I denne protokollen beskriver vi hvordan man kan forberede pattedyrceller for encellet proteomikkanalyse via massespektrometri ved bruk av kommersielt tilgjengelige reagenser og utstyr, med muligheter for både manuell og automatisk pipettering.
Encellet proteomikkanalyse krever sensitive, kvantitativt nøyaktige, allment tilgjengelige og robuste metoder. For å møte disse kravene ble Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) -protokollen utviklet som en andre generasjons metode for å kvantifisere hundrevis til tusenvis av proteiner fra begrensede prøver, ned til nivået av en enkelt celle. Eksperimenter ved hjelp av denne metoden har oppnådd kvantifisering av over 3,000 proteiner over 1,500 enkeltpattedyrceller (500-1,000 proteiner per celle) på 10 dager med massespektrometerinstrumenttid. SCoPE2 utnytter en frysevarmesyklus for cellelyse, unngår behovet for opprydding av enkeltceller og reduserer dermed prøvetap, samtidig som prøvepreparering fremskyndes og forenkling av automatiseringen. I tillegg bruker metoden en isobarisk bærer, som hjelper proteinidentifikasjon og reduserer prøvetap.
Denne videoprotokollen gir detaljert veiledning for å muliggjøre bruk av automatisert enkeltcellet proteinanalyse ved bruk av bare utstyr og reagenser som er allment tilgjengelige. Vi demonstrerer kritiske trinn i prosedyren for å forberede enkeltceller for proteomisk analyse, fra høsting til injeksjon til væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse. I tillegg blir seerne guidet gjennom prinsippene for eksperimentell design med isobarisk bærer, kvalitetskontroll for både isobarisk bærer og enkeltcellepreparater, og representative resultater med en diskusjon av begrensninger i tilnærmingen.
Enkeltcelleanalyse er mye brukt til å studere nivået av heterogenitet i biologiske systemer som ellers ville være umerkelig ved bulkmålinger 1,2,3. Et slikt cellulært mangfold kan ha funksjonelle konsekvenser som kan fremme forståelsen av integrerte biologiske prosesser, fra kreftcelleterapeutisk resistens 4,5,6 til celle-til-celle heterogenitet i diabetes 7,8,9,10. Mange undersøkelser har fokusert på å måle nukleinsyrer i enkeltceller, ved å måle genetiske eller transkriptomiske nivåer og har gjort det mulig å klassifisere celletyper og tilstander. Slike fremskritt i nukleinsyrerommet kan imidlertid ikke fylle kunnskapsgapet i posttranskripsjonsregulering11, noe som driver behovet for tilsvarende proteinmålinger med høy gjennomstrømning i enkeltceller12,13,14,15.
Vi har utviklet SCoPE216,17 for å møte etterspørselen etter streng og robust encellet proteomikk av pattedyrsystemer. Det er en multiplekset metode, noe som muliggjør økt gjennomstrømning ved å merke og analysere mange celler parallelt18, i motsetning til etikettfrie mthods som analyserer en celle på tidspunktet19,20. Prøveprepareringsmetoden, massespektrometritilnærmingen og påfølgende dataanalysetrinn muliggjør nøyaktig kvantifisering av hundrevis til tusenvis av proteiner per enkelt celle. Denne metoden gjør massespektrometrianalyse av enkeltceller mulig gjennom isobarisk bærer21, en liten bulkprøve av celler (vanligvis 25-200) som er biologisk lik enkeltcellepopulasjonen av interesse. Dette bærermaterialet er multiplekset i et sett med en referansekanal av samme materiale og enkeltceller ved bruk av tandemmassekoder (TMT-etiketter). Bærerkanalen reduserer prøvetapet til overflateområder og gir ioneryggradsfragmentene for vellykket peptididentifikasjon. Referansekanalen, som fremstilles i bulk og deretter fortynnes ned til 5-10 celleekvivalenter for hvert enkeltcellesett, bidrar til å kontrollere teknisk variabilitet i analysen. Spesielt tillater referansen normalisering av variabilitet forårsaket av LC-MS / MS-relaterte effekter, for eksempel ionprøvetaking og ioniseringseffektivitet. Vanligvis er referansen og bærerkanalene laget av samme cellepopulasjon.
Denne prøveprepareringsprotokollen er en andre generasjons metode som bygger på SCoPE-MS22 ved flere synergistiske forbedringer. Forbedringene inkluderer en cellelysemetode som unngår prøveopprydding, som er et vanlig trinn i MS-proteomikkpreparater. Den bruker mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)23, som er en frysevarmelysemetode. Denne metoden muliggjorde lysis av enkeltceller i mindre volumer og i multiwellplater i stedet for i hetteglass, noe som muliggjorde en høyere gjennomstrømningshastighet og automatisering av termiske syklister. Til sammen har denne metoden senket kostnaden per enkelt celle og økt kvantitativ nøyaktighet sammenlignet med SCoPE-MS16,24.
Denne protokollen beskriver hvordan man klargjør enkeltceller for proteomisk analyse, inkludert hvordan man klargjør bærer- og referansekanalene ved hjelp av TMTpro 18-plex isobariske etiketter. Pattedyrceller som er i encellet suspensjon og som kan isoleres i 384-brønnplater, er sannsynligvis mottagelige for denne protokollen. Også inkludert er representative resultater av vellykkede enkeltcellesett, som viser flere kvalitetskontrollplott generert av en R Shiny-app, DO-MS25. Andre publiserte programvareverktøy 26,27 og eksperimentelle retningslinjer 17,21 har forbedret vedtakelsen av denne protokollen. Vi håper denne visuelle veiledningen vil hjelpe forskere med å utføre encellede proteomikkeksperimenter.
En av nøklene til vellykket forberedelse og analyse av enkeltceller av SCoPE2 er fremstillingen av bærer- og referansekanalene. Den foreslåtte bærerstørrelsen er 100 til 200 celler; Imidlertid kan antall celler som trengs for et bestemt enkeltcelleeksperiment bestemmes basert på prinsipper som diskutert andre steder21. For den foreslåtte størrelsen er det nødvendig med minst ~ 11 275 celler per 384-brønnplate, noe som muliggjør en 200-cellers bærer og 5-cellers referanse i hvert sett. Det kan være fordelaktig å isolere flere celler hvis de ønskede cellepopulasjonene ikke er en begrensende faktor, for ganske enkelt å ha ekstra materiale i tilfelle feil (som det ble gjort i denne protokollen, isolere 22 000 celler i stedet for 11 275 celler). Mengden bærer og referanse som trengs for antall ønskede plater, bør fremstilles i en enkelt batch for å minimere enhver batch-til-batch-variasjon som kan føre til at peptididentifikasjon eller kvantifisering varierer mellom batcher.
Før du isolerer enkeltceller i brønner på en 384-brønnplate, er det viktig å vurdere utformingen av plateoppsettet. Innenfor hver 384-brønnplate anbefales det å implementere både positive og negative kontroller. Negative kontroller er brønner der ingen celler legges til, men gjennomgår de samme reagenstilleggene og prosedyrene som enkeltcellebrønnene. Positive kontroller er brønner der cellelysat fortynnet til 2-5 celler/μL tilsettes i stedet for enkeltceller. Dette er spesielt viktig å implementere når encellede isolasjonsmetoder ikke er godt validert. Hver 384-brønnplate bør ideelt sett ha en randomisert fordeling av enkeltceller og kontroller (f.eks. ikke ha negative eller positive kontroller i bare en rad). Hver plate skal ha en lik fordeling av alle cellepopulasjoner av interesse, i stedet for å isolere en celletype i en plate og en annen celletype i en annen plate. Dette vil unngå å knytte batcheffekter med celletyper av interesse. I tillegg, hvis mer enn en 384-brønnplate er nødvendig for analyse, anbefales det å isolere celler i en enkelt økt, i stedet for å spre isolasjonstrinnet over flere dager, om mulig.
Lysis av både enkeltceller og bærer/referanse foregår i vann gjennom en fryse-varmesyklus23. Det forventes at de fleste proteaser har blitt denaturert i løpet av dette trinnet. Trypsin tilsettes deretter umiddelbart etter denatureringstrinnet ved høy konsentrasjon, mange størrelsesordener større i konsentrasjon enn selv de mest tallrike cellulære proteaser. Ved massehandling vil de fleste produkter av proteaseaktivitet skyldes trypsin.
Reduksjon/alkylering av cysteinrester utføres ikke i denne protokollen før trypsinfordøyelse. Cysteinholdige peptider representerer omtrent 10% av tryptiske peptider fra det humane proteomet. Vi observerer færre cysteinholdige peptider ved hjelp av en tilnærming uten reduksjon/alkylering. Disse trinnene bruker reagenser som er uforenlige med merking av TMT (NHS-ester kjemi) umiddelbart etter fordøyelsen.
I denne TMT-merkingsstrategien er bæreren og referansene merket med henholdsvis 126 og 127N, mens enkeltcelle- og kontrollbrønner er merket med 128C til 135N. De to etikettene etter referansen, 127C og 128N, brukes ikke på grunn av isotopisk krysskontaminering som oppstår fra bærer- og referansekanalene, som er klart mye mer rikelig i peptidmateriale enn enkeltcellene. Totalt er det 12 TMT-kanaler per sett som kan brukes til merking av enkeltceller eller kontrollbrønner med TMTpro-16plex, eller 14 TMT-kanaler per sett med TMTpro-18plex.
De kritiske trinnene i protokollen for å utføre enkeltcelleproteomikkmålinger ved hjelp av denne protokollen inkluderer fremstilling av bæreren, encellet isolasjon, lysis, fordøyelse, strekkodemerking og riktige massespektrometriparametere. Disse trinnene er skissert i dette dokumentet og har blitt grundig beskrevet andre steder 17,21,25. Hvert trinn har et tilsvarende plott eller sett med plott i DO-MS som gir enkel kvalitetskontroll. For eksempel, ved vellykket opprettelse av bæreren, tillater tomter som viser antall identifiserte peptider, merkingseffektiviteten og prosentandelen av feilspaltningshastighet verifisering av vellykket forberedelse. Representative DO-MS-rapporter er inkludert i denne publikasjonen og kan sees på http://scope2.slavovlab.net/ for de opprinnelige dataene16. Disse DO-MS-rapportene gjør det mulig å vurdere optimalisering av metoden i retninger som ennå ikke er undersøkt av forfatterne, for eksempel lengre LC-gradienter, forskjellige fordøyelsesenzymer eller alternative kjemiske strekkoder.
For tiden begrenser seriell analyse av peptider ved dataavhengige innsamlingsalgoritmer antall peptider som kan analyseres i en LC-kjøring av rimelig lengde. Dette skyldes delvis de lengre fyllingstidene som kreves for vellykket oppkjøp av nok ioner for pålitelig enkeltcellekvantifisering21. En iboende begrensning ved bruk av bæreren er mangelen på direkte vurdering av fordøyelsen og merkingseffektiviteten til enkeltcellene. For øyeblikket er en løsning på denne begrensningen å utføre kvalitetskontroll på en større prøve behandlet sammen med enkeltcellene.
Vi foreslo en rekke muligheter for å forbedre encellet proteomikk, for eksempel å bygge massespektrometre med flere analysatorer. Den nåværende metoden tillater kvantifisering av tusenvis av proteiner fra enkeltpattedyrceller med en hastighet på ca. 100 celler per dag med kommersielt tilgjengelige reagenser og utstyr. SCoPE2, den andre generasjonen av SCoPE-MS-tilnærmingen, forbedret forgjengeren betydelig med hensyn til antall celler som kan analyseres per tidsenhet, antall proteiner som kan analyseres per tidsenhet, tiden som trengs for prøvepreparering, tilgjengeligheten av reagenser og utstyr, og den totale kostnaden for forberedelse og analyse per enkelt celle. Membranbundne proteiner er tilgjengelige ved hjelp av frysevarmelyse og proteasefordøyelse, som vist i forhold til urea lysis23. Metoden identifiserer mange proteiner fra den øverste tredjedelen av proteomet med hensyn til overflod16. Hvis den modifiserte proteoformen er i den øverste tredjedelen av proteomet, og det modifiserte peptidet er egnet til massespektrometrianalyse (ioniserer godt, har en masseforskjell fra umodifisert peptid), vil det mer sannsynlig være mottagelig for denne protokollen. Denne metoden kan brukes fruktbart i biologiske systemer der det er meningsfull heterogenitet blant celler, for eksempel i differensiering, senescence eller immunologiske responser (dvs. fagocytose).
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å anerkjenne høsten 2021 NSF I-Corps Program (Northeastern University site) prisen som har finansiert denne publikasjonen.
384-well plate, standard PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB1384 | Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | A955-1 | This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 271004-100ML | This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
Adhesive PCR plate foils | Thermo Fisher Scientific | AB0626 | |
Autosampler vial screw thread caps | Thermo Fisher Scientific | C5000-51B | |
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) | MTC Bio | C2595 | This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials. |
Benzonase nuclease | Sigma Aldrich | E1014-25KU | |
Clear glass screw thread vials, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | 60180-509 | |
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade | Thermo Fisher Scientific | 85178 | Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area. |
Glass autosampler inserts, 9 mm | Thermo Fisher Scientific | C4010-630 | |
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol | Sigma Aldrich | 467804-50ML | Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment. |
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips | Formulatrix | MCLVPR2 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels. |
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips | Formulatrix | MCLVS12 | These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels. |
Mantis microfluidic liquid handler | Formulatrix | Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples. | |
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling | Formulatrix | 232400 | |
MassPREP peptide mixture | Waters | 186002337 | Mixture of nine nontryptic peptides |
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) | USA Scientific | 2621-0016 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes. |
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-3900 | If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation. |
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) | Benchmark Scientific | Model C2000 | This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells. |
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) | Biorad | 1851138 | |
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg | Thermo Fisher Scientific | A44520 | |
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 | Sigma Aldrich | T7408100ML | |
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood. |
Vortex (Analog vortex mixer) | VWR | Model 58816-121 | |
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) | VWR | 97043964 | |
Water, Optima LC-MS/MS grade | Fisher Scientific | W6-1 | All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality . |