이 프로토콜에서는 수동 및 자동 피펫팅 옵션과 함께 상용 시약 및 장비를 사용하여 질량분석 법을 통해 단일 세포 단백질체학 분석을 위해 포유류 세포를 준비하는 방법을 설명합니다.
단일 세포 단백질체학 분석에는 민감하고 정량적으로 정확하며 널리 접근 가능하고 강력한 분석법이 필요합니다. 이러한 요구 사항을 충족하기 위해 단일 세포 단백질체학(SCoPE2) 프로토콜은 제한된 샘플에서 단일 세포 수준까지 수백에서 수천 개의 단백질을 정량화하는 2세대 방법으로 개발되었습니다. 이 방법을 사용한 실험은 질량 분석기 기기 시간 10 일 만에 1,500 개의 단일 포유류 세포 (세포 당 500-1,000 개의 단백질)에서 3,000 개 이상의 단백질을 정량화하는 데 성공했습니다. SCoPE2는 세포 용해를 위한 동결-열 주기를 활용하여 단일 세포를 세척할 필요가 없으며 결과적으로 시료 손실을 줄이는 동시에 시료 준비를 가속화하고 자동화를 단순화합니다. 또한이 방법은 단백질 식별을 돕고 샘플 손실을 줄이는 등압 캐리어를 사용합니다.
이 비디오 프로토콜은 널리 접근할 수 있는 장비와 시약만 사용하여 자동화된 단일 세포 단백질 분석을 채택할 수 있도록 자세한 지침을 제공합니다. 자사는 수확에서 주입, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 분석에 이르기까지 단백질체학 분석을 위한 단일 세포 준비 절차의 중요한 단계를 보여줍니다. 또한 시청자는 등압 담체를 사용한 실험 설계의 원칙, 등압 담체 및 단일 세포 제제 모두에 대한 품질 관리, 접근 방식의 한계에 대한 논의와 함께 대표 결과를 안내합니다.
단일 세포 분석은 대량 측정 1,2,3으로 식별 할 수없는 생물학적 시스템 내의 이질성 수준을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 이러한 세포 다양성은 암세포 치료 내성 4,5,6에서 당뇨병 7,8,9,10의 세포 간 이질성에 이르기까지 완전한 생물학적 과정에 대한 이해를 증진시킬 수있는 기능적 결과를 가질 수 있습니다. 많은 연구가 유전 적 또는 전사체 수준을 측정하여 단일 세포의 핵산을 측정하는 데 초점을 맞추고 세포 유형 및 상태의 분류를 가능하게했습니다. 그러나, 핵산 공간에서의 이러한 진보는 전사 후 조절(11)의 지식 격차를 메울 수 없으며, 이는 단일 세포(12,13,14,15)에서 유사하게 고처리량 단백질 측정의 필요성을 야기한다.
당사는 포유류 시스템의 엄격하고 강력한 단일 세포 단백질체학에 대한 요구를 해결하기 위해 SCoPE216,17을 개발했습니다. 이는 멀티플렉스 방법으로, 시간19,20에서 하나의 셀을 분석하는 표지가 없는 mthod와 달리 병렬로 많은 세포를 라벨링하고 분석하여 처리량을 증가시킬 수 있습니다. 샘플 준비 방법론, 질량 분석 접근법 및 후속 데이터 분석 단계를 통해 단일 세포당 수백에서 수천 개의 단백질을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 관심있는 단일 세포 집단과 생물학적으로 유사한 세포의 작은 벌크 샘플 (일반적으로 25-200)인 등압 담체(21)를 통해 단일 세포의 질량 분석법을 가능하게합니다. 이 캐리어 재료는 탠덤 질량 태그 (TMT 라벨)를 사용하여 동일한 재료 및 단일 셀의 기준 채널이있는 세트로 다중화됩니다. 캐리어 채널은 표면적에 대한 샘플 손실을 줄이고 성공적인 펩타이드 식별을 위한 이온 백본 단편을 제공합니다. 벌크로 준비된 후 각 단일 셀 세트에 대해 5-10 셀 당량으로 희석되는 기준 채널은 분석의 기술적 변동성을 제어하는 데 도움이 됩니다. 특히, 이 기준은 이온 샘플링 및 이온화 효율과 같은 LC-MS/MS 관련 효과로 인한 변동성의 정규화를 허용합니다. 보통, 기준 및 캐리어 채널은 동일한 세포 집단으로부터 이루어진다.
이 샘플 준비 프로토콜은 SCoPE-MS22를 기반으로 여러 시너지 개선을 통해 구축된 2세대 분석법입니다. 개선 사항에는 MS 단백질체학 제제의 일반적인 단계인 샘플 세척을 피하는 세포 용해 방법이 포함됩니다. 동결 열 용해 방법인 mPOP(최소 단백질체 시료 준비)23을 사용합니다. 이 방법은 바이알이 아닌 더 작은 부피와 멀티웰 플레이트에서 단일 세포의 용해를 가능하게 하여 열 순환기에 의한 더 높은 처리 속도와 자동화를 촉진했습니다. 전체적으로 이 방법은 SCoPE-MS16,24에 비해 단일 셀당 비용을 낮추고 정량적 정확도를 높였습니다.
이 프로토콜은 TMTpro 18-plex 등압 라벨을 사용하여 캐리어 및 기준 채널을 준비하는 방법을 포함하여 단백질체 분석을 위해 단일 세포를 준비하는 방법을 설명합니다. 단일 세포 현탁액에 있고 384-웰 플레이트로 분리될 수 있는 포유류 세포는 이 프로토콜에 적합할 가능성이 높습니다. 또한 R Shiny 앱인 DO-MS25에서 생성된 여러 품질 관리 플롯을 표시하는 성공적인 단일 셀 세트의 대표적인 결과가 포함되어 있습니다. 다른 공개된 소프트웨어 도구(26,27) 및 실험 지침(17,21)은 이 프로토콜의 채택을 개선하였다. 이 시각적 가이드가 연구자들이 단일 세포 단백질체학 실험을 수행하는 데 도움이 되기를 바랍니다.
SCoPE2에 의한 단일 세포의 성공적인 준비 및 분석의 열쇠 중 하나는 캐리어 및 기준 채널의 준비입니다. 제안된 담체 크기는 100 내지 200 셀이고; 그러나, 특정 단일-세포 실험에 필요한 세포의 수는 다른 곳에서 논의된 바와 같은 원리들에 기초하여 결정될 수 있다(21). 제안된 크기의 경우 384웰 플레이트당 최소 ~11,275개의 셀이 필요하므로 각 세트에서 200셀 캐리어 및 5셀 참조가 가능합니다. 원하는 세포 집단이 제한 요소가 아닌 경우 더 많은 세포를 분리하고 실수의 경우 단순히 추가 물질을 갖는 것이 유리할 수 있습니다(이 프로토콜에서 수행된 것처럼 11,275개 세포 대신 22,000개 세포 분리). 원하는 플레이트의 수에 필요한 캐리어 및 기준의 양은 펩타이드 식별 또는 정량화가 배치 간에 다를 수 있는 배치 간 변동을 최소화하기 위해 단일 배치로 준비되어야 합니다.
단일 셀을 384웰 플레이트의 웰로 분리하기 전에 플레이트 레이아웃의 설계를 고려하는 것이 중요합니다. 각 384웰 플레이트 내에서 양성 및 음성 대조군을 모두 구현하는 것이 좋습니다. 음성 대조군은 세포가 추가되지 않았지만 단일 세포 웰과 동일한 시약 추가 및 절차를 거치는 웰입니다. 양성 대조군은 단일 세포 대신 2-5 cells/μL로 희석된 세포 용해물이 첨가된 웰입니다. 이는 단일 셀 격리 방법이 잘 검증되지 않은 경우 구현하는 데 특히 중요합니다. 각각의 384-웰 플레이트는 이상적으로 단일 세포 및 대조군의 무작위 분포를 가져야 한다(예를 들어, 단지 한 행에 음성 또는 양성 대조군이 없음). 각 플레이트는 한 플레이트에서 하나의 세포 유형을 분리하고 두 번째 플레이트에서 두 번째 세포 유형을 분리하는 대신 관심 있는 모든 세포 집단의 균등한 분포를 가져야 합니다. 이렇게 하면 배치 효과를 관심 있는 셀 유형과 연결하는 것을 방지할 수 있습니다. 또한 분석을 위해 하나 이상의 384웰 플레이트가 필요한 경우 가능하면 분리 단계를 며칠에 걸쳐 분산하는 대신 단일 세션에서 세포를 분리하는 것이 좋습니다.
단일 세포 및 담체/기준 모두의 용해는 동결-열 사이클(23)을 통해 물에서 일어난다. 대부분의 프로테아제는 이 단계 동안 변성될 것으로 예상됩니다. 그런 다음 트립신은 변성 단계 직후에 고농도로 첨가되며, 이는 가장 풍부한 세포 프로테아제보다 훨씬 더 높은 농도입니다. 대량 작용에 의해, 프로테아제 활성의 대부분의 생성물은 트립신 때문일 것이다.
시스테인 잔기의 환원/알킬화는 트립신 소화 전에 이 프로토콜에서 수행되지 않습니다. 시스테인 함유 펩타이드는 인간 프로테옴에서 트립신 펩타이드의 약 10%를 차지합니다. 우리는 환원/알킬화가 없는 접근법을 사용하여 더 적은 수의 시스테인 함유 펩타이드를 관찰합니다. 이 단계는 소화 직후 TMT(NHS-에스테르 화학)에 의한 라벨링과 호환되지 않는 시약을 사용합니다.
이 TMT 라벨링 전략에서, 담체 및 참조는 각각 126 및 127N으로 표지되는 반면, 단일 셀 및 대조군 웰은 128C 내지 135N으로 표지된다. 기준 뒤의 두 라벨인 127C 및 128N은 단일 세포보다 펩타이드 물질이 훨씬 더 풍부한 캐리어 및 기준 채널에서 발생하는 동위원소 교차 오염으로 인해 사용되지 않습니다. 총 세트당 12개의 TMT 채널이 있어 TMTpro-16plex로 단일 셀 또는 제어 웰을 라벨링하는 데 사용할 수 있으며, TMTpro-18plex를 사용하여 세트당 14개의 TMT 채널이 있습니다.
이 프로토콜을 사용하여 단일 세포 단백질체학 측정을 수행하기 위한 프로토콜의 중요한 단계에는 캐리어 준비, 단일 세포 분리, 용해, 분해, 바코드 라벨링 및 적절한 질량 분석 파라미터가 포함됩니다. 이러한 단계는 이 문서에 요약되어 있으며 17,21,25의 다른 곳에서 광범위하게 자세히 설명되어 있습니다. 각 단계에는 DO-MS에 해당하는 플롯 또는 플롯 세트가 있어 품질 관리가 용이합니다. 예를 들어, 담체의 성공적인 생성의 경우, 확인된 펩티드의 수, 표지 효율 및 절단 속도의 백분율을 나타내는 플롯은 그의 성공적인 제제의 검증을 허용한다. 대표적인 DO-MS 보고가 이 간행물에 포함되어 있고, 원본 데이터(16)에 대해 http://scope2.slavovlab.net/ 에서 볼 수 있다. 이러한 DO-MS 보고서를 통해 더 긴 LC 구배, 다른 소화 효소 또는 대체 화학 바코드와 같이 저자가 아직 조사하지 않은 방향으로 방법의 최적화를 평가할 수 있습니다.
현재, 데이터 의존적 획득 알고리즘에 의한 펩타이드의 연속 분석은 합리적인 길이의 LC 실행에서 분석할 수 있는 펩타이드의 수를 제한합니다. 이는 부분적으로 신뢰할 수 있는 단일 세포 정량화를 위한 충분한 이온의 성공적인 획득에 필요한 더 긴 충전 시간 때문입니다21. 담체 사용에 대한 본질적인 한계는 단일 세포의 소화 및 표지 효율에 대한 직접적인 평가가 부족하다는 것이다. 현재 이러한 제한에 대한 한 가지 해결책은 단일 세포와 함께 처리된 더 큰 샘플에 대해 품질 관리를 수행하는 것입니다.
우리는 여러 분석기로 질량분석기를 구축하는 것과 같이 단일 세포 단백질체학을 개선할 수 있는 여러 기회를 제안했습니다. 현재의 방법은 상업적으로 이용 가능한 시약 및 장비를 사용하여 하루에 약 100 세포의 속도로 단일 포유류 세포에서 수천 개의 단백질을 정량화 할 수 있습니다. SCoPE-MS 접근법의 2세대인 SCoPE2는 단위 시간당 분석 가능한 세포 수, 단위 시간당 분석 가능한 단백질 수, 샘플 준비에 필요한 시간, 시약 및 장비의 접근성, 단일 세포당 전체 준비 및 분석 비용 측면에서 이전 제품에 비해 크게 개선되었습니다. 막-결합된 단백질은 우레아 용해23과 비교하여 나타낸 바와 같이 동결열 용해 및 프로테아제 소화를 사용하여 접근가능하다. 상기 방법은 풍부도16과 관련하여 프로테옴의 상위 1/3로부터 많은 단백질을 확인한다. 변형된 단백질형이 프로테옴의 상위 3분의 1에 있고 변형된 펩타이드가 질량 분석 가능하면(이온화는 양호하고 변형되지 않은 펩타이드와 질량 차이가 있음) 이 프로토콜에 복종할 가능성이 더 높습니다. 이 방법은 분화, 노화 또는 면역 학적 반응 (즉, 식균 작용)과 같이 세포간에 의미있는 이질성이있는 생물학적 시스템에 유익하게 적용될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 출판물에 자금을 지원한 2021년 가을 NSF I-Corps 프로그램(노스이스턴 대학교 사이트) 상을 인정하고 싶습니다.
384-well plate, standard PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB1384 | Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | A955-1 | This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 271004-100ML | This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
Adhesive PCR plate foils | Thermo Fisher Scientific | AB0626 | |
Autosampler vial screw thread caps | Thermo Fisher Scientific | C5000-51B | |
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) | MTC Bio | C2595 | This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials. |
Benzonase nuclease | Sigma Aldrich | E1014-25KU | |
Clear glass screw thread vials, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | 60180-509 | |
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade | Thermo Fisher Scientific | 85178 | Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area. |
Glass autosampler inserts, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | C4010-630 | |
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol | Sigma Aldrich | 467804-50ML | Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment. |
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips | Formulatrix | MCLVPR2 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels. |
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips | Formulatrix | MCLVS12 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels. |
Mantis microfluidic liquid handler | Formulatrix | Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples. | |
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling | Formulatrix | 232400 | |
MassPREP peptide mixture | Waters | 186002337 | Mixture of nine nontryptic peptides |
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) | USA Scientific | 2621-0016 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes. |
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-3900 | If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) | Benchmark Scientific | Model C2000 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells. |
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) | Biorad | 1851138 | |
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg | Thermo Fisher Scientific | A44520 | |
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 | Sigma Aldrich | T7408100ML | |
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
Vortex (Analog vortex mixer) | VWR | Model 58816-121 | |
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) | VWR | 97043964 | |
Water, Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | W6-1 | All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality . |