder).
  PAUSEPUNKT: Bære- og referansematerialet kan oppbevares ved -80 °C til det er nødvendig.

Komponent	Bland konsentrasjon	Endelig konsentrasjon per rør
Trypsin Gull	50 ng/μL	8,33 ng/μL
TEAB, pH = 8,5	500 mM	83,33 mM
Benzonase nuklease	1,2 enheter	0,2 enheter

Tabell 1: Reagens mengde master mix. De endelige konsentrasjonene av reagenser som trengs for trypsinfordøyelse er oppført.

2. SCoPE2 prøvepreparering

Celle isolasjon
1. Suppler HPLC-grade vann med 25 fmol per peptid per μL av en syntetisk peptidløsning.
  MERK: Waters MassPrep peptidløsning er et eksempel på hva som kan brukes. Den består av syv peptider som ikke ioniserer veldig bra. Dette er et viktig aspekt ved denne løsningen: disse peptidene forstyrrer ikke nøyaktig massespektrometrikvantifisering av enkeltceller. Enhver høyt renset blanding av noen få peptider som sannsynligvis ikke er i prøvene av interesse, vil være hensiktsmessig.
2. Tilsett 1 μL av denne blandingen til hver brønn i en 384-brønnsplate ved hjelp av en væskedispenserende robot eller manuell pipette.
3. Forsegl platen og spinn den ned i en benkplatespinner ved RT for å samle væsken i bunnen.
  PAUSEPUNKT: Plater med denne oppløsningen kan oppbevares ved -80 °C til det er nødvendig.
4. Få en suspensjon av ufikserte celler som er disaggregert.
  MERK: Hvor nøyaktig cellesuspensjonen oppnås, er basert på celletypen av interesse. Her er brede eksempler:
  1. Suspensjonsceller: spinn ned cellene i en pellet, og fjern cellekulturmediet.
  2. Adherente celler: fjern cellene fra parabolen eller kolbe gjennom trypsinisering eller skraping. Spinn dem deretter ned for å fjerne cellekulturmediet.
5. Vask cellesuspensjonen to ganger med 1x iskald PBS. La cellene henge i 1x PBS etter den andre vasken.
6. Hvis 384-brønnsplaten var frossen, tine den ut på RT. Spinn den ned for å sikre at all væske er på bunnen av brønnene.
7. Bruk en cellesortering eller andre tilgjengelige midler, for eksempel manuell håndplukking, til å fordele enkeltceller i respektive brønner.
  MERK: Legg til enkeltceller i brønner mens du lar noen brønner stå tomme for negative og positive kontroller (se diskusjon). Ved bruk av flowcytometri, bruk lavest mulig flowrate for flowcytometeret. Lavere strømningshastighet antas å være mer skånsom for cellehåndtering. I tillegg bør dysestørrelsen være egnet for bruk med cellene av interesse. Det anbefales å samarbeide med et flowcytometrianlegg.
8. Legg til positive kontroller av 2-5 celleekvivalenter lysat til utvalgte brønner pipettert manuelt eller med væskehåndteringsroboter.
9. Forsegl og spinn ned platen med sorterte celler i en benkplatespinner ved RT for å samle væsken nederst. Frys platen ved -80 °C så snart som mulig.
  PAUSEPUNKT: Plater med sorterte enkeltceller kan lagres ved -80 °C til det er nødvendig.
Cellelyse
1. Ta 384-brønnsplaten med de sorterte enkeltcellene og legg den inn i termisk syklus så raskt som mulig.
2. Varm platen til 90 °C i 10 minutter (med lokktemperaturen satt til 105 °C), og la deretter platen avkjøles til 12 °C.
3. Spinn ned platen kort i en benk-top plate spinner på RT.
4. I en vannbad sonicator, sonikere platen i 5 minutter ved RT, og legg den deretter på is.
Trypsin fordøyelse
1. Forbered 100 μL av masterblandingen (se tabell 1 for komponenter) per 384-brønnplate.
2. Til hver brønn på 384-brønnplaten, tilsett 0,2 μL av masterblandingen fremstilt i trinn 2.3.1 ved bruk av en væskehåndterer.
  MERK: Bruk større volumer hvis manuell pipettering brukes, og sørg for at de endelige konsentrasjonene av reagenser fortsatt er de samme per brønn.
3. Forsegl platen, virvelen i 5 s, og spinn ned i en benkplatespinner på RT.
4. Varm opp platen med 384 brønner ved 37 °C (med lokktemperaturen satt til 52 °C) i 3 timer.
TMT merking reaksjon
1. Ta de 85 mM lagrene av TMT-etiketter (128N til 135N) ut av fryseren på -80 °C. Varm rørene til romtemperatur før du åpner dem.
2. Fortynn etikettene til 22 mM i vannfri acetonitril.
  FORSIKTIG: Acetonitril er en brannfarlig væske. Det kan irritere huden, øynene, luftveiene og sentralnervesystemet. Sørg for å bruke personlig verneutstyr. Håndtak under en kjemisk avtrekkshette.
3. Ved hjelp av denne merkingsstrategien legger du til 0,5 μL fortynnede TMT-etiketter til hver brønn på 384-brønnsplaten. Bruk enten en væskedispenserrobot (hvis du bruker en væskehåndterer, må du bruke tilhørende utstyr som er egnet for organiske løsemidler) eller en manuell pipette.
  MERK: Se tabell 2 for merkingsstrategien. Se tabell 3 for et eksempel på plateoppsett.
4. Forsegl platen, virvelen i 5 s, og spinn ned i en benkplatespinner på RT.
5. La merkereaksjonen fortsette ved RT i 1 time.
Slukking av TMT-merkingsreaksjon
1. Til hver brønn i 384-brønnplaten, tilsett 0,2 μL 0,5% hydroksylamin (fortynnet i HPLC-klasse vann) ved hjelp av en væskehåndterer.
  MERK: Bruk større volumer hvis manuell pipettering brukes, og sørg for at de endelige konsentrasjonene av reagenser fortsatt er de samme per brønn.
2. Forsegl platen, virvelen i 5 s, og spinn ned i en benkplatespinner på RT.
3. Oppbevar tallerkenen på RT i 30 min.
Klargjøring for LC-MS/MS-analyse: kombinasjon av enkeltceller og kontrollbrønner med bærer-/referansemateriale
1. Fjern det kombinerte bære-/referansematerialet fra fryseren på -80 °C.
2. For hvert sett pipetter du 1 μL bære- og referansemateriale inn i den første brønnen som vil være en del av et enkelt sett. Pipette hele volumet av den første brønnen til den påfølgende brønnen. Fortsett pipettering av hele volumet fra en celle til den neste til alle brønnene som skal inkluderes i et enkelt sett er kombinert i den endelige brønnen.
  MERK: Bærer- og referansematerialet skal ha en konsentrasjon på henholdsvis 200- og 5-cellers ekvivalenter, men som diskutert tidligere²¹, kan disse mengdene variere. Hvert sett, som beskrevet i merkingsstrategien (se tabell 2), skal inneholde bærer-, referanse- og opptil 12 eller 14 enkeltcelle- eller kontrollprøver ved bruk av henholdsvis TMTpro-16plex eller TMTpro-18plex (se trinn 2.4.3).
3. For hvert sett, tilsett 5 μL 50% acetonitril (fortynnet i HPLC-klasse vann) til den første enkeltcellebrønnen som skal inkluderes i hvert sett. Pipet hele volumet fra første brønn til påfølgende brønn. Fortsett pipettering av hele volumet fra en celle til den neste til alle brønnene som skal inkluderes i et enkelt sett er kombinert i den endelige brønnen.
  MERK: Dette vasketrinnet kan hjelpe til med prøveutvinning fra brønnene.
4. Overfør hvert sett til sine individuelle autosampler glassinnsatser.
  MERK: Disse settene kan også kombineres i enkeltbrønner i en 384-brønnplate og plasseres direkte i autosampleren for injeksjon²⁸.
5. Når alle settene er kombinert og plassert i glassinnlegg, tørk prøvene.
  PAUSEPUNKT: Tørkede sett kan oppbevares ved -80 °C i minst 1 uke før de kjøres på et massespektrometer.
6. Før LC-MS/MS-analysen, tilsett 1,2 μL 0,1 % maursyre (fortynnet i HPLC-klassifisert vann) til hvert sett for å resuspendere de merkede peptidene.
  FORSIKTIG: Maursyre er en brannfarlig væske. Det kan forårsake alvorlig øyeskade eller hudforbrenninger. Sørg for å bruke personlig verneutstyr. Håndtak i et godt ventilert område.
7. Plasser autosamplerinnsatsene i hetteglass med automatisk prøvetaker og lukk hver prøve med en hette.
8. Vortex hvert hetteglass i 5 s for å sikre at resuspendering er fullført, og spinn deretter ned i en hetteglassspinner ved RT.
9. Forsikre deg om at hver prøve er nederst på innsatsen, i stedet for å sprute på sidene.
10. Plasser hetteglassene i autosamplerbrettet.
11. For hvert sett, injiser 1 μL for LC-MS / MS analyse.

Etikett	126	127N	127C	128N	128C	129N	129C	130N	130C	....	135N
Eksempel Type	Bærer	Referanse	Tom	Tom	SC/kontroll	SC/kontroll	SC/kontroll	SC/kontroll	SC/kontroll	....	SC/kontroll

Tabell 2: Eksempel på SCoPE2 TMTpro-18plex merkingsskjema. Transportøren og referansen er vanligvis merket i de to første TMT-etikettene. Deretter hoppes de neste to etikettene på grunn av potensiell isotopforurensning som vil gjøre kvantifiseringen mindre nøyaktig. De andre etikettene som er igjen, er for enkeltceller eller kontroller.

128C

129N

129C

130N

130C

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

128C

129N

129C

130N

130C

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

Jeg

Tabell 3: Eksempel på plateoppsett for merking med TMTpro-16plex. Ved hjelp av et 384-brønns plateformat (eller et hvilket som helst annet plateformat) er det viktig å randomisere brønnene der cellene er sortert i. Et annet plateoppsett vil bli brukt for TMTpro-18plex.

Representative Results

Positive resultater fra protokollen innebærer å verifisere at en rekke kritiske trinn i protokollen er vellykket utført; disse inkluderer forberedelse av bæreren, encellet isolasjon, lysis, fordøyelse, strekkodemerking og MS-parameteroptimalisering. DO-MS-plott gjør det enkelt å vurdere fullføringen av hvert kritiske trinn i protokollen. En vellykket forberedt bærer, som vanligvis tilsvarer 25 og 200 celler i mengde (per sett), er godt fordøyd og godt merket. Tomter fra DO-MS tillater kvantifisering av prøvens intensitet (for å estimere mengden), fordøyelseseffektiviteten (ideelt <25% feil, og merkingseffektiviteten (må være >99%). Mest kritisk kan bærerprøver som ikke er fullstendig merket, tillate kryssreaksjonen med strekkodene beregnet på enkeltceller og legge til et falskt signal til kvantifisering av enkeltcellepeptider.

Negative kontrollbrønner inkluderer alle eksperimentelle reagenser, men mangler en celle. Dette gjør det mulig å vurdere ikke bare bakgrunnsstøy, men også celleisolasjonseffektiviteten ved å gi et representativt signal om en tom brønn. DO-MS-rapporten tilbyr plott for å vurdere det målte signalet til kontrollbrønnen sammen med enkeltcellebrønnene for å bestemme suksessen til celleisolasjon og bakgrunnsstøy. I tillegg kan kvaliteten på kvantifiseringen vurderes ved hjelp av SCoPE2-rørledningen (tilgjengelig på GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) eller SCP Bioconductor-pakken²⁹.

Fordøyelses- og merkingseffektiviteten til enkeltcellene kan ikke analyseres direkte som med bæreren, men DO-MS gir igjen plott som tillater estimering av fordøyelsen og merkingseffektiviteten. Ved å inkludere en kontroll av 100-200 celler sammen med fremstillingen av enkeltcellene (dvs. motta alle de samme reagenstilsetningene), kan fordøyelses- og merkingseffektiviteten vurderes for den kontrollen, og antas å bli delt av enkeltcellene som er forberedt ved siden av. Dårlig fordøyelse vil indikeres av et høyt forhold mellom intensiteten av feilspaltede peptider og deres fullstendig spaltede kolleger (figur 1).

En annen faktor å vurdere i settene er andelen manglende data og median reporterionintensitet i hver TMT-kanal (figur 2). Når enkeltceller er vellykket forberedt, er mengden manglende data per celle og positiv kontroll mye lavere enn i negative kontrollprøver. På samme måte er medianintensiteten til forløpere mye høyere i enkeltceller og positive kontroller enn for negative kontroller. Optimalisering av MS-parametere har blitt diskutert mye andre steder²¹, og optimale parametere kan bestemmes ved hjelp av verktøy som DO-MS eller SCP Companion^25,27.

Figur 1: Kvalitetskontroll av transportørforberedelse. DO-MS-plott som viser (A) merkingseffektiviteten til en vellykket forberedt bærer på steder for merking med TMT: det primære aminet på sidekjeden av lysin og peptidet N-terminalen, og (B) fordøyelseseffektiviteten ved aminosyrerester av tryptisk spaltning. Forkortelse: TMT = tandem masse tag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Kvalitetskontroll av klargjøring av encellede celler. DO-MS-plott som viser (A) brøkdelen av manglende data i enkeltceller (C5-10), kontroller (C13,16), bærer (C1) og referanse (C2) og (B) intensiteten til enkeltceller og kontroller. Kodene 127C, 128N, 131C, 132N, 133N og 133C, som tilsvarer C3, C4, C11, C12 og C15, brukes ikke i dette bestemte settet. Den positive kontrollen består av cellulært materiale behandlet til peptider i bulk, deretter fortynnet til et nivå på 2-5 celler / μL før merking. Den negative kontrollen består av en brønn utsatt for alle forberedende trinn som brukes til enkeltceller, bare uten tilsetning av en enkelt celle. Forkortelse: TMT = tandem masse tag. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

En av nøklene til vellykket forberedelse og analyse av enkeltceller av SCoPE2 er fremstillingen av bærer- og referansekanalene. Den foreslåtte bærerstørrelsen er 100 til 200 celler; Imidlertid kan antall celler som trengs for et bestemt enkeltcelleeksperiment bestemmes basert på prinsipper som diskutert andre steder²¹. For den foreslåtte størrelsen er det nødvendig med minst ~ 11 275 celler per 384-brønnplate, noe som muliggjør en 200-cellers bærer og 5-cellers referanse i hvert sett. Det kan være fordelaktig å isolere flere celler hvis de ønskede cellepopulasjonene ikke er en begrensende faktor, for ganske enkelt å ha ekstra materiale i tilfelle feil (som det ble gjort i denne protokollen, isolere 22 000 celler i stedet for 11 275 celler). Mengden bærer og referanse som trengs for antall ønskede plater, bør fremstilles i en enkelt batch for å minimere enhver batch-til-batch-variasjon som kan føre til at peptididentifikasjon eller kvantifisering varierer mellom batcher.

Før du isolerer enkeltceller i brønner på en 384-brønnplate, er det viktig å vurdere utformingen av plateoppsettet. Innenfor hver 384-brønnplate anbefales det å implementere både positive og negative kontroller. Negative kontroller er brønner der ingen celler legges til, men gjennomgår de samme reagenstilleggene og prosedyrene som enkeltcellebrønnene. Positive kontroller er brønner der cellelysat fortynnet til 2-5 celler/μL tilsettes i stedet for enkeltceller. Dette er spesielt viktig å implementere når encellede isolasjonsmetoder ikke er godt validert. Hver 384-brønnplate bør ideelt sett ha en randomisert fordeling av enkeltceller og kontroller (f.eks. ikke ha negative eller positive kontroller i bare en rad). Hver plate skal ha en lik fordeling av alle cellepopulasjoner av interesse, i stedet for å isolere en celletype i en plate og en annen celletype i en annen plate. Dette vil unngå å knytte batcheffekter med celletyper av interesse. I tillegg, hvis mer enn en 384-brønnplate er nødvendig for analyse, anbefales det å isolere celler i en enkelt økt, i stedet for å spre isolasjonstrinnet over flere dager, om mulig.

Lysis av både enkeltceller og bærer/referanse foregår i vann gjennom en fryse-varmesyklus²³. Det forventes at de fleste proteaser har blitt denaturert i løpet av dette trinnet. Trypsin tilsettes deretter umiddelbart etter denatureringstrinnet ved høy konsentrasjon, mange størrelsesordener større i konsentrasjon enn selv de mest tallrike cellulære proteaser. Ved massehandling vil de fleste produkter av proteaseaktivitet skyldes trypsin.

Reduksjon/alkylering av cysteinrester utføres ikke i denne protokollen før trypsinfordøyelse. Cysteinholdige peptider representerer omtrent 10% av tryptiske peptider fra det humane proteomet. Vi observerer færre cysteinholdige peptider ved hjelp av en tilnærming uten reduksjon/alkylering. Disse trinnene bruker reagenser som er uforenlige med merking av TMT (NHS-ester kjemi) umiddelbart etter fordøyelsen.

I denne TMT-merkingsstrategien er bæreren og referansene merket med henholdsvis 126 og 127N, mens enkeltcelle- og kontrollbrønner er merket med 128C til 135N. De to etikettene etter referansen, 127C og 128N, brukes ikke på grunn av isotopisk krysskontaminering som oppstår fra bærer- og referansekanalene, som er klart mye mer rikelig i peptidmateriale enn enkeltcellene. Totalt er det 12 TMT-kanaler per sett som kan brukes til merking av enkeltceller eller kontrollbrønner med TMTpro-16plex, eller 14 TMT-kanaler per sett med TMTpro-18plex.

De kritiske trinnene i protokollen for å utføre enkeltcelleproteomikkmålinger ved hjelp av denne protokollen inkluderer fremstilling av bæreren, encellet isolasjon, lysis, fordøyelse, strekkodemerking og riktige massespektrometriparametere. Disse trinnene er skissert i dette dokumentet og har blitt grundig beskrevet andre steder 17,21,25. Hvert trinn har et tilsvarende plott eller sett med plott i DO-MS som gir enkel kvalitetskontroll. For eksempel, ved vellykket opprettelse av bæreren, tillater tomter som viser antall identifiserte peptider, merkingseffektiviteten og prosentandelen av feilspaltningshastighet verifisering av vellykket forberedelse. Representative DO-MS-rapporter er inkludert i denne publikasjonen og kan sees på http://scope2.slavovlab.net/ for de opprinnelige dataene¹⁶. Disse DO-MS-rapportene gjør det mulig å vurdere optimalisering av metoden i retninger som ennå ikke er undersøkt av forfatterne, for eksempel lengre LC-gradienter, forskjellige fordøyelsesenzymer eller alternative kjemiske strekkoder.

For tiden begrenser seriell analyse av peptider ved dataavhengige innsamlingsalgoritmer antall peptider som kan analyseres i en LC-kjøring av rimelig lengde. Dette skyldes delvis de lengre fyllingstidene som kreves for vellykket oppkjøp av nok ioner for pålitelig enkeltcellekvantifisering²¹. En iboende begrensning ved bruk av bæreren er mangelen på direkte vurdering av fordøyelsen og merkingseffektiviteten til enkeltcellene. For øyeblikket er en løsning på denne begrensningen å utføre kvalitetskontroll på en større prøve behandlet sammen med enkeltcellene.

Vi foreslo en rekke muligheter for å forbedre encellet proteomikk, for eksempel å bygge massespektrometre med flere analysatorer. Den nåværende metoden tillater kvantifisering av tusenvis av proteiner fra enkeltpattedyrceller med en hastighet på ca. 100 celler per dag med kommersielt tilgjengelige reagenser og utstyr. SCoPE2, den andre generasjonen av SCoPE-MS-tilnærmingen, forbedret forgjengeren betydelig med hensyn til antall celler som kan analyseres per tidsenhet, antall proteiner som kan analyseres per tidsenhet, tiden som trengs for prøvepreparering, tilgjengeligheten av reagenser og utstyr, og den totale kostnaden for forberedelse og analyse per enkelt celle. Membranbundne proteiner er tilgjengelige ved hjelp av frysevarmelyse og proteasefordøyelse, som vist i forhold til urea lysis²³. Metoden identifiserer mange proteiner fra den øverste tredjedelen av proteomet med hensyn til overflod¹⁶. Hvis den modifiserte proteoformen er i den øverste tredjedelen av proteomet, og det modifiserte peptidet er egnet til massespektrometrianalyse (ioniserer godt, har en masseforskjell fra umodifisert peptid), vil det mer sannsynlig være mottagelig for denne protokollen. Denne metoden kan brukes fruktbart i biologiske systemer der det er meningsfull heterogenitet blant celler, for eksempel i differensiering, senescence eller immunologiske responser (dvs. fagocytose).

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi ønsker å anerkjenne høsten 2021 NSF I-Corps Program (Northeastern University site) prisen som har finansiert denne publikasjonen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plate, standard PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB1384	Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	A955-1	This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8%	Sigma Aldrich	271004-100ML	This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils	Thermo Fisher Scientific	AB0626
Autosampler vial screw thread caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5)	MTC Bio	C2595	This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease	Sigma Aldrich	E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade	Thermo Fisher Scientific	85178	Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol	Sigma Aldrich	467804-50ML	Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips	Formulatrix	MCLVPR2	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips	Formulatrix	MCLVS12	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler	Formulatrix		Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling	Formulatrix	232400
MassPREP peptide mixture	Waters	186002337	Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes)	USA Scientific	2621-0016	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips	USA Scientific	1402-3900	If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge)	Benchmark Scientific	Model C2000	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module)	Biorad	1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg	Thermo Fisher Scientific	A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5	Sigma Aldrich	T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade	Promega	V5280	This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer)	VWR	Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer)	VWR	97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	W6-1	All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .