Summary
Intravitreala injektioner utfördes i fårögat i syfte att leverera virusmedierad genterapi till näthinnan.
Abstract
Det finns flera metoder för leverans av terapeutiska medel till näthinnan, inklusive intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periokulär eller topisk administrering. IVT-läkemedelsleverans innebär en injektion i ögats glasögonhumor, en gelatinös substans som fyller ögats bakre kammare och bibehåller ögonglobens form. Även om IVT-vägen är mindre specifikt riktad än subretinal leverans, är den mycket mindre invasiv och används ofta i kliniska miljöer för en rad okulära sjukdomar.
Vi har tidigare visat effekten av intravitreal leverans av en adenoassocierad virusprodukt (AAV)-medierad genterapiprodukt (AAV9. CLN5) hos får med en naturligt förekommande CLN5-form av neuronal ceroid lipofuscinos (NCL). Drabbade får fick IVT-genterapi på ena ögat, medan det andra obehandlade ögat fungerade som en intern kontroll. Retinal struktur och funktion bibehölls i det behandlade ögat upp till 15 månader efter behandlingen, medan det obehandlade ögat uppvisade gradvis minskande funktion och svår atrofi under postmortemundersökning. Baserat på fårstudierna godkändes CLN5-genterapiprodukten som en kandidat för prövningsläkemedel (IND) av United States Food and Drug Administration i september 2021. Detta dokument beskriver det kirurgiska protokollet för IVT-leverans av en terapeutisk viral vektor till fårögat.
Introduction
Flera metoder kan användas för att leverera terapeutiska medel till näthinnan, inklusive intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periokulär eller topisk administrering. Varje administreringsväg innebär att man övervinner barriärer som blod-näthinnebarriären eller de inre och yttre begränsande membranen och har varierande effekthastigheter beroende på läkemedlet som levereras och det specifika näthinnemålet 1,2.
IVT drug delivery innebär en injektion i ögats glasögonhumor, en gelatinös substans som upptar ögats bakre kammare. Den primära funktionen hos glaskroppen är att bibehålla formen på ögongloben och hålla okulära vävnader, såsom linsen och näthinnan, på plats. Glaskroppen består till stor del av vatten, med små mängder kollagen, hyaluronsyra och andra icke-kollagena proteiner3. IVT-injektion är ett enkelt och vanligt förfarande som används rutinmässigt för att behandla ett brett spektrum av okulära tillstånd, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration, diabetiskt makulaödem, diabetisk retinopati, retinal venocklusion och flera ärftliga retinala dystrofier 4,5.
Neuronala ceroid lipofuscinoser (NCL; Batten sjukdom) är en grupp dödliga lysosomala lagringssjukdomar som orsakar allvarlig degenerering av hjärnan och näthinnan. Det finns för närvarande 13 kända varianter av NCL som härrör från mutationer i olika gener (CLN1-8, CLN10-14) som främst drabbar barn men har varierande debutålder och sjukdomens svårighetsgrad6. NCL delar gemensamma progressiva symtom, inklusive kognitiv och motorisk nedgång, anfall och synförlust. Det finns inget botemedel mot NCL; hjärnriktad enzymersättningsterapi är dock för närvarande i kliniska prövningar för CLN2-sjukdom7,8, och AAV-medierad genterapi har visat stort löfte i prekliniska studier, med en klinisk prövning för CLN5-genterapi som förväntas börja 2022 9,10.
Många andra arter utvecklar naturligt förekommande former av NCL, inklusive katter, hundar, får och kor. Två fårmodeller av NCL är för närvarande under aktiv studie i Nya Zeeland: en CLN5-sjukdomsmodell i Borderdale-får och en CLN6-sjukdomsmodell i South Hampshire-får. Drabbade får uppvisar många av de kliniska och patologiska egenskaperna hos den mänskliga sjukdomen, inklusive retinalatrofi och synförlust10,11. Även om hjärnriktad CLN5-genterapi hos får med CLN5-sjukdom kan förhindra eller stoppa hjärnatrofi och klinisk nedgång, förlorar de behandlade fåren fortfarande sin syn9. Detta belyste behovet av att behandla näthinnan för att bevara synen och upprätthålla en bättre livskvalitet, vilket ledde till upprättandet av ett protokoll för okulär genterapi hos får.
Fårögat representerar en bra modell av det mänskliga ögat på grund av dess likhet i ögonglobdimensioner, glaskroppsvolym och retinal struktur10,12,13. Detta dokument beskriver det kirurgiska protokollet för IVT-leverans av en liten volym (≤100 μL) terapeutisk virusvektor till fårögat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll godkändes av Lincoln University Animal Ethics Committee och är i linje med US National Institutes of Health riktlinjer för vård och användning av djur i forskning och Nya Zeelands djurskyddslag (1999). Borderdale får diagnostiserades vid födseln14 och upprätthölls vid Lincoln University forskningsgårdar. Tre 3 månader gamla homozygota (CLN5-/-) tackor fick en enda IVT-injektion på vänster öga, där det obehandlade högra ögat fungerade som en intern kontroll. Elektroretinografi- och patologidata jämfördes med historiska friska och påverkade kontrolldata. Den virala vektorn som användes i denna studie var ett självkomplementärt adenoassocierat virus serotyp 9, innehållande kycklingbetaverkan (CBh) promotor och kodonoptimerad får CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt). Den virala vektorn tillhandahölls av University of North Carolina Vector Core, NC, USA.
1. Prekirurgi
- Autoklavera operationssatsen (figur 1).
- Snabba fåren i 24 timmar före operationen.
- Registrera levande vikter före operationen.
Figur 1: Intravitreal kirurgi kit. Instrument som krävs för IVT-kirurgi inkluderar (1) ett spekulum för att hålla ögonlocken öppna och (2) ett par böjda nästångar för att ta tag i bulbarkonjunktiva och rotera ögat. (3) En rak noshemostat ingår också som ett alternativt instrument för att greppa bulbarkonjunktiva och hålla ögat på plats om det har rullat tillbaka in i ögonbanan. Detta kit är autoklaverat före operationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Kirurgiskt ingrepp
- Håll fast djuret och raka ullen från ena sidan av halsen över halsvenen med hjälp av elektroniska klippare.
- Täpp till halsvenen genom att applicera tryck vid basen av halsspåret och visualisera den upphöjda venen.
- Dra upp lämplig mängd diazepam (0,3 mg/kg) och ketamin (7,5 mg/kg) i en steril spruta och fäst en steril 20 G-nål. För in nålen i halsvenen och dra försiktigt tillbaka kolven för att säkerställa att blod kommer in i navet och nålen är inne i venen. När det har bekräftats, inducera genom intravenös (jugulär) administrering.
- Omedelbart efter induktion, placera djuret i dorsal recumbency, förläng nacken och håll tungan upp och framåt, med hjälp av ett laryngoskop för att visualisera struphuvudet. Utför endotrakeal intubation genom att försiktigt sätta in ett endotrakealt rör (storlek 6,0-9,0 beroende på fårens storlek) mellan stämbanden när djuret andas ut. Blås upp endotrakealmanschetten omedelbart och säkra röret med ett band runt underkäken. Bekräfta luftflödet genom röret.
- Överför fåren till operationsbordet och placera det i lateral recumbency.
- Anslut omedelbart endotrakealröret till slangarna på anestesimaskinen för leverans av isofluran i 100% syre. Börja initialt med 3%-4% isofluran och minska sedan till 2%-3% för underhåll. Observera fårens spontana ventilation.
- Övervaka hjärtfrekvens (puls), andningsfrekvens, syremättnad, CO2-nivåer i slutet av tidvattnet och rektal kroppstemperatur under hela proceduren. Se tabell 1 för fysiologiska värden för dessa parametrar hos sövda får (variabel, men använd som vägledning).
- Placera ett stort, sterilt, fyrkantigt draperi på en kirurgisk operationsvagn, följt av de sterila instrumenten.
- Placera ett sterilt, fenestrerat kirurgiskt draperi över ögat som ska injiceras.
- Desinficera ögat aseptiskt med en steril 20 ml spruta för att bevattna ögat med 1-5% povidon-jodlösning.
- Applicera 1-2 droppar Alcaine 0,5% W/V oftalmisk lösning, som lokalbedövning, på ögat.
- Montera ett Nopa Barraquer-Colibri ögonspekulum (10 mm) på ögonlocken för att hålla ögat öppet.
- Ta tag i bulbarkonjunktiva på den dorsolaterala aspekten av ögat med pincett och rotera ögongloben ventromedialt.
| Medveten | Bedövas | Rekommenderad kritisk interventionspunkt | |
| Puls (slag/min) | 50-80 (vila) till 280 (aktiv) | 50-80 | <50, >100 |
| Andningsfrekvens (andetag/min) | 15-40 (vila) till 350 (överhettad) | 10-30 | <8, >40 |
| Syremättnad (mm Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| Slutvatten-CO2 (mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| Kroppstemperatur (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
Tabell 1: Fysiologiska värden för parametrar som ska övervakas hos sövda får.
3. Viral beredning
- Förvara aav-vektoralikvoter vid −80 °C tills de används.
- På operationsdagen tina det önskade antalet injektionsflaskor för IVT-leverans på is.
- Omedelbart före administrering, virvla virusvektorn alikvot och centrifugera vid 400 × g i 10 s för att samla innehållet.
- Späd varje viral vektoralikvot i sterilfiltrerad 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till önskad dos i en slutlig volym av 100 μl. Förbered vektorutspädningar i ett sterilt 1,5 ml lågproteinbindande mikrocentrifugrör med sterila filterpipettspetsar. Kassera alla förbrukningsvaror som har varit i kontakt med virusvektorn i desinfektionslösning (se materialförteckningen).
OBS: I den ursprungliga publikationen15 dosen av det terapeutiska medlet (AAV9. CLN5) var 1,9 x 1010 virala genom. Den rekommenderade dosen varierar beroende på det terapeutiska medel som administreras; Därför har en dos inte inkluderats i standardprotokollet som presenteras här. - Dra hela 100 μl av AAV-vektorpreparatet till en steril, lågdöd 1 ml spruta med en permanent fäst 28 G x 1/2 nål för omedelbar injektion. Se till att tiden från beredning till injektion är mindre än 2 min.
4. Viral administrering
- För in nålen ungefär 7 mm bakåt i sclera på ögats sidosida och vinklas bakåt för att undvika linsen (figur 2 och figur 3). Administrera den enda injektionen av 100 μL som en bolus så nära näthinnan som möjligt utan att störa näthinnans yta.
- Skölj ögat med cirka 10-15 ml 1-5% povidon-jodlösning följt av 10 ml saltlösning innan spekulum och draperi avlägsnas.
- Vänd fåren och upprepa med det andra ögat om det behövs.
Figur 2: Ventromedial rotation av ögongloben . (A) Ta tag i bulbarkonjunktiva med nontoothed pincett och (B) rotera ventromedialt (dvs. ner och mot nosen) för att exponera ögats dorsolaterala yta för injektion. Förkortningar: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Injektionens placering och djup. Nålen injiceras på den dorsolaterala aspekten av ögongloben och nålaxelns fulla längd (0,5 tum/12,7 mm) sätts in i ögat. Notera nålens vinkel mot ögats bakre del för att undvika linsen och injicera så nära näthinnan som möjligt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Postoperativ hantering
- När proceduren är klar, stoppa isoflurankasinhalationsanestesi, spola linjen med 100% syre, koppla bort slangen från endotrakealröret och överför fåren till uppvakningsrummet.
- Placera fåren i sternal recumbency, med benen undangömda under, och övervaka tills full återhämtning. Se till att djurets mun är fri från hinder.
- När sväljningsreflexen observeras, töm delvis manschetten på endotrakealröret och ta försiktigt bort röret från munnen.
- Administrera en intramuskulär icke-steroidal antiinflammatorisk i biceps femoris-muskeln i bakbenet, subkutana antibiotika på sidan av nacken eller bakom axeln och 0,5% kloramfenikol ögondroppar till ytan av ögongloben.
- Ge vatten och mat (lusernpellets och agnar) när fåren kan stå utan hjälp.
- Administrera 0,5% kloramfenikol ögondroppar 2-3 per dag i 7 dagar efter operationen.
- Håll fåren inomhus över natten innan du återvänder till utomhushagen cirka 24 timmar efter operationen.
- Spela rektala temperaturer dagligen i 3 veckor. Övervaka eventuella förändringar i puls eller andningsfrekvens, matkonsumtion, neurobeteende, kroppstemperatur, vikt, hållning, ögonhälsa och kliniska tecken på ohälsa. Sök lämplig veterinärbehandling om det finns några indikationer på biverkningar.
6. Bedömning av effekt in vivo
- Om målet med IVT-injektionen är att bevara synen, övervaka effekten in vivo med metoder som labyrinttestning eller elektroretinografi (ERG) för att bedöma retinalcellfunktionen eller optisk koherenstomografi (OCT) för att bedöma retinal struktur.
OBS: Dessa effektmått har beskrivits väl efter IVT-genterapi11,15,16.
7. Vävnadsanalys efter döden
- Utför fåravlivning med en godkänd metod vid ett lämpligt effektmått efter intravitreal injektionskirurgi.
OBS: Föreslagna eutanasimetoder, såsom intravenösa veterinära eutanasiläkemedel eller en penetrerande bult i livmoderhalsen följt av snabb exsanguination, beskrivs någon annanstans15,16. - Skörda fårögonglober med kirurgisk skarp/trubbig böjd sax. Skär den laterala och mediala canthus för att öka ögonhålans öppning och skär sedan systematiskt genom konjunktivalvecken, bindväven, musklerna och synnerven för att frigöra ögonklotet från uttaget.
- Nedsänkning-fixera intakta, enucleated ögonglober i 10% formalin i 2 h, följt av postfixering i Bouins lösning i 4 h, vilket gör ett litet (0,5 cm) snitt i sclera för att möjliggöra tillräcklig perfusion. Alternativt kan du doppa ögongloberna i Davidsons lösning i 48 timmar.
- Bearbeta delar av ögonvävnaden via rutinmässig paraffinvaxinbäddning och sektionering vid 3-5 μm.
OBS: Färgningsförfaranden för hematoxylin- och eosinfärgning (H&E) och immunohistokemisk analys har beskrivits tidigare15,16. - Bedöm effekten i vävnad efter döden genom åtgärder som total retinal tjocklek, retinal skikttjocklek, antal yttre kärnskikt cellulära rader och immunohistokemisk färgning för retinala celltyper, retinal glia eller proteiner av intresse.
OBS: För protokoll för dessa analyser, se tidigare publikationer15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av IVT-leverans av en CLN5-genterapivektor för att dämpa retinal dysfunktion och degeneration hos får med CLN5 NCL har tidigare visats av denna forskargrupp15. Drabbade får fick en enda 100 μL IVT injektion av CLN5 förpackad i en AAV serotyp 9 (AAV9) vektor (AAV9. CLN5) i ett öga, med det kontralaterala ögat som en obehandlad intern kontroll. Synen bedömdes varje månad från injektionsåldern (3 månader) till sjukdomen i slutstadiet (18 månader). Postmortemanalys av retinal histologi utfördes på behandlade och obehandlade ögon, samt åldersmatchade friska och CLN5-drabbade kontroller.
Analys av elektroretinografi (ERG) visade bevarad näthinnefunktion i det behandlade ögat, medan det obehandlade ögat minskade på ett liknande sätt som CLN5-drabbade djur (figur 4)15. Retinal histologi var nästan normaliserad i det behandlade ögat, med en total retinal tjocklek jämförbar med friska kontrolldjur i den centrala näthinnan. Däremot var tjockleken på den obehandlade näthinnan jämförbar med CLN5-drabbade djur (figur 5)15. Lysosomal lagring, en kännetecknande patologisk egenskap hos NCL, observerades inte i det behandlade ögat men var närvarande i det obehandlade ögat15. Dessa resultat visar att genterapivektorn som levererades via IVT-injektion kunde stoppa sjukdomspatogenesen i det CLN5-drabbade fårögat. Uttrycket av glialfibrillärt surt protein (GFAP), en markör för näthinnestress och astroglia, var lägre i behandlade ögon än i obehandlade ögon, vilket indikerar att sjukdomsassocierad inflammation dämpades efter behandling (figur 6)15.
Figur 4: Mörkanpassade ERG-svar från CLN5-/- får efter intravitreal tillförsel av AAV9. CLN5. (A) Genomsnittliga (± SEM) ERG-amplituder över tid hos behandlade (mörkgröna, n = 3) och obehandlade (ljusgröna, n = 3) ögon hos CLN5-/- får, samt hälsosam kontroll (blå, n = 6) och CLN5-drabbade (röd, n = 6) får. B) Representativa ERG-spår från behandlade och obehandlade ögon och friska kontroller och drabbade får vid 5 (svart linje) och 17 (grå linje) månaders ålder. * anger P < 0,05. Denna figur som återges är från Murray et al.15 med tillstånd från Elsevier. Förkortningar: ERG = elektroretinografi; AAV = adenoassocierat virus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Näthinnetjocklek hos CLN5-/- får efter intravitreal leverans av AAV9. CLN5. Representativa fotomikrografer av H&E-histologisk färgning i behandlade och obehandlade ögon hos CLN5-/- får jämfört med åldersmatchade kontroller. Bilder och tjockleksmätningar togs på två platser; central näthinna (A-E) och perifer näthinna (F-J). (E) Genomsnittlig (± SEM) retinal tjocklek (μm) i den centrala näthinnan hos de behandlade (mörkgröna, n = 3) och obehandlade (ljusgröna, n = 3) ögonen jämfört med frisk kontroll (blå, n = 4) och CLN5-påverkad (röd, n = 4) näthinnan. (J) Genomsnittlig (± SEM) näthinnetjocklek (μm) i den perifera näthinnan hos de behandlade och obehandlade ögonen hos CLN5-/- får jämfört med frisk kontroll och CLN5-drabbad näthinna. * indikerar P < 0,05, **** indikerar P < 0,0001. Skalstänger = 50 μm. Denna siffra återges från Murray et al.15 med tillstånd från Elsevier. Förkortningar: NFL = nervfiberskikt; GCL = ganglioncellskikt; IPL = inre plexiformskikt; INL = inre kärnskikt; OPL = yttre plexiformskikt; ONL = yttre kärnskikt; IS/OS = inre och yttre segment av fotoreceptorer; RPE = retinal pigmentepitel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: GFAP-immunreaktivitet i näthinnan hos CLN5-/- får efter intravitreal tillförsel av AAV9. CLN5. Representativa konfokala bilder av GFAP-immunreaktivitet i behandlade och obehandlade ögon hos CLN5-/- får jämfört med kontroller. (A-D) GFAP-immunreaktivitet, (E-H) DAPI-kärnmarkör, (I-L) Sammanfogade bilder av de två kanalerna. Skalstreck = 20 μm. Denna siffra återges från Murray et al.15 med tillstånd från Elsevier. Förkortningar: NFL = nervfiberskikt; GCL = ganglioncellskikt; INL = inre kärnskikt; ONL = yttre kärnskikt; IS/OS = inre och yttre segment av fotoreceptorer; GFAP = glialfibrillärt surt protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intravitreala injektioner är ett av de vanligaste kirurgiska ingreppen inom human oftalmologi och har visat sig vara effektiva för att leverera AAV-medierade genterapier till fårens näthinna. Vi hade tidigare visat effekten av AAV9. CLN5-genterapi som levereras intravitret för att dämpa retinal dysfunktion och degeneration hos får med CLN5 NCL15. Förhoppningen är att översättningen av denna administreringsväg till humana NCL-patienter också kommer att visa sig vara till nytta.
Protokollet för IVT-injektioner med liten volym i ett fåröga är relativt enkelt och icke-invasivt, lätt reproducerbart och lätt för en icke-expert att lära sig. Framgången beror på målcellerna i näthinnan, terapin som levereras och placeringen och riktningen för själva injektionen. Även om IVT-injektioner ofta anses vara mest effektiva för att rikta in sig på inre näthinnelager, har många forskare visat effekten av IVT-injektioner vid sjukdomar där den yttre näthinnan är den primära platsen för sjukdomspatogenes15,17,18,19. Skillnaderna i funktionella och patologiska resultat efter IVT-injektioner relaterar sannolikt också till vilken typ av behandling som ges. Till exempel har genterapi för att leverera gener som kodar för lösliga proteiner (t.ex. CLN5) visat sig vara mycket effektivare än genterapier för att leverera gener som kodar för intracellulära eller membranbundna proteiner (t.ex. CLN6)15. Oavsett mål och typ av behandling är det viktigt att få injektionsstället och vinkeln korrekt för att maximera effekten. Som beskrivs i protokollet ska injektionsstället för får vara cirka 7 mm bakom sklera på ögats laterala sida och vinklas bakåt för att rikta in sig på det bakre glaskroppen. Nålens mete är både för att undvika linsen och för att rikta det injicerade läkemedlet så nära näthinnan som möjligt. Användningen av en säkerhetsspruta med en permanent fäst 28 G (eller mindre) x 0,5 i nål med lågt dött utrymme är avgörande för att minimera injektionsrelaterat obehag och dödvolym kvar i nålen eller navet. Denna längdnål kan sättas in helt i fårögat i en bakre vinkel utan kirurgiskt mikroskop och / eller risk för punktering av näthinnan. Forskare som har tillgång till ett kirurgiskt mikroskop kan använda detta för att ge en extra grad av säkerhet kring att undvika näthinnestörningar. Annars är det tillräckligt att använda säkerhetssprutor och vara medveten om fårögonglobens dimensioner vid den ålder som behandlas för att utföra denna procedur säkert15.
När du tar tag i ögat för att rotera det medialt och exponera injektionsstället är det viktigt att använda icke-tandade atraumatiska instrument för att undvika att skada den känsliga vävnaden i ögat. Om ögat är placerat centralt är det relativt enkelt att ta tag i bulbarkonjunktiva vid gränsen till sclera och iris och rotera med ena handen medan du injicerar med den andra handen. Men om ögat har roterat utanför centrum, vilket kan uppstå under generell anestesi, är det ofta nödvändigt att använda en hemostat för att klämma fast på bulbarkonjunktiva och rotera ögat på plats och lämna hemostaten på plats för att fortsätta med proceduren.
Fårögon är robusta och återhämtade sig väl efter IVT-behandling med AAV9 som bär på får CLN5, med endast ett får som utvecklar uveit i det behandlade ögat 1 vecka efter injektion15. I detta fall försvann uveit inom 1 vecka och hade ingen långsiktig inverkan på synen. Bortsett från detta enda fall rapporterades inga negativa effekter av IVT-injektioner i den första publicerade studien15, eller i de >30 ytterligare djuren i forskningsprogrammet injicerade vid 3 månader, 6 månader eller 9 månaders ålder efter protokollet som beskrivs här. Det finns dock ytterligare kvantitativa mått på injektionssäkerhet som forskare kanske vill överväga att lägga till i sina postoperativa bedömningar. Dessa inkluderar mått på intraokulärt tryck (IOP), fundus imaging eller OCT. Bilder av fundus före och efter injektion kan belysa om det har skett någon störning av näthinnan på grund av injektionen och kan på lång sikt ge en översikt över näthinnans hälsa i allmänhet.
I det fall en fluorescerande markör injiceras kan fluorescensavbildning av fundus hjälpa till att visualisera spridningen av den injicerade markören16,20. OCT kan användas för att visualisera näthinnan i tvärsnitt in vivo för att identifiera eventuella strukturella skador efter injektion och mäta näthinnans tjocklek över tid som svar på behandlingen. Den visuella funktionen efter injektionen kan också bedömas genom ERG eller labyrinttestning15,16. Vid IVT-virusmedierad genterapi bör effekten av immunsvaret och närvaron av neutraliserande antikroppar mot AAV-vektorer beaktas. Även om det inte ingår i protokollet som beskrivs här för får, föreslås det att försökspersoner testas för förekomst av anti-AAV-neutraliserande antikroppar före genterapi, oavsett administreringsväg, för att öka transduktionseffektiviteten 16,21. Läsarna hänvisas till en mer omfattande diskussion om frågan om immunsvar mot AAV av Whitehead et al.22.
En vanlig komplikation under IVT-procedurer är subkonjunktivalblödning (SCH)23, som kan uppstå om kapillärerna i bulbarkonjunktiva punkteras under nålinsättning. Lyckligtvis är SCH i allmänhet ofarligt och löser sig inom några dagar; Det är dock bäst att undvika konjunktivalkapillärer när du sätter in nålen. Efter injektion med IVT är det viktigt att behandla de injicerade ögonen med antibiotiska ögondroppar (t.ex. kloramfenikol) och övervaka ögonen för tecken på infektion eller inflammation (uveit). En annan vanlig händelse under IVT-procedurer är en ökning av IOP. Dessa ökningar är oftast övergående trycktoppar under minuterna efter injektionen och orsakar ingen långvarig skada24,25. Det finns dock fall där IOP bör övervägas och övervakas. När redan existerande okulära tillstånd såsom glaukom är närvarande, eller när högre volymer (≥100 μl) injiceras, bör IOP övervakas noggrant och profylaktisk främre kammarparacentes bör övervägas för att minska trycket i ögongloben 4,16. Dessutom kan upprepade spikar i IOP vid upprepade IVT-injektioner vara ett problem och bör dämpas som ovan4. Här demonstrerar vi IVT för en enda AAV-medierad genterapi; Därför är de långsiktiga konsekvenserna av upprepade injektioner inte en viktig faktor.
Begränsningar av IVT-injektioner inkluderar behovet av att penetrera anatomiska barriärer och den lägre målspecificiteten jämfört med mer invasiva metoder. Först späds det injicerade ämnet ut i glaskroppen och har sedan ett avstånd att diffundera genom glaskroppen och näthinnevävnaden till målcellerna. Detta innebär att den inre näthinnan är lättare att transducera än den yttre näthinnan efter IVT-injektion, och högre doser kan krävas för att motverka utspädning26. Protokollet som beskrivs här betonar vikten av att injicera så nära näthinnan som möjligt för att mildra effekterna av utspädning och diffusion genom glaskroppen. Därför sätts hela längden på nålskaftet på 0,5 tum/12,7 mm in i ögat. Den ytterligare fördelen med att föra in hela nållängden är den minskade risken för vätskeåterflöde under injektion 4,27.
Även om detta nuvarande protokoll utelämnar det, rekommenderas att fördröja avlägsnandet av nålen i flera minuter efter injektionen för att ytterligare minska risken för vätskeåterflöde. Dessutom ska injektionen göras långsamt för att säkerställa att strålen med injicerad vätska inte stör näthinnan eller orsakar en snabb ökning av IOP, och en ökad injektionshastighet påverkar inte diffusionshastigheterna genom glaskroppen28,29. Det inre begränsande membranet (ILM) är den primära barriären mellan glaskroppen och näthinnan, som fungerar för att begränsa molekylernas rörelse i näthinnan30. ILM: s permeabilitet kan emellertid ökas genom matsmältning eller kirurgisk skalning och ökar sannolikt i det sjuka ögat, vilket gör penetreringen av terapeutiska molekyler lättare.
När det gäller målspecificitet har IVT-administrering minst jämfört med andra intraokulära vägar såsom subretinal och suprachoroidal, som diskuterats ovan och på andra håll10. Nya generationer av AAV utvecklas dock rutinmässigt för att innehålla modifieringar, vilket förbättrar inriktningen på vissa celltyper eller mer effektivt övervinner hinder som ILM31. Användningen av sådana modifierade kapsider har ökat transduktionseffektiviteten efter IVT-administrering i ett antal modellarter 5,32,33.
Syftet med genterapin som beskrivs av Murray et al.15 var att leverera en funktionell kopia av CLN5-genen ; Därför är ett mått på effekt närvaron av transducerade celler som uttrycker CLN5-protein. Vi har försökt använda immunhistokemi för att upptäcka CLN5-transducerade celler i näthinnan, som vi rutinmässigt gör i fårhjärnvävnad; Antikroppen som vi vanligtvis använder i fritt flytande hjärnvävnad fungerar dock inte i paraffinbäddad näthinnevävnad. Felsökning och undersökning av alternativa sätt att upptäcka genen eller proteinet av intresse i näthinnan pågår för att öka effektbedömningen. Ett potentiellt sätt att uppnå detta är att injicera en viral vektor som innehåller en reportergen (såsom grönt fluorescerande protein; GFP) och bedömning av GFP-uttryck via immunhistokemi. Ett annat sätt att bedöma effekten är att använda kvantitativ PCR för att bedöma nivåer av transgenuttryck.
Att utveckla protokoll för IVT-injektioner hos stora djur är ett avgörande steg mot att behandla degenerativa sjukdomar i näthinnan, särskilt sjukdomar med en genetisk komponent, eftersom IVT-genterapi är en lovande potentiell terapeutisk. För degenerativa sjukdomar där näthinnan redan är skör innebär IVT-behandling mindre risk för näthinneavlossning eller rivning. Med tanke på likheterna i storlek och struktur hos fåren och mänskliga ögon är optimering av dosen och volymen av IVT-injektioner hos får ett relevant steg mot översättning till kliniken. Detta dokument beskriver protokollet för IVT-injektion i fårögat, vilket är säkert och visar en mycket låg frekvens av okulära inflammatoriska svar. Denna metod visar också effekten av AAV9-medierad okulär genterapi för att adressera retinalkomponenten i NCL hos får.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) för hans hjälp med att upprätta detta protokoll och utföra de injektioner som beskrivs av Murray et al.15. Författarna erkänner också finansiering från CureKids Nya Zeeland, Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc och Batten Disease Support and Research Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
