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Neuroscience

मस्तिष्क से एमिलॉयड फाइब्रिल कोर के जैव रासायनिक शुद्धिकरण और प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63816
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ यह जैव रासायनिक शुद्धि विधि अमाइलॉइड फाइब्रिल कोर के मजबूत लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है, जो अल्जाइमर रोग को रोकने के लिए लक्ष्यों की पहचान में तेजी ला सकती है।

Abstract

प्रोटीनेशियस फाइब्रिलर समावेशन कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के प्रमुख रोग हॉलमार्क हैं। अल्जाइमर रोग (एडी) के शुरुआती चरणों में, अमाइलॉइड-बीटा पेप्टाइड्स बाह्य अंतरिक्ष में प्रोटोफिब्रिल बनाते हैं, जो बीज के रूप में कार्य करते हैं जो धीरे-धीरे बड़े अमाइलॉइड सजीले टुकड़े में बढ़ते हैं और परिपक्व होते हैं। इस बुनियादी समझ के बावजूद, मस्तिष्क में अमाइलॉइड फाइब्रिल संरचना, संरचना और जमाव पैटर्न का वर्तमान ज्ञान सीमित है। एक प्रमुख बाधा मस्तिष्क के अर्क से अत्यधिक शुद्ध अमाइलॉइड फाइब्रिल को अलग करने में असमर्थता रही है। आत्मीयता शुद्धिकरण और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग पहले अमाइलॉइड को अलग करने के लिए किया गया है, लेकिन सामग्री की छोटी मात्रा से सीमित हैं जिन्हें पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। यह उपन्यास, मजबूत प्रोटोकॉल सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और अल्ट्रासोनिकेशन के साथ सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) घुलनशीलता का उपयोग करके एमिलॉयड पट्टिका कोर के जैव रासायनिक शुद्धिकरण का वर्णन करता है और एडी रोगियों और एडी मॉडल मस्तिष्क के ऊतकों से अत्यधिक शुद्ध फाइब्रिल पैदा करता है। शुद्ध सामग्री का मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित बॉटम-अप प्रोटिओमिक विश्लेषण एमिलॉयड फाइब्रिल के लगभग सभी प्राथमिक प्रोटीन घटकों की पहचान करने के लिए एक मजबूत रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। अमाइलॉइड कोरोन में प्रोटीन के पिछले प्रोटिओमिक अध्ययनों से प्रोटीन के अप्रत्याशित रूप से बड़े और कार्यात्मक रूप से विविध संग्रह का पता चला है। विशेष रूप से, शुद्धिकरण रणनीति को परिष्कृत करने के बाद, सह-शुद्ध प्रोटीन की संख्या 10 गुना से अधिक कम हो गई थी, जो पृथक एसडीएस अघुलनशील सामग्री की उच्च शुद्धता का संकेत देती है। नकारात्मक धुंधला और इम्यूनो-गोल्ड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने इन तैयारी की शुद्धता की पुष्टि की अनुमति दी। स्थानिक और जैविक विशेषताओं को समझने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है जो इन प्रोटीनों को अमाइलॉइड समावेशन में जमा करने में योगदान करते हैं। एक साथ लिया गया, यह विश्लेषणात्मक रणनीति अमाइलॉइड जीव विज्ञान की समझ बढ़ाने के लिए अच्छी तरह से तैनात है।

Introduction

अमाइलॉइड एक अत्यंत स्थिर सुपरमॉलिक्युलर व्यवस्था है जो प्रोटीन के एक विविध पैनल में पाई जाती है, जिनमें से कुछ पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का कारण बनतीहैं 1. इंट्रा- या बाह्य अमाइलॉइड समुच्चय का संचय कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में मनाया जाता है2. अमाइलॉइड समुच्चय विषम होते हैं और बड़ी संख्या में प्रोटीन और लिपिड से समृद्ध होते हैं3. हाल के वर्षों में, एमिलॉयड प्रोटिओम में रुचि ने बुनियादी और ट्रांसलेशनल न्यूरोसाइंटिस्टों के बीच पर्याप्त रुचि पैदा की है। माउस और पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क के ऊतकों से अमाइलॉइड समुच्चय को निकालने और शुद्ध करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। अमाइलॉइड समुच्चय के लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन, इम्यूनोप्रेसिपिटेशन, डिसेल्युलराइजेशन और जैव रासायनिक अलगाव का व्यापक रूप से अमाइलॉइड सजीले टुकड़े, फाइब्रिल और ऑलिगोमर्स 4,5,6,7 को निकालने और शुद्ध करने के तरीकों का उपयोग किया जाता है। इनमें से कई अध्ययनों ने अर्ध-मात्रात्मक एमएस का उपयोग करके इन कसकर पैक फाइब्रिलर जमा की प्रोटीन संरचना का निर्धारण करने पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, उपलब्ध परिणाम असंगत हैं, और पहले रिपोर्ट किए गए सह-शुद्ध प्रोटीन की आश्चर्यजनक रूप से बड़ी संख्या व्याख्या करना चुनौतीपूर्ण है।

एडी और एडी माउस मॉडल दिमाग में अमाइलॉइड कोर प्रोटिओम का वर्णन करने वाले मौजूदा साहित्य की प्राथमिक सीमा यह है कि शुद्ध सामग्री में सह-शुद्ध प्रोटीन की एक असहनीय संख्या होती है। इस पद्धति का समग्र लक्ष्य इस सीमा को दूर करना और अमाइलॉइड फाइब्रिल कोर को अलग करने के लिए एक मजबूत जैव रासायनिक शुद्धिकरण विकसित करना है। यह रणनीति पोस्टमार्टम एडी मानव और माउस मस्तिष्क के ऊतकों 8,9 से एसडीएस अघुलनशील समृद्ध अमाइलॉइड अंशों के अलगाव के लिए पहले से वर्णित सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित जैव रासायनिक विधि को नियोजित करती है। यह विधि मौजूदा साहित्य पर बनाती है लेकिन अल्ट्रासोनिकेशन और एसडीएस वॉश के साथ आगे बढ़ती है ताकि अधिकांश शिथिल बाध्य एमिलॉयड से जुड़े प्रोटीन को हटाया जा सके, जिससे अत्यधिक शुद्ध एमिलॉयड फाइब्रिल (चित्रा 1) का अलगाव होता है। इस प्रोटोकॉल द्वारा शुद्ध फाइब्रिल मस्तिष्क के अर्क से अलग अमाइलॉइड फाइब्रिल के संरचनात्मक अध्ययन में अक्सर सामना की जाने वाली कई मौजूदा चुनौतियों को दूर करते हैं। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के साथ इन फाइब्रिल का विज़ुअलाइज़ेशन शुद्ध सामग्री (चित्रा 2) की अखंडता और शुद्धता की पुष्टि करता है। इस अध्ययन में, पृथक फाइब्रिल घुलनशील होते हैं और ट्रिप्सिन के साथ पेप्टाइड्स को पचाते हैं, और लेबल मुक्त एमएस विश्लेषण आसानी से फाइब्रिल कोर बनाने वाले प्रोटीन की पहचान को प्रकट कर सकता है। विशेष रूप से, इनमें से कुछ प्रोटीनों में गैर-झिल्ली-बाध्य ऑर्गेनेल में सुपरमॉलिक्युलर असेंबली बनाने की अंतर्निहित प्रवृत्ति होती है। इसके अलावा, अमाइलॉइड-बीटा (एβ) फाइब्रिल के विश्लेषण में पहचाने जाने वाले कई प्रोटीन अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से भी जुड़े हुए हैं, यह सुझाव देते हुए कि ये प्रोटीन कई प्रोटीनोपैथी में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।

अल्ट्रासोनिकेशन विधि फाइब्रिल कोर की संरचना को बदलने या बाधित करने की संभावना नहीं है। शुद्ध सामग्री टॉप-डाउन और बॉटम-अप प्रोटिओमिक विश्लेषण दृष्टिकोण और अतिरिक्त एमएस-आधारित संरचनात्मक विश्लेषण रणनीतियों, जैसे रासायनिक क्रॉसलिंकिंग या हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए भी उपयुक्त है। इस पद्धति का उपयोग करके समग्र वसूली अपेक्षाकृत अधिक है और इस प्रकार, विस्तृत संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त है, जिसके लिए शुद्ध सामग्री के मिलीग्राम के लिए माइक्रोग्राम की आवश्यकता होती है। शुद्ध सामग्री क्रायोईएम और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संरचनात्मक अध्ययन के लिए भी उपयुक्त है। स्तनधारियों के स्थिर आइसोटोपिक लेबलिंग के साथ संयोजन में यह प्रोटोकॉल, अमाइलॉइड संरचना10 के ठोस राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में मानव या कशेरुक मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग शामिल है। सभी शोध नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी के अनुमोदित संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे। वर्तमान वर्कफ़्लो को एपीपी-नॉक इन (ऐपएनएल-जी-एफ / एनएल-जी-एफ) माउस मस्तिष्क कॉर्टिकल और हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क क्षेत्र अर्क11 का उपयोग करके मानकीकृत किया गया है। इस प्रोटोकॉल को 6-9 महीने की उम्र में चूहों से मस्तिष्क के अर्क के लिए अनुकूलित किया गया है, और यह नर और मादा जानवरों दोनों से एमिलॉयड को प्रभावी ढंग से शुद्ध कर सकता है।

नोट: समग्र प्रयोगात्मक प्रक्रिया की बेहतर समझ के लिए, वर्कफ़्लो की योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें।

1. ऊतक कटाई और अमाइलॉइड शुद्धि

नोट: आदर्श रूप से, अमाइलॉइड फाइब्रिल को ताजा विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों से अलग किया जाना चाहिए। हालांकि, यह विधि स्नैप- या फ्लैश-जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों के साथ भी अच्छी तरह से काम करती है। नीचे बाद में उपयोग के लिए भंडारण के लिए स्नैप-फ्रीजिंग मस्तिष्क के ऊतकों की एक संक्षिप्त रूपरेखा दी गई है।

  1. मस्तिष्क ऊतक कटाई और भंडारण: माउस दिमाग विच्छेदन और जल्दी से अमाइलॉइड से लदे क्षेत्रों (यानी, प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस) फसल, तरल नाइट्रोजन या एक सूखी बर्फ शराब स्नान में स्नैप ठंड के बाद।
    नोट: स्नैप फ्रीजिंग ऊतक के घटकों की संरचनात्मक विशेषताओं को संरक्षित करने में मदद करता है। चूहों को आइसोफ्लूरेन और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था12,13 द्वारा इच्छामृत्यु दी जाती है। सीओ2 का उपयोग करने से बचने की सलाह दी जाती है क्योंकि यह मस्तिष्क प्रोटिओम अखंडता से समझौता कर सकता है।
  2. विच्छेदन के बाद, छोटे ब्लॉकों (जैसे, 5 मिमी x 5 मिमी) में ताजा ऊतकों को काटें और स्टोर करें, क्योंकि यह अमाइलॉइड निष्कर्षण से पहले अधिक कुशल होमोजेनाइजेशन की सुविधा प्रदान करता है। बाँझ क्रायोजेनिक शीशी के लिए ऊतक स्थानांतरण, अपनी टोपी कस, और तेजी से डूब।
  3. ऊतकों को अल्ट्राकोल्ड स्थितियों (यानी, -80 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन) में जमे हुए रखें। यदि निष्कर्षण कुछ दिनों बाद किया जाना है, तो ऊतकों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और फ्रीज और पिघलना चक्र से बचें। निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए तैयार होने पर गीली बर्फ पर जमे हुए ऊतकों को पिघलाएं।
    नोट: तरल नाइट्रोजन के साथ ऊतकों का सीधा संपर्क ऊतक और प्रोटीन क्षति का कारण बन सकता है। ध्यान दें कि एक अल्कोहल स्नान ट्यूब लेबल से स्थायी मार्करों को हटा सकता है।

2. एसडीएस अघुलनशील सामग्री का संवर्धन

नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ और अपकेंद्रित्र पर सभी चरणों का प्रदर्शन करें, जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया हो। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी बफ़र्स और समाधानों का विवरण पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किया गया है। रसायनों और उपकरणों के निर्माता और कैटलॉग नंबर सामग्री की तालिका में प्रदान किए जाते हैं।

  1. ताजा विच्छेदित या स्नैप-जमे हुए मस्तिष्क ऊतक क्षेत्रों (बर्फ पर पिघला हुआ) के साथ शुरू करें, जो 6-8 सिरेमिक मोती और ताजा तैयार बर्फ-ठंडा होमोजेनाइजेशन बफर (गीले ऊतक द्रव्यमान के 0.25-1 ग्राम के लिए 1 एमएल) युक्त 2 एमएल ट्यूब में रखा गया है।
  2. ट्यूबों को मनका मिल होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित करें और 4000 आरपीएम पर ऊतक सामग्री को पीस लें, जिसमें प्रत्येक 30 एस के दो चक्र और बीच में 30 एस का अंतराल हो।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, मोटरचालित उत्तेजक या होमोजेनाइज़र सिस्टम का उपयोग ऊतकों को पीसने और समरूप बनाने के लिए किया जा सकता है।
  3. 15 एमएल ट्यूबों में मस्तिष्क पूरे ऊतक होमोजेनेट के 1 एमएल में बर्फ-ठंडा होमोजेनाइजेशन बफर के 9 एमएल जोड़ें, प्रयोगशाला मोम फिल्म स्ट्रिप्स के साथ सील करें, और मजबूत घुलनशीलता सुनिश्चित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एंड-टू-एंड घुमाएं।
    नोट: अवांछित बड़े सेलुलर मलबे और लिपिड को हटाने के लिए, अगली सुबह, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 800 एक्स जी पर ट्यूबों को स्पिन करें और एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें। बर्फ-ठंडे होमोजेनाइजेशन बफर के 2 मिलीलीटर में शेष गोली को फिर से निलंबित करें, अच्छी तरह से मिलाएं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए फिर से स्पिन करें, और दो सतह पर तैरनेवालों को गठबंधन करें।
  4. धीरे-धीरे 1.2 एम की अंतिम एकाग्रता के लिए ऊतक निकालने के निलंबन में ठोस सुक्रोज जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 250,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
  5. ध्यान से हटाने और एक विंदुक का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें। ट्राइट्यूरेटिंग द्वारा 1.9 एम सुक्रोज युक्त होमोजेनाइजेशन बफर के 2 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 125,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
    नोट: बफर वॉल्यूम पिछले चरण से बरामद सामग्री की मात्रा के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, होमोजेनाइजेशन बफर (वी / वी) के 10 वॉल्यूम इस चरण के लिए आदर्श हैं।
  6. एक पिपेट का उपयोग कर शीर्ष सफेद ठोस परत ले लीजिए, इसे एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें, और हवा के बुलबुले पेश किए बिना कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके बर्फ-ठंडे धोने के बफर के 1 मिलीलीटर में घुलनशील करें।
  7. शीर्ष परत के अलावा, गोली भी अमाइलॉइड फाइब्रिल से समृद्ध है। उच्च उपज के लिए, दो अंशों को मिलाएं और आगे बढ़ें। ध्यान से एक पिपेट का उपयोग कर मध्य जलीय परत को हटा दें और त्यागें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 8000 x g पर संयुक्त अंशों अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  9. धोया गोली के लिए बर्फ ठंडा पाचन बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, पुन: निलंबित, और 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 8000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र और एक विंदुक का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  11. बर्फ-ठंडे ट्रिस बफर के 1 एमएल में दो बार पचने वाली गोली को फिर से निलंबित और धोएं (चरण 2.8 के समान)।
  12. ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा 1% एसडीएस और 1.3 एम सुक्रोज युक्त घुलनशीलता बफर के 1 एमएल में धोया गोली को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 200,000 एक्स जी पर जल्दी से अपकेंद्रित्र।
    नोट: यद्यपि अमाइलॉइड फाइब्रिल डिटर्जेंट और विकृतीकरण के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी हैं, डिटर्जेंट (1% एसडीएस) के लिए बहुत लंबे समय तक एक्सपोजर फाइब्रिल की अखंडता को प्रभावित कर सकता है या कसकर बाध्य प्रोटीन को हटा सकता है, जो बाद के विश्लेषणों से समझौता करेगा। इसलिए, छर्रों को फिर से निलंबित करने के तुरंत बाद, सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए आगे बढ़ें।
  13. गोली को बचाने और 50 एमएम ट्रिस बफर (अनुपात 1: 0.3 में) जोड़कर शेष सतह पर तैरनेवाला की मात्रा में वृद्धि करने के लिए 1.3 से 1 एम तक सुक्रोज एकाग्रता को कम करने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 200,000 एक्स जी पर एक और बार अपकेंद्रित्र।
  14. एमिलॉयड शुद्धि के लिए 0.5% एसडीएस और पूल युक्त ट्रिस बफर के 100 μL में दो छर्रों को भंग करें। दृश्यमान छर्रों छोटे होते हैं और अपारदर्शी और ऑफ-व्हाइट दिखाई देना चाहिए ( चित्रा 2 ए देखें)।

3. एमिलॉयड शुद्धि

नोट: दो छर्रों को मिलाएं, एक समान समाधान प्राप्त करने तक पाइपिंग द्वारा घुलनशील करें और एमिलॉयड शुद्धिकरण के निम्नलिखित चरणों के साथ आगे बढ़ें।

  1. छर्रों में मौजूद अमाइलॉइड समृद्ध सामग्री के पूर्ण घुलनशीलता के लिए, ट्यूब को अल्ट्रासाउंड तरंगों द्वारा उत्पादित यांत्रिक कतरनी के अधीन स्नान सोनिकेशन डिवाइस में 20 चक्रों के लिए मध्यम दूरी की आवृत्ति पर 30 एस चालू और 30 एस ऑफ के लिए चल रहा है।
  2. तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर सामग्री अपकेंद्रित्र और 0.5% एसडीएस ट्रिस बफर के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित कर दिया।
  3. चरण 3.1 दोहराएँ। और चरण 3.2। कुल पांच धोने के लिए चार बार। शुद्धता में सुधार के लिए वॉश की संख्या बढ़ाई जा सकती है।
    नोट: सोनिकेशन और धोने के कदम 0.5% एसडीएस पर अनुकूलित किए जाते हैं क्योंकि उच्च सांद्रता फाइब्रिल की संरचना, अखंडता या प्रोटीन संरचना को प्रभावित कर सकती है। इस चरण में एसडीएस एकाग्रता बढ़ाने की सिफारिश नहीं की जाती है।
  4. अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के बाद, किसी भी शेष डिटर्जेंट को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर अल्ट्रा-शुद्ध पानी और अपकेंद्रित्र के 200 μL में गोली धो लें। शुद्ध अमाइलॉइड फाइब्रिल युक्त धोया गोली रंग में अर्ध-पारदर्शी दिखाई देती है और कभी-कभी देखना मुश्किल होता है।
  5. अल्ट्राप्योर पानी के 100 μL में शुद्ध अमाइलॉइड फाइब्रिल युक्त अंतिम गोली को भंग करें। डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए तुरंत अगले चरण पर आगे बढ़ें या आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फाइब्रिल निलंबन को बचाएं। यदि जमे हुए हैं, तो वर्षा शुरू करने से पहले बर्फ पर पिघलना।

4. मेथनॉल क्लोरोफॉर्म वर्षा

नोट: यदि अंतिम लक्ष्य प्रोटीन विश्लेषण करना है, तो अतिरिक्त गैर-प्रोटीनयुक्त अशुद्धियों को डीसाल्ट करने और हटाने की सिफारिश की जाती है।

  1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और भंवर अच्छी तरह से में अमाइलॉइड फाइब्रिल के शुद्ध 100 μL करने के लिए मेथनॉल के 400 μL जोड़ें।
  2. ट्यूब और भंवर को अच्छी तरह से क्लोरोफॉर्म के 100 μL जोड़ें।
  3. अल्ट्राप्योर पानी और भंवर के 300 μL अच्छी तरह से जोड़ें। यह प्रोटीन वर्षा के कारण मिश्रण को बादल ों में बदल देता है।
  4. आरटी पर 2 मिनट के लिए 12,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
  5. प्रोटीन फ्लेक युक्त इंटरफ़ेस परत को परेशान किए बिना जलीय परत (यानी, शीर्ष) को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  6. फिर से मेथनॉल की एक ही मात्रा जोड़ें और आरटी पर 2 मिनट के लिए 12,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
  7. एक पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और आरटी पर गोली हवा में सूखी। अधिक सूखने पर अमाइलॉइड अंश को फिर से हल करना मुश्किल है।

5. ट्रिप्सिन पाचन

  1. गुआनिडीन हाइड्रोक्लोराइड (जीयूएचसीएल) बफर के 50 μL में गोली को भंग करें। यदि आवश्यक हो तो 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ-ठंडे पानी के स्नान और गर्मी में सोनिकेट करें।
  2. पूरी तरह से भंग करने के लिए 45 मिनट से 1 घंटे के लिए आरटी पर अच्छी तरह से भंवर। इस चरण के बाद गोली दिखाई नहीं देगी, और समाधान दिखने में स्पष्ट दिखता है।
  3. 0.2% सर्फेक्टेंट समाधान की समान मात्रा जोड़ें। 60 मिनट के लिए भंवर के साथ आरटी पर घुलनशील। यह कदम ट्रिप्सिन एंजाइमेटिक गतिविधि को बढ़ाता है।
  4. 500 एमएम स्टॉक समाधान से ट्रिस -2-कार्बोक्सीथिलफॉस्फीन (टीसीईपी) के 1 μL जोड़ें। 60 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. 500 एमएम आयोडोसेटामाइड (आईएए) के 2 μL जोड़ें और 20 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं।
  6. 15 मिनट के लिए टीसीईपी समाधान के 5 μL के साथ आईएए बुझाने।
  7. गुआनिडीन एकाग्रता को 1.5 एम तक कम करने के लिए ट्यूब में 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट समाधान की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
  8. ट्यूब में 1% सर्फेक्टेंट समाधान जोड़ें (प्रोटीन का 1 μL /
  9. ट्रिप्सिन (प्रोटीन के 1 μg/100 μg) जोड़ें और ट्यूब मिश्रण को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।

6. पेप्टाइड सफाई

  1. अगली सुबह, फॉर्मिक एसिड जोड़कर पीएच को 2.0 तक कम करके पचने वाले पेप्टाइड समाधान को अम्लीय करें।
  2. 50% मेथनॉल समाधान के 200 μL जोड़कर एक 2 एमएल रिसीवर ट्यूब में C18 (n-ऑक्टाडेसिल) स्पिन कॉलम को सक्रिय करें और आरटी पर 2 मिनट के लिए 1500 x g पर स्पिन करें।
  3. संतुलन बफर के 200 μL जोड़ने और एक ही शर्तों के साथ 2 मिनट के लिए कताई करके C18 कॉलम राल बिस्तरों को संतुलित करें। इस चरण को दोहराएं।
  4. सी 18 कॉलम पर अम्लीय पेप्टाइड समाधान लोड करें और आरटी पर 2 मिनट के लिए 1500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र लोड करें प्रवाह-थ्रू इकट्ठा करें और इसे एक और बार फिर से लोड करें। दूसरे प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें।
  5. वॉश बफर 2 एक्स के साथ सी 18 राल से बंधे पेप्टाइड्स को धोएं, जैसा कि चरण 6.3 में किया गया है। स्तंभ धोने के लिए एक ही संतुलन बफर का उपयोग करें।
  6. क्षालन बफर के 40 μL जोड़कर पेप्टाइड्स एल्यूट 1500 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, आरटी पर 2 मिनट के लिए बरामद पेप्टाइड्स की उपज बढ़ाने के लिए तीन बार क्षालन कदम दोहराएँ।
  7. जलीय घोल को वाष्पित करके पेप्टाइड्स को गति वैक्यूम कंसंट्रेटर में सुखाएं। एमएस विश्लेषण से पहले कुछ हफ्तों के लिए सूखे छर्रों को -20 डिग्री सेल्सियस पर बचाया जा सकता है।

7. पेप्टाइड विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर की स्थापना

नोट: एमएस पैरामीटर के लिए, अनुपूरक फ़ाइल 1 (प्रयोगशाला से पिछले प्रकाशन से अनुकूलित) 14 देखें।

  1. एमएस विश्लेषण के लिए पेप्टाइड नमूने लोड करने से पहले, नमूना लोडिंग बफर के 20 μL में शुष्क पेप्टाइड छर्रों को भंग करें और बरामद पेप्टाइड्स की एकाग्रता को मापने के लिए माइक्रो बीसीए करें।
  2. भंग पेप्टाइड्स को कांच की शीशी में स्थानांतरित करें और यूपीएलसी सिस्टम ऑटोसैंपलर में पेप्टाइड्स के 3 μg (माइक्रो बीसीए से मात्रा निर्धारित) लोड करें।
  3. मिनट की प्रवाह दर के साथ एक वेंटेड ट्रैप कॉलम (सी 18 एचपीएलसी कॉलम, 0.075 मिमी x 20 मिमी) पर नमूने लोड करें।
  4. एक विश्लेषणात्मक स्तंभ (0.075 μm x 500 मिमी) के साथ लाइन में जाल स्तंभ व्यवस्थित करें और 2000 वी के स्प्रे वोल्टेज के अधीन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत के लिए एक उत्सर्जक टिप इकट्ठा करें।
    नोट: इस अध्ययन में, ईएसआई किया जाता है, जिसमें मोबाइल चरण गैस चरण में उच्च वोल्टेज आयनीकरण के अधीन होता है। इसके द्वारा बनाए गए स्प्रे को गर्म केशिका के माध्यम से एमएस के वैक्यूम कक्ष में निर्देशित किया जाता है। वैक्यूम के तहत, बूंदों का डी-सॉल्वेशन और आयनों का इजेक्शन गर्मी और वोल्टेज की उपस्थिति में होता है। इसके बाद, आयनों को उच्च वोल्टेज वातावरण की उपस्थिति में द्रव्यमान विश्लेषक की ओर त्वरित किया जाता है।
  5. 2 घंटे अधिग्रहण रन के साथ नमूनों का विश्लेषण करें। यह अध्ययन सबसे तीव्र शीर्ष 20 अग्रदूत आयन चयन प्रतिमान के साथ डेटा-निर्भर अधिग्रहण का उपयोग करके किया जाता है।
    नोट: डेटा-निर्भर अधिग्रहण में, एमएस 1 स्कैन में सीमित संख्या में अग्रदूत पेप्टाइड्स का पता लगाया जाता है और एमएस 2 विश्लेषण के लिए विखंडन के अधीन होता है। हालांकि, गतिशील बहिष्करण यहां समस्याग्रस्त है क्योंकि अत्यधिक प्रचुर मात्रा में Aβ पेप्टाइड्स को विखंडन के लिए छोड़ दिया जाएगा और परिणामस्वरूप उनकी मात्रा को कम करके आंका जाएगा।
  6. एβ पेप्टाइड्स के पूर्ण परिमाणीकरण के लिए, लक्षित एमएस / एमएस विधि का उपयोग करके एक और बार एक ही नमूने चलाएं। इस अध्ययन के लिए, एपीपी नॉक-इन माउस मॉडल के लिए विभिन्न संभावित ट्रिप्टिक एβ पेप्टाइड्स के लिए सभी एम / जेड अनुपातों की एक विस्तृत सूची तैयार की गई है ( पूरक तालिका 1 देखें)। अन्य समूहों को उपलब्ध माउस मॉडल और ब्याज के प्रोटीन से उत्पन्न संभावित पेप्टाइड्स (जैसे, एडी के लिए एβ) के अनुसार एक समान सूची तैयार करनी चाहिए।
    नोट: अत्यधिक प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड्स के बहिष्कार को संबोधित करने के लिए, Aβ ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स के अनुरूप चयनित m/z मानों की एक सूची प्रदान करके एक लक्षित दृष्टिकोण का उपयोग करें। यह दृष्टिकोण Aβ पेप्टाइड्स के डेटा-निर्भर बहिष्करण की समस्या को संबोधित करता है और उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ विभिन्न मोनोमर्स (Aβ38, 40 और 42 पेप्टाइड्स) की पूर्ण मात्रा को माप सकता है।
  7. मास स्पेक्ट्रोमीटर पेप्टाइड नमूनों के एमएस स्पेक्ट्रा उत्पन्न करता है और लक्ष्य निर्देशिका पर कच्चे डेटा फ़ाइलों को बचाता है। अच्छी तरह से स्थापित सांख्यिकीय और जैव सूचना विज्ञान उपकरणों का उपयोग करके वर्णक्रमीय मिलान करने के लिए इस फ़ाइल का उपयोग करें। एकाधिक ऑनलाइन और ऑफ़लाइन डेटाबेस खोज और विश्लेषण उपकरण उपलब्ध हैं।

8. एमएस डेटा विश्लेषण

  1. ऑफ़लाइन रॉकन्वर्टर उपकरण (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/) का उपयोग करके MS1 और MS2 फ़ाइलें निकालें।
  2. वेब-आधारित एमएस डेटा खोज इंजन पर डेटा की पहचान, मात्रा का ठहराव और विस्तृत विश्लेषण करें। इस अध्ययन में, एकीकृत प्रोटिओमिक्स पाइपलाइन - आईपी 2 (ब्रूकर: http://www.integratedproteomics.com/) का उपयोग किया गया था।
    नोट: कई अन्य ऑनलाइन और ऑफ़लाइन एमएस डेटा विश्लेषण उपकरण उपलब्ध हैं और इसका उपयोग भी किया जा सकता है, जैसे मैक्सक्वांट (https://www.maxquant.org/)।
  3. MS1 और MS2 फ़ाइलें अपलोड करने के बाद, एक अद्यतन माउस प्रोटिओम डेटाबेस का चयन करें। यहां, अतिरिक्त ऐप नॉक-इन विशिष्ट उत्परिवर्तन वाले एक अद्यतन माउस डेटाबेस को प्रोलुसिड और सीक्वेस्ट एल्गोरिदम11 का उपयोग करके पेप्टाइड्स की पहचान के लिए चुना जाता है।
  4. आईपी 2 विश्लेषण प्रणाली में, डिफ़ॉल्ट मापदंडों का चयन करें और प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार उन्हें संशोधित करें। इस अध्ययन में, अग्रदूत के लिए 50 पीपीएम और टुकड़ों के लिए 600 पीपीएम की पेप्टाइड द्रव्यमान सहिष्णुता का उपयोग किया जाता है (आईपी 2 में उपयोग किए जाने वाले अन्य मापदंडों के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
    नोट: शोधकर्ता प्रयोगात्मक उद्देश्यों के अनुसार खोज मापदंडों को संशोधित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की पहचान करने के लिए, विभिन्न पीटीएम (जैसे, सर्वव्यापी, एसयूएमओवाईलेशन, फॉस्फोराइलेशन) के लिए अंतर संशोधन मान जोड़ें।

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Representative Results

यहां, एक संशोधित सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन शुद्धिकरण विधि का उपयोग करके एमिलॉयड फाइब्रिल के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए एक विस्तृत विधि संक्षेप में प्रस्तुत की गई है ( चित्रा 1 देखें)। इस पद्धति में नवाचार एसडीएस घुलनशीलता के बाद पानी के स्नान सोनिकेशन सिस्टम का उपयोग करके अल्ट्रासोनिकेशन-आधारित धोने के चरणों को शामिल करना है, जो अमाइलॉइड फाइब्रिल से कई शिथिल जुड़े प्रोटीन को हटा देता है जो अत्यधिक घने और स्वच्छ फाइब्रिल के साथ सह-शुद्ध होते हैं। अल्ट्रासोनिकेशन चरण एक उच्च कतरनी बल उत्पन्न करता है और फाइब्रिल को उत्तेजित करता है, हाइड्रोफोबिक बलों को ढीला करता है और एसडीएस घुलनशील शिथिल रूप से जुड़े प्रोटीन को एसडीएस वॉश बफर में जारी करता है। बदले में, अत्यधिक शुद्ध अमाइलॉइड फाइब्रिल कोर की थोड़ी मात्रा बरामद की जाती है। जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, एक दृश्यमान गोली, जो शुरू में अपारदर्शी दिखाई देती है (संभवतः अशुद्धियों के कारण), संवर्धन के बाद देखा जा सकता है; हालांकि, अल्ट्रासोनिकेशन और कई एसडीएस वॉश के बाद, गोली अर्ध-पारदर्शी हो जाती है और शायद ही दिखाई देती है। एसडीएस घुलनशील अंश की तुलना में शुद्ध अमाइलॉइड के प्रतिनिधि कांगो लाल धुंधला अमाइलॉइड फाइब्रिल (चित्रा 2 बी) के संवर्धन का दस्तावेजीकरण करता है। कांगो लाल धुंधला विभिन्न अंशों में अमाइलॉइड सामग्री की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है। जैसा कि चित्रा 2 सी में दिखाया गया है, एसडीएस घुलनशील अंश कांगो लाल डाई के साथ दाग नहीं करता है।

नकारात्मक धुंधला संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ शुद्ध फाइब्रिल की संरचना ने लगभग शुद्ध अमाइलॉइड फाइब्रिल (चित्रा 2 डी) की उपस्थिति की पुष्टि की। इसके अतिरिक्त, इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग Aβ42 (6E10 और 4G8) एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग करके Aβ42 पेप्टाइड्स (चित्रा 2E) की उपस्थिति की पुष्टि की। शुद्ध सामग्री की संरचना और संरचनात्मक विशेषताओं की जांच करने के लिए, हमने एβ पेप्टाइड्स और हॉलमार्क संरचनात्मक हस्ताक्षर (जैसे, फाइब्रिल) के लिए इम्यूनोब्लोट तकनीकों का उपयोग किया। अमाइलॉइड अलगाव के दौरान एकत्र किए गए अंशों के प्रतिनिधि डॉट धब्बा विश्लेषण ने एंटी-एβ42 और एंटी-फाइब्रिल (एलओसी) एंटीबॉडी (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके एβ42 पेप्टाइड्स और फाइब्रिल की सापेक्ष बहुतायत दिखाई। इसी तरह, प्रतिनिधि अंशों के पश्चिमी धब्बा ने एसडीएस पेज जेल (चित्रा 3 बी) के कुओं में फंसे उच्च आणविक भार प्रोटीन में Aβ42 युक्त फाइब्रिल का संवर्धन भी दिखाया। इन उच्च आणविक भार फाइब्रिल की संरचना को समझने के लिए, शुद्ध अमाइलॉइड अंशों को एमएस-आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण के अधीन किया गया था। इन अर्ध-मात्रात्मक परिणामों ने लगभग 250 प्रोटीन की उपस्थिति का खुलासा किया, जबकि अल्ट्रासोनिकेशन और एसडीएस वॉश से पहले एकत्र किए गए अंश में 2500 से अधिक प्रोटीन (चित्रा 3 सी) थे। यह इन दो महत्वपूर्ण चरणों की प्रभावशीलता को इंगित करता है जो इस शुद्धिकरण प्रोटोकॉल में शामिल हैं। एक साथ लिया गया, कई स्वतंत्र परिणाम फाइब्रिल कोर में समान प्रोटीन वर्गों की उच्च प्रचुरता का संकेत देते हैं।

चित्रा 4 में एक प्रतिनिधि एमएस डेटासेट के लिए जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) सेलुलर घटक विश्लेषण से पता चला है कि फाइब्रिल कोर में मौजूद बड़ी संख्या में प्रोटीन गैर-झिल्ली-बाध्य ऑर्गेनेल और सुपरमॉलिक्युलर कॉम्प्लेक्स से जुड़े हैं। यह अवलोकन संभवतः कई प्रोटीनों की अंतर्निहित प्रवृत्ति के कारण होता है जो खुद को एकत्रित करते हैं या प्रोटीनयुक्त समावेशन में अन्य प्रोटीनों के साथ सह-समुच्चय करते हैं जो निकटता में होते हैं। शारीरिक शक्तियां इन इंटरैक्शन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। मुख्य रूप से इन प्रोटीनों द्वारा दर्शाए गए अन्य सेलुलर ऑर्गेनेल और घटक माइटोकॉन्ड्रिया, साइटोस्केलेटन, कोशिका झिल्ली और माइलिन म्यान हैं। इनमें से कई प्रोटीन अमाइलॉइड गठन के विभिन्न चरणों में एβ पेप्टाइड्स, ऑलिगोमर्स या प्रोटोफिब्रिल के साथ बातचीत करते हैं। वे प्लाज्मा झिल्ली के करीब बातचीत कर सकते हैं, जहां एβ पेप्टाइड्स जारी किए जाते हैं। बातचीत तब भी हो सकती है जब इनमें से कुछ प्रोटीन सीधे या बाह्य अंतरिक्ष में पुटिका परिवहन के माध्यम से जारी किए जाते हैं। प्रोटीन समुच्चय का स्राव या एक्सोसाइटोसिस कई रणनीतियों में से एक है जिसका उपयोग कोशिकाएं प्रोटीन समुच्चय15 से जुड़े बोझ का सामना करने और कम करने के लिए करती हैं। यह एक और अवसर छोड़ देता है जहां कुछ इंट्रासेल्युलर प्रोटीन एβ पेप्टाइड्स से बंध सकते हैं। प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर आगे अनुकूलन के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, शुद्धता और उपज, अल्ट्रासोनिकेशन और एसडीएस वॉश की संख्या को बदलकर, तदनुसार ठीक-ठीक किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: एडी पोस्टमार्टम मानव या मॉडल पशु मस्तिष्क के ऊतकों से अमाइलॉइड फाइब्रिल कोर के अलगाव के लिए वर्कफ़्लो का एक आरेखीय अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: अमाइलॉइड फाइब्रिल के जैव रासायनिक धुंधला और इमेजिंग का उपयोग करके अमाइलॉइड निष्कर्षण की पुष्टि ( ए ) समृद्ध अमाइलॉइड युक्त एसडीएस अघुलनशील गोली रंग में अपारदर्शी ऑफ-व्हाइट दिखाई देती है। (बी) एसडीएस घुलनशील सतह पर तैरनेवाला और एसडीएस अघुलनशील गोली का कांगो लाल धुंधला हो जाना जिसमें शुद्ध अमाइलॉइड होता है जो 0.45 μm नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर धब्बा होता है; बीसीए रीडिंग का उपयोग प्रोटीन की लोडिंग मात्रा के सामान्यीकरण के लिए किया गया था। बीसीए परख निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया था। (सी) कांगो लाल धुंधला (स्केल बार: 100 μm) के बाद एसडीएस घुलनशील और अमाइलॉइड सामग्री की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। (डी) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (स्केल बार: 100 एनएम) के तहत नकारात्मक धुंधला का उपयोग करके एसडीएस घुलनशील अंश और शुद्ध अमाइलॉइड फाइब्रिल का दृश्य। (ई) इम्यूनोगोल्ड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध अमाइलॉइड फाइब्रिल में Aβ42 पेप्टाइड्स बहुतायत की पुष्टि Aβ42 (6E10 और 4G8) एंटीबॉडी (स्केल बार: 50 एनएम) का उपयोग करके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इम्यूनोब्लोट और एमएस विश्लेषण का उपयोग करके अमाइलॉइड शुद्धि का सत्यापन ( ए ) डॉट ब्लॉट और (बी) एंटी-फाइब्रिल एलओसी और एंटी-एβ42 एंटीबॉडी का उपयोग करके एमिलॉयड शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान एकत्र किए गए कई प्रतिनिधि अंशों का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण; बीसीए परख रीडिंग प्रोटीन की लोडिंग मात्रा के सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था। (सी) समृद्ध और शुद्ध अमाइलॉइड अंशों के लेबल मुक्त मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में बरामद प्रोटीन की संख्या; माइक्रो बीसीए परख प्रत्येक एमएस विश्लेषण के लिए पच पेप्टाइड्स के 3 μg लोड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। बीसीए और माइक्रो बीसीए परख निर्माता के निर्देशों के अनुसार किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: शुद्ध अमाइलॉइड अंशों में प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का जीन ओन्टोलॉजी विश्लेषण। (ए) सेलुलर घटकों और (बी) केईजीजी मार्ग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: पेप्टाइड्स की पहचान के लिए बफ़र्स और समाधान, मास स्पेक्ट्रोमेट्री पैरामीटर और प्रोलुसीआईडी खोज पैरामीटर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1- माउस मॉडल में एपीपी दस्तक के अमाइलॉइड बीटा पेप्टाइड्स के लिए एमएस रन में पहचाने गए एम / जेड अनुपात की एक प्रतिनिधि सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एमिलॉयड संरचना और संरचना की स्पष्ट समझ विकसित करना संरचनात्मक जीवविज्ञानियों और बायोकेमिस्टों के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि जैविक जटिलताओं और एडी मस्तिष्क के ऊतकों16,17 से शुद्ध फाइब्रिल निकालने में प्रयोगात्मक सीमाएं हैं। अमाइलॉइड फाइब्रिल आणविक स्तर पर बहुरूपी होते हैं, जो अलग-अलग लंबाई और जटिलताओं18,19 की विषम आबादी दिखाते हैं। उनकी जैविक विशेषताओं और पैथोलॉजिकल प्रासंगिकता को बेहतर ढंग से समझने के लिए, पोस्टमार्टम मानव और एडी माउस मस्तिष्क के ऊतकों से प्राप्त पॉलीमॉर्फिक अमाइलॉइड फाइब्रिल की संरचना का एक संपूर्ण लक्षण वर्णन20,21 की आवश्यकता है। प्रोटीन का एक बड़ा सबसेट सीधे Aβ42 के साथ बातचीत करता है, जबकि अन्य में बड़ी फाइब्रिलर संरचनाएं या प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 22,23,24 बनाने की प्रवृत्ति हो सकती है। अमाइलॉइड गठन, स्थिरीकरण और बढ़ाव में Aβ42 के साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन द्वारा निभाई गई भूमिकाओं को निर्धारित करना अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह एडी पैथोलॉजी से संबंधित है। हाल के वर्षों में, कई प्रोटिओमिक अध्ययनों ने विभिन्न सुपरमॉलिक्युलर व्यवस्थाओं, झिल्ली-रहित ऑर्गेनेल, समावेश निकायों और प्रोटीन समुच्चय25,26,27 की प्रोटीन संरचना में अंतर और समानता को स्पष्ट किया है। ईस्वी के शुरुआती चरणों में, कई सेलुलर प्रोटीन (जैसे, एβ42 और सूक्ष्मनलिका से जुड़े ताऊ प्रोटीन और एपोलिपोप्रोटीन ई) कई मस्तिष्क क्षेत्रों में मिसफोल्ड और सह-समुच्चय28,29। अमाइलॉइडोजेनिक प्रोटीनेशियस संरचनाएं एडी की एक प्रमुख पैथोलॉजिकल पहचान हैं और संभवतः रोगजननमें योगदान करती हैं 3.

रोगग्रस्त मानव मस्तिष्क से अमाइलॉइड फाइब्रिल की शुद्धि एक थकाऊ और चुनौतीपूर्ण कार्य है और इसकी कई सीमाएं हैं। मौजूदा तरीकों का एक प्रमुख दोष निकाली गई सामग्री की कम शुद्धता है, जो अक्सर क्रायोईएम जैसे इमेजिंग विधियों का उपयोग करके उनके विस्तृत संरचनात्मक विश्लेषण को प्रतिबंधित करता है। इसी तरह, एनएमआर अध्ययनों के लिए कुछ मिलीग्राम शुद्ध सामग्री की आवश्यकता होती है, जिसे भारी आइसोटोप (यानी, 15एन) 30 के साथ लेबल करने की भी आवश्यकता होती है। पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क पहली आवश्यकता को पूरा कर सकता है, क्योंकि प्रारंभिक सामग्री को मानव ऊतकों के कुछ ग्राम तक बढ़ाया जा सकता है; हालांकि, भारी आइसोटोप के साथ मानव मस्तिष्क के ऊतकों को लेबल करना संभव नहीं है। दूसरी ओर, 15एन आइसोटोप के साथ एडी माउस मॉडल को लेबल करना संभव है (हालांकि महंगा) और अब तेजी से आम31,32 है। हमारी प्रयोगशाला ने बीमारी और उम्र बढ़ने के दिमाग के दौरान सिनैप्टिक प्रोटीन टर्नओवर गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए पल्स-चेस लेबलिंग का उपयोगकिया है 14. हमने लंबे समय तक रहने वाले प्रोटीन की पहचान करने और विस्तृत जैविक संरचनाओं33,34 में उनकी शारीरिक प्रासंगिकता को समझने के लिए पूरे पशु भारी आइसोटोप लेबलिंग का भी उपयोग किया है। हालांकि, माउस मस्तिष्क के लिए, फाइब्रिल कोर की व्यावहारिक मात्रा प्राप्त करने के लिए बड़ी मात्रा में प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता होती है। यह विधि मौजूदा जैव रासायनिक अलगाव सिद्धांतों को संशोधित करके निकाले गए अमाइलॉइड फाइब्रिल की उपज और शुद्धता में सुधार करके इन मुद्दों को सफलतापूर्वक संबोधित करती है। इसलिए, मस्तिष्क के ऊतकों से अमाइलॉइड फाइब्रिल निष्कर्षण के लिए इस मजबूत प्रोटोकॉल का उपयोग क्रायोईएम और एनएमआर-आधारित संरचनात्मक अध्ययनों के लिए आसानी से किया जा सकता है।

यह विधि मौजूदा सुक्रोज घनत्व ढाल-आधारित उपकोशिकीय विभाजन प्रतिमान का उपयोग करती है और क्रमिक चरणों में निरर्थक सह-शुद्ध प्रोटीन को हटा देती है। सेल मलबे, माइलिन, डीएनए और सेलुलर लिपिड को हटाने के बाद, अमाइलॉइड समृद्ध एसडीएस अघुलनशील छर्रों को अलग किया जाता है। कई अल्ट्रासोनिकेशन युग्मित एसडीएस वॉश के अतिरिक्त चरणों का समावेश सह-शुद्ध सेलुलर घटकों, शिथिल बाध्य प्रोटीन और अमाइलॉइड के छोटे एसडीएस घुलनशील बहुरूपताओं की संख्या को कम करने में मदद करता है। अंतिम गोली अल्ट्राप्योर पानी में घुलनशील है और इसका उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें सीडिंग प्रयोग, जैव रासायनिक या औषधीय अध्ययन और संरचनात्मक विश्लेषण शामिल हैं। एडी मस्तिष्क के ऊतकों से शुद्ध अमाइलॉइड फाइब्रिल का उपयोग एमएस-आधारित प्रोटिओमिक्स का उपयोग करके फाइब्रिल कोर की प्रोटिओमिक संरचना और संरचनात्मक विशेषताओं को समझने के लिए भी किया जाता है। इस विश्लेषण ने फाइब्रिल के मूल में सेलुलर प्रोटीन ( चित्रा 4 में दर्शाया गया) के सबसेट की उपस्थिति की पुष्टि की, जो लंबे समय तक एमिलॉयड फाइब्रिल के गठन, बढ़ाव और स्थिरीकरण में एक से अधिक प्रोटीन की संभावित भूमिकाओं का संकेत दे सकता है। इस विश्लेषण में पहचाने गए कुछ प्रोटीन एक से अधिक न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार के साथ उनके सहयोग के लिए जाने जाते हैं, उदाहरण के लिए, एडम 22, एपीपी, एपीओई, β-कैटेनिन न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन, 14-3-3 प्रोटीन, और अन्य।

ऐसी संभावनाएं हैं कि कुछ दूषित प्रोटीन इस तथ्य के कारण प्रोटिओमिक विश्लेषण में दिखाई दे सकते हैं कि, होमोजेनाइजेशन के बाद, अमाइलॉइड फाइब्रिल की उच्च हाइड्रोफोबिसिटी के कारण प्रोटीन के बीच कुछ अनुचित बातचीत हो सकती है। इनमें से कुछ प्रोटीन कोर से चिपके रहते हैं और सोनिकेशन और एसडीएस धोने के चरणों के कई दौर के बाद भी नहीं हटाए जाते हैं। यह इस अमाइलॉइड शुद्धिकरण रणनीति की एक सीमा है। हालांकि, इसे उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रणों का उपयोग करके और बड़े पैमाने पर प्रोटिओमिक अध्ययनों में प्रभावी सांख्यिकीय कटऑफ का प्रदर्शन करके संबोधित किया जा सकता है। एक और सीमा जिसका हमने सामना किया, ट्रिप्सिन पाचन के बाद एβ पेप्टाइड बहुतायत के कम अनुमान से संबंधित है। यह एक लक्षित MS/MS विश्लेषण रणनीति द्वारा इस वर्कफ़्लो में संबोधित किया गया है। केईजीजी मार्गों के लिए जीओ विश्लेषण कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में शामिल मार्गों से संबंधित प्रोटीन की प्रचुरता को इंगित करता है, उदाहरण के लिए, अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस), और प्रियन रोग। ये प्रोटीन कई पैथोलॉजिकल मार्गों में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं और इस प्रकार, रोग दीक्षा और प्रगति में ज्ञात भागीदारी है। दिलचस्प बात यह है कि इनमें से कुछ प्रोटीनों को एडी और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों की विकृति में उनकी संभावित भागीदारी निर्धारित करने के लिए आगे के विश्लेषण की आवश्यकता होती है।

अन्य रोग मॉडल से शुद्ध अमाइलॉइड सामग्री पर भविष्य के अध्ययन कोर फाइब्रिल के संरचनात्मक पैटर्न और संरचना की गहन समझ प्रदान कर सकते हैं और प्रमुख चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने में मदद कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान आर 01 एजी 061865 द्वारा आरजेवी और जेएनएस को समर्थित किया गया था। लेखकों ने नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी में वासर और सावास अनुसंधान समूह के सदस्यों को उनकी विचारशील चर्चाओं के लिए धन्यवाद दिया। हम डॉ (ओं) को भी ईमानदारी से धन्यवाद देते हैं। अंसगर सीमर और राल्फ लैंगेन पर दक्षिण कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय उनके महत्वपूर्ण इनपुट के लिए। हम नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर एडवांस्ड माइक्रोस्कोपी में नमूना तैयार करने और नकारात्मक धुंधला इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए डॉ फरीदा कोराबोवा को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm Thermo Scientific 164535 Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody Biolegend 803001
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody Biolegend 800701
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody IBL America 10323
anti-amyloid fibril LOC antibody  EMD Millipore AB2287
BCA kit Thermo Fisher Scientific 23225
Bioruptor Pico Plus Diagenode B01020001
Calcium Chloride Sigma-Aldrich  C1016
Collagenase Sigma-Aldrich C0130
Complete  Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 11697498001
Dnase I Thermo Fisher Scientific EN0521
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
HyperSep C18 Cartridges Thermo Fisher Scientific 60108-302
Integrated Proteomics Pipeline - IP2  http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich I1149
K54 Tissue Homogenizing System Motor Cole Parmer Glas-Col 099C
MaxQuant https://www.maxquant.org/
Micro BCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
Nanoviper 75 μm x 50 cm Thermo Scientific 164942
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter BR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin Columns Thermo Fisher Scientific 89870
Precellys 24 tissue homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer Promega V2072
RawConverter http://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Sodium azide VWR 97064-646
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 74255
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002446
Speed Vaccum Concentrator Labconco 7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-2G
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific 15568025
Trypsin Gold-Mass spec grade Promega V5280
UltiMate 3000 RSLCnano System Thermo Scientific ULTIM3000RSLCNANO

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References

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Upadhyay, A., Vassar, R. J., Savas,… More

Upadhyay, A., Vassar, R. J., Savas, J. N. Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain. J. Vis. Exp. (182), e63816, doi:10.3791/63816 (2022).

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