Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Elektroporeringsmedierad leverans av Cas9 Ribonukleoproteiner och mRNA i nyligen isolerade primära mushepatocyter

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63828
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver tekniker för att isolera primära mushepatocyter från levern och elektroporera CRISPR-Cas9 som ribonukleoproteiner och mRNA för att störa en terapeutisk målgen associerad med en ärftlig metabolisk sjukdom i levern. De beskrivna metoderna resulterar i hög viabilitet och höga nivåer av genmodifiering efter elektroporering.

Abstract

Detta protokoll beskriver en snabb och effektiv metod för att isolera primära mushepatocyter följt av elektroporationsmedierad leverans av CRISPR-Cas9 som ribonukleoproteiner (RPP) och mRNA. Primära mushepatocyter isolerades med hjälp av en trestegs retrograd perfusionsmetod som resulterade i höga utbyten på upp till 50 × 106 celler per lever och cellviabilitet på >85%. Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner för plätering, färgning och odling av hepatocyter. Resultaten indikerar att elektroporering ger en hög transfektionseffektivitet på 89%, mätt med andelen gröna fluorescerande protein (GFP) -positiva celler och blygsam cellviabilitet på >35% i mushepatocyter.

För att demonstrera nyttan av detta tillvägagångssätt elektroporerades CRISPR-Cas9 riktad mot hydroxifenylpyruvatdioxygenenen till primära mushepatocyter som proof-of-principle-genredigering för att störa en terapeutisk gen relaterad till en ärftlig metabolisk sjukdom (IMD) i levern. En högre målredigering på 78% observerades för RPP jämfört med 47% redigeringseffektivitet med mRNA. Funktionaliteten hos hepatocyter utvärderades in vitro med hjälp av en albuminanalys som indikerade att leverans av CRISPR-Cas9 som RPP och mRNA resulterar i jämförbar cellviabilitet i primära mushepatocyter. En lovande applikation för detta protokoll är generering av musmodeller för mänskliga genetiska sjukdomar som påverkar levern.

Introduction

IMD i levern är genetiska störningar som kännetecknas av bristen på ett avgörande leverenzym som är involverat i ämnesomsättningen som leder till ackumulering av toxiska metaboliter. Utan behandling leder IMD i levern till organsvikt eller för tidig död 1,2. Det enda botande alternativet för patienter med IMD i levern är ortotopisk levertransplantation, som är begränsad på grund av den låga tillgängligheten av donatororgan och komplikationer från immunsuppressiv behandling efter proceduren 3,4. Enligt de senaste uppgifterna som samlats in av Organ Procurement and Transplantation Network får endast 40%-46% av vuxna patienter på väntelistan för levertransplantation ett organ, medan 12,3% av dessa patienter dör medan de är på väntelistan5. Dessutom har endast 5% av alla sällsynta leversjukdomar en FDA-godkänd behandling6. Det är uppenbart att det finns ett kritiskt behov av nya behandlingar för IMD i levern. Lämpliga sjukdomsmodeller krävs dock för att utveckla nya terapeutiska alternativ.

Modellering av mänskliga sjukdomar med hjälp av in vitro- och in vivo-system är fortfarande ett hinder för att utveckla effektiva terapier och studera patologin för IMD i levern. Hepatocyter från patienter med sällsynta leversjukdomar är utmanande att få7. Djurmodeller är avgörande för att utveckla en förståelse för sjukdomspatologi och för att testa terapeutiska strategier. Ett hinder är dock att generera modeller från embryon som bär på dödliga mutationer. Till exempel resulterade försök att skapa musmodeller av Alagilles syndrom (ALGS) med embryon som innehåller homozygota deletioner av en 5 kb-sekvens nära 5′-änden av Jag1-genen i den tidiga döden avembryona 8. Dessutom kan det vara tids- och resurskrävande att generera musmodeller genom genredigering i embryonala stamceller9. Slutligen kommer mutationer att visas utanför den riktade vävnaden, vilket leder till förvirrande variabler som kan hindra studier av sjukdomen9. Somatisk genredigering skulle möjliggöra enklare redigering i levervävnad och kringgå utmaningarna med att generera modeller med embryonala stamceller.

Elektroporering möjliggör leverans av CRISPR-Cas9 direkt in i kärnan genom att applicera högspänningsströmmar för att permeabilisera cellmembranet och är kompatibel med många celltyper, inklusive de som är oförsonliga för transfektionstekniker, såsom mänskliga embryonala stamceller, pluripotenta stamceller och neuroner 10,11,12 . Emellertid är låg livskraft en potentiell nackdel med elektroporering; optimering av proceduren kan ge höga leveransnivåer samtidigt som toxicitetenbegränsas 13. En nyligen genomförd studie visar möjligheten att elektroporera CRISPR-Cas9-komponenter i primära mus- och humana hepatocyter som ett mycket effektivt tillvägagångssätt14. Ex vivo elektroporering i hepatocyter har potential att tillämpas för att generera nya musmodeller för humana IMD i levern.

Detta protokoll tillhandahåller en detaljerad steg-för-steg-procedur för att isolera mushepatocyter från levern och därefter elektroporera CRISPR-Cas9 som RNP-komplex, bestående av Cas9-protein och syntetiskt enledar-RNA (sgRNA), eller Cas9 mRNA kombinerat med sgRNA för att erhålla höga nivåer av genredigering på målet. Dessutom tillhandahåller protokollet metoder för att kvantifiera genredigeringseffektivitet, viabilitet och funktionalitet efter elektroporering av CRISPR-Cas9 till nyligen isolerade mushepatocyter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurförsöken utfördes alla i enlighet med riktlinjerna från institutional animal care and use committee och godkända protokoll vid Clemson University. Kirurgiska ingrepp utfördes på bedövade vildtyp C57BL / 6J möss mellan 8 och 10 veckor gamla.

1. Djurkirurgi

  1. Förberedelse av lösningar och instrument
    OBS: Perfusionslösningar och recept för anestesicocktail visas i materialtabellen.
    1. Förbered perfusionslösning 1 (HEPES, EGTA och EBSS), perfusionslösning 2 (HEPES, EGTA, EBSS, CaCl2 och MgSO4) och perfusionslösning 3 (lösning 2 och liberas). Se till att lösningarna är väl blandade.
    2. Ställ in vattenbadet på 42 °C och perfusionslösningarna 1, 2 och 3 före varningen i minst 30 minuter innan proceduren påbörjas och förvara dem i vattenbadet.
      OBS: Perfusionslösningar 1 och 2 kommer att kelatera kalcium och spola ut blodet i levern. Perfusionslösning 3 innehåller matsmältningsenzymet liberase för att dissociera den extracellulära matrisen.
    3. Placera 150 ml DMEM + 10% fetalt bovint serum (FBS) i koniska rör och håll dem på is.
      OBS: Detta medium kommer att användas för att frigöra cellerna från leverkapseln och tvätta de isolerade hepatocyterna i steg 2.1 respektive 2.2.
    4. Ställ in centrifugen på 4 °C.
    5. Sterilisera pumpslangen genom att placera båda ändarna av slangen i en kolv fylld med 70% etanol och cykla etanolen tre gånger.
    6. Tvätta slangen med destillerat vatten och töm den.
    7. Fyll slangen med förvärmd 30 ml perfusionslösning 1, följt av 8 ml perfusionslösning 2. Om slangen fortfarande har plats för mer vätska, fyll resten av slangen med Perfusion Solution 3. Stoppa pumpen när du byter till en annan perfusionslösning för att undvika att luftbubblor införs i slangen.
    8. Placera överskottsslangen i vattenbadet på 42 °C för att hålla perfusionslösningarna varma.
    9. Placera änden av pumpslangen i det koniska röret som innehåller perfusionslösning 3, medan den förvaras i vattenbadet.
      OBS: Detta steg är nödvändigt för att pumpen kontinuerligt ska kunna fyllas med perfusionslösning 3 under perfusion.
  2. Förberedelse av djur
    1. Bedöva musen genom att injicera bedövningscocktailen intraperitonealt i en dos av 10-11,7 μl/g kroppsvikt. Bedövningscocktailen har en slutlig koncentration på 7,5 mg / ml ketamin, 0,25 mg / ml acepromazin och 1,5 mg / ml xylazin.
    2. Övervaka musens andning och kontrollera att musen inte reagerar på smärta. Vänta tills musen har en andningsfrekvens på ~ 55-65 andetag per min, svarar inte på att få tårna klämda och har en slapp svans. Kontrollera dessutom palpebrala (blinkande) reflex genom att lätt röra vid huden på den mediala sidan av det slutna ögat. Om musen blinkar eller ögonmusklerna rycker, öka dosen av hela bedövningscocktailen med 5-10 μl.
    3. Placera musen på ryggen i ryggläge och fäst lemmarna på ytan med stift eller tejp (kompletterande figur S1).
    4. Spraya buken med 70% etanol och klappa den torr med en bomullstuss.
  3. Leverperfusion
    1. Gör ett U-format lateralt snitt i bukhuden med sax och expandera hålet genom sidorna.
    2. Fortsätt öppna huden mot bröstkorgen.
    3. Skär genom bukhinnan med sax för att exponera bukhålan upp till bröstkorgen, var försiktig så att du inte nickar några organ. Flytta tarmarna till höger sida med baksidan av pincett eller den trubbiga ytan av sax. Identifiera den underlägsna vena cava och portalvenen (kompletterande figur S1).
    4. Starta pumpen för att spola förvärmd perfusionslösning genom katetern.
    5. Stoppa pumpen och ta bort katetern när all luft har spolats genom systemet. För in nålspetsen som är ansluten till katetern i den underlägsna vena cava i en 10 ° -20 ° vinkel mot venen. Ta bort nålen från katetern och tryck försiktigt katetern in i venen i en rörelse parallellt med venen.
      OBS: Användaren bör observera flashback av blod i katetern för att verifiera korrekt kannulering i venen.
    6. Anslut slangen till katetern utan att flytta katetern längre in i venen.
    7. Starta pumpen med ett flöde på 2 ml/min. Leta efter levern som omedelbart blir blek som ett tecken på att perfusionen är framgångsrik.
    8. Klipp portalvenen med sax.
    9. Öka gradvis flödeshastigheten till 5 ml/min.
    10. Applicera tryck regelbundet på portalvenen på den ungefärliga skärplatsen i 3 s med pincett eller en bomullspinne för att blockera dräneringen och underlätta god perfusion.
    11. När Perfusion Solution 3 strömmar igenom, noggrant övervaka leverns elasticitet. För att avgöra om levern är mjukad, tryck försiktigt på levern med en bomullspinne eller pincett och kontrollera om indragningar bildas på levern. Var försiktig så att du inte överperfuse för att undvika förlust av cellviabilitet.
    12. När levern har mjuknat (inträffar efter att 30-50 ml perfusionslösning 3 har strömmat igenom), stoppa pumpen, ta bort katetern och dissekera levern försiktigt. Placera levern i en 100 mm petriskål som innehåller iskall DMEM + 10% FBS-medium. Skär gallblåsan, var försiktig så att du inte spiller innehållet. Virvla petriskålen för att försiktigt ta bort eventuella blodproppar.
    13. Överför levern till en ny petriskål som innehåller iskall DMEM + 10% FBS-medium.

2. Hepatocytisolering

  1. Släpp celler från leverkapseln.
    1. Placera petriskålen på is och använd två par sterila pincett, riv försiktigt isär leverkapseln på alla lober. Snurra försiktigt runt levern i mediet med hjälp av en celllyftare eller en tång för att frigöra hepatocyterna. Fortsätt denna rörelse tills levern blir mycket liten och suspensionen blir brun och ogenomskinlig.
    2. Ta bort resterna av levervävnaden från plattan och använd en 25 ml serologisk pipett inställd på låg hastighet, överför försiktigt cellsuspensionen till ett 50 ml koniskt rör (förspänt på is) utrustat med en 100 μm cellsil.
    3. Tillsätt färskt, iskallt DMEM + 10% FBS-medium till petriskålen för att tvätta ut och samla de återstående cellerna från ytan och överför till 50 ml koniskt rör. Upprepa detta steg tills alla celler har samlats in.
  2. Tvätta och rena hepatocyter från icke-parenkymala celler.
    1. Centrifugera de celler som samlats upp i 50 ml koniska röret vid 50 × g vid 4 °C i 5 min vid låg retardation eller utan bromsar.
    2. Kassera supernatanten som innehåller skräp och icke-parenkymala celler och återsuspendera pelleten i den kvarvarande supernatanten genom att försiktigt virvla röret. När pelleten har återsuspenderats, tillsätt 30 ml färskt, iskallt DMEM + 10% FBS-medium.
    3. Upprepa centrifugeringen (steg 2.2.1) och tvättningen (steg 2.2.3) tre gånger.
    4. Resuspendera den slutliga cellpelleten i 10 ml iskall DMEM + 10% FBS-medium.
      OBS: Volymen medium som används för att återsuspendera pelleten beror på pelletsstorleken. Om pelleten är betydligt mindre än 15 mm, använd 1-5 ml iskall DMEM + 10% FBS-medium.
  3. Kvantifiering av cellviabilitet
    1. I ett mikrofugerör, tillsätt 50 μL 0,4% Trypan Blue-lösning till 350 μL hepatocytpläteringsmedium (PM). Tillsätt sedan 100 μl cellsuspension för att göra en slutlig 1:5 utspädning och pipettera upp och ner flera gånger för att blanda.
    2. Räkna celltäthet och livskraft med hjälp av en hemocytometer. Medan du räknar, placera hepatocytsuspensionen på is och placera sedan ishinken på en orbital shaker inställd på 30 rpm för att förhindra att hepatopatocyterna sätter sig.
    3. Följ Percoll-behandlings- och centrifugeringsstegen nedan om cellviabiliteten är <70%.
      1. Späd Percoll med 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett förhållande 9: 1.
      2. Blanda hepatocytsuspensionen med den utspädda Percoll i förhållandet 1:1.
      3. Centrifugera vid 200 × g vid 4 °C i 10 min.
      4. Kassera supernatanten som innehåller döda celler. Resuspendera pelleten i iskall DMEM + 10% FBS-medium.
      5. Räkna cellerna igen.
  4. Testning av hepatocyter för plattbarhet
    1. Platta några av cellerna på kollagen I-belagda 6-brunnsplattor med en densitet av 0,5 × 106 celler per ml med 1,5 ml förvarnad PM.
    2. Håll de återstående cellerna på is medan du är på en orbitalskakare tills de är redo att utföra elektroporering.
    3. Placera cellplattan i en vattenmantlad CO2-inkubator vid 37 °C. Flytta plattan horisontellt och vertikalt försiktigt i en nord-till-syd- och öst-till-väst-rörelse för att säkerställa homogen plätering. Upprepa rörelsen ytterligare två gånger var 1,5: e timme.
    4. Kontrollera cellfästet vid 3 timmar efter plätering.
      OBS: Minst 60% av cellerna ska fästa vid plattan som en indikator på hepatocyter av god kvalitet.
    5. Byt medium till förvärmt hepatocytunderhållsmedium (MM) vid 24 timmar efter plätering för att bibehålla cellerna i odling.
  5. Glykogenfärgning
    1. Efter att cellerna har fästs på de 6-brunnar kollagen I-belagda plattorna, ta bort det förbrukade mediet från de odlade cellerna.
    2. Fixa cellerna i 10-15 min i iskall etanol.
    3. Tvätta noggrant med sterilt vatten.
    4. Inkubera i 1% vattenhaltig periodisk syra i 5 min och tvätta sedan med sterilt vatten.
    5. Inkubera i 100% Schiff-reagens i 30 minuter.
      OBS: Schiff-reagenset får inte spädas innan det tillsätts cellerna.
    6. Tvätta med vatten tre gånger under 10 min.
    7. Montera i monteringsmedium.
    8. Bild med hjälp av ett mikroskop på brightfield-inställningen.

3. Designa sgRNA för CRISPR-Cas9 genredigering

OBS: Detta avsnitt beskriver utformningen av ett sgRNA som riktar sig mot musens hydroxifenylpyruvatdioxygenas (Hpd) -gen som bevis på principgenredigering för att störa en terapeutisk målgen relaterad till en IMD i levern.

  1. Designa guidesekvensen som riktar sig mot Hpd med hjälp av den refererade programvaran15.
  2. Verifiera sekvensen för Hpd med Ensembl Genome Browser.
  3. Använd följande parametrar för att utforma gRNA: enkel styrlängd på 20 nukleotider och en NGG (N kan vara vilken nukleotid som helst) protospacer-intilliggande motiv (PAM) -sekvens.
  4. Välj en målregion från exon 3 i Hpd.
  5. Generera en lista med guidesekvenser från målregionen med På- och Av-målpoäng.
    Obs: On-Target-poängen indikerar förutsagd redigeringseffektivitet på målet för den givna designen: en högre poäng är korrelerad med högre redigeringseffektivitet. Off-Target-poängen korrelerar med guidesekvensens specificitet: en högre poäng indikerar lägre sannolikhet för redigering utanför målet. Helst bör båda poängen vara höga: On-Target-poängen >60 och Off-Target-poängen >50.
  6. Välj guidesekvensen med de högsta on-target- och off-target-poängen. Låt sgRNA som innehåller styrsekvensen syntetiseras kemiskt.

4. Elektroporering och cellodling

  1. Beredning av CRISPR-Cas9 substrat, media, celler och elektroporationsinstrumentet
    1. Tillsätt hela det medföljande tillskottet till PM och värm i 37 °C vattenbadet i 10 min.
    2. Slå på elektroporeringsenheten genom att trycka på strömbrytaren och ställa in elektroporeringsprogrammet genom att trycka på x-knappen och sedan nedåtpilen tills programmet T-028 visas på skärmen.
    3. Förbered destinationsbrunnarna för de elektroporerade hepatocyterna genom att tillsätta 1,5 ml PM till sexbrunns kollagen I-belagda plattor. Inkubera plattorna i en 37 °C inkubator tills de är färdiga att användas.
    4. Tillsätt hela det medföljande tillskottet till elektroporeringsbuffertlösningen och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter.
      OBS: Märk utgångsdatumet för elektroporationsbufferten på injektionsflaskan (3 månader efter datumet för tillägg).
    5. Ta bort elektroporeringskärlen från förpackningen och märk dem för varje prov.
    6. I PCR-split-strip-rör, förbered Cas9 RNP-komplexen genom att kombinera 30 μg sgRNA med 300 pmol Cas9-protein och inkubera komplexen vid rumstemperatur i 10 min. Förbered Cas9 mRNA genom att kombinera 30 μg sgRNA med 4 μL Cas9 mRNA (1 μg/ μL). Förvara mRNA-sgRNA-blandningen på is tills elektroporering. Förbered separat ett rör innehållande 1,0 μg eGFP mRNA för att verifiera framgångsrik elektroporering med hjälp av fluorescensmikroskopi.
    7. Centrifug 1.2 × 106 celler per elektroporeringsreaktion vid 100 × g i 2 min vid 4 °C.
    8. Ta bort supernatanten från cellpelleten och tillsätt 100 μL elektroporeringslösning per reaktion längs sidan av rörväggen. Återsuspendera hepatocyterna i elektroporeringslösningen genom att gunga röret försiktigt för hand.
  2. Elektroporering av CRISPR-Cas9 RPP och mRNA till hepatocyter
    1. När hepatocyterna verkar jämnt dispergerade i elektroporeringslösningen, överför 100 μL av hepatocytsuspensionen till remsrören som innehåller Cas9-komplexen.
      OBS: Använd pipettspetsar med bred borrning vid överföring av hepatocyter för att bevara cellviabiliteten.
    2. Överför innehållet i remsan väl till ett elektroporeringskärl.
    3. Placera nukleovettkärlet i spåret på elektroporeringsanordningen. Elektroporera hepatocyterna genom att trycka på x-knappen . Efter elektroporering, vänta tills en skärm dyker upp på enheten som säger OK. Tryck på x-knappen igen och ta bort kärlet.
    4. Inkubera det elektroporerade kärlet på is i 15 minuter.
    5. Tillsätt 500 μL förvärmd PM till elektroporeringskärlet.
    6. Överför 300 μL av elektroporeringsreaktionen till varje destination väl på den förvärmda plattan.
      OBS: Det bör finnas två destinationsbrunnar per elektroporeringsreaktion. En brunn kommer att användas för att kvantifiera genredigeringseffektivitet; den andra brunnen kommer att användas för MTT- och albuminanalyser.
    7. För att förhindra att hepatocyter ackumuleras i mitten av brunnen, sprida cellerna genom att försiktigt flytta plattor horisontellt och vertikalt i en nord-till-syd och öst-till-väst-rörelse. Se till att plattan håller kontakt med inkubatorhyllan medan den flyttas. Upprepa denna rörelse vid 15, 30, 45, 60 och 90 min efter plätering av de elektroporerade hepatocyterna.
    8. Inkubera plattorna över natten vid 37 °C.
    9. Ta bort mediet från de brunnar som är avsedda för genredigeringsanalys 24 timmar efter plätering av cellerna och ersätt med 0,25 mg / ml källarmembranmatrisöverlägg.
      OBS: Om den förvaras i frysen, överför membranmatrisen till 4 °C och låt den tina. Eftersom källarmembranmatrisen är fast över 10 °C är det viktigt att källarmembranmatrisen förblir på is eller vid 4 °C tills den är klar att användas.

5. Beräkna volymen av membranmatrisen som ska blandas med MM för att ge en slutlig koncentration på 0,25 mg / ml

OBS: För en 6-brunnsplatta behövs 2 ml överlägg per brunn.

6. Tillsätt den beräknade volymen av membranmatrisen till iskall MM och blanda genom att pipettera upp och ner 10 gånger

  1. Pipettera överläggsblandningen långsamt ovanpå cellerna och placera tillbaka plattan i inkubatorn vid 37 °C.
  2. Byt ut mediet mot nytt underhållsmedium var 24:e timme.
  3. Vid 24 timmar efter plätering överför du det konditionerade mediet från brunnen avsedd för MTT- och albuminanalyser. Förvara det konditionerade mediet i ett mikrofugerör tills det är klart att utföra albuminanalysen. Fortsätt till steg 7.1 för MTT-analysen.
    OBS: Förvara det konditionerade mediet vid 4 °C för kortvarig lagring (mindre än en dag). För längre lagring, förvara mediet vid -80 °C.

7. Analys av leveranseffektivitet, viabilitet och on-target-redigering i elektroporerade mushepatocyter

  1. Viabilitetsmätning med MTT-analys
    1. Bered 12 mM MTT stamlösning genom att tillsätta 1 ml PBS till en 5 mg injektionsflaska med MTT.
    2. Tillsätt 150 μL av MTT-stamlösningen till brunnarna och inkubera i 24 timmar.
    3. Efter inkubation tillsätt 1,5 ml natriumdodecylsulfathydrokloridlösning (SDS-HCl) till varje brunn och pipettera sedan för att blanda.
    4. Inkubera plattan i 4 timmar vid 37 °C och leta efter en förändring i mediets färg från klar till lila för att indikera livskraftiga celler.
    5. Blanda varje prov igen med en pipett och läs absorbansen vid 570 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
    6. Beräkna den normaliserade viabiliteten för Cas9-behandlade prover med hjälp av Eq (1):
      Equation 1 (1)
  2. Albuminanalys för att utvärdera hepatocytfunktionalitet
    1. Överför 50 μL av det konditionerade mediet till brunnarna i plattan som tillhandahålls av albuminsatsen. Täck brunnarna och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur.
    2. Tvätta brunnarna 5x med 200 μL tvättbuffert.
    3. Vänd upp plattan för att tömma varje brunn på silkespapper och knacka några gånger.
    4. Efter tvättning tillsätt 50 μl av den biotinylerade antikroppen som tillhandahålls i albuminanalyssatsen till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme.
    5. Upprepa steg 5.2.2-5.2.3 för att tvätta brunnarna.
    6. Tillsätt 50 μL streptavidinperoxidas som tillhandahålls i albuminanalyssatsen till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
    7. Upprepa steg 5.2.2.
    8. Tillsätt 50 μL av kromogensubstratet i albuminanalyssatsen per brunn och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Knacka försiktigt på plattan för att säkerställa jämn blandning. Ta bort eventuella luftbubblor med en pipettspets.
    9. Slutligen tillsätt 50 μL stopplösning till varje brunn och leta efter en färgändring från gult till blått för att indikera funktionella celler.
    10. Fortsätt omedelbart att läsa av absorbansen vid 450 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
  3. Uppskatta leveranseffektiviteten i brunnar elektroporerade med eGFP mRNA.
    1. Fånga faskontrast och gröna fluorescensbilder av hepatocyter 24 timmar efter elektroporering. Ta tre bilder på olika platser i brunnen.
    2. Ladda upp bilder av cellerna till ImageJ. Under fliken Bild väljer du Skriv | 16-bitars för att konvertera bilden till gråskala.
    3. Om du vill markera cellstrukturer i bilden väljer du Justera | Tröskel. Justera skjutreglaget för att markera celler.
    4. Under fliken Process väljer du Subtrahera bakgrund för att ta bort bakgrundsbrus.
    5. Räkna cellerna genom att klicka på fliken Analysera och välj sedan Analysera partiklar. Klicka på Ok för att skapa en lista över räknade partiklar.
    6. Beräkna procentandelen GFP-positiva celler genom att dividera antalet räknade partiklar i de gröna fluorescensbilderna med antalet räknade partiklar i motsvarande faskontrastbild.
  4. Analys av Cas9-aktiviteten på målområdet
    1. Extrahera genomiskt DNA från elektroporerade celler.
      1. Ta bort mediet från plattan 3 dagar efter elektroporering och tillsätt 500 μL 0,25% trypsin. Inkubera vid 37 °C i 5 min. Pipettera flera gånger efter inkubation för att säkerställa att hepatocyter har lossnat från plattan.
      2. Överför den trypsiniserade cellsuspensionen till mikrocentrifugrör och snurra i en bordscentrifug vid 800 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter spinning, undersök rören för pellets.
      3. Ta bort supernatanten som innehåller trypsin genom pipettering. Se till att inte störa pelleten. Resuspendera pelleten i 80 μL DNA-extraktionslösning. Om pelleten är svår att se, återsuspendera rörets innehåll i 50 μL DNA-extraktionslösning.
      4. Virvel i 30 s för att säkerställa att pelleten återsuspenderas. Överför upphängningen till PCR-split-strip-rör och placera dem i värmecykeln. Kör i 15 min vid 95 °C och 8 min vid 68 °C.
    2. PCR-förstärker platsen på målet.
    3. Följ proceduren som beskrivs nedan för att förstärka Hpd-målregionen med hjälp av DNA-polymeras.
      1. Bered en reaktion innehållande 0,5 μl 10 mM dNTP, 0,5 μL 10 μM Framåtprimer, 0,5 μL 10 μM Omvänd primer, 0,125 μL Taq-polymeras, 5 μL genomiskt DNA extraherat från hepatocyterna och 18,375 μL nukleasfritt vatten. Se kompletterande tabell S1 för primersekvenser.
      2. Kort virvla och snabbt centrifugera PCR-blandningen för att säkerställa att lösningen är i botten av röret.
      3. Placera PCR-blandningen i en termisk cykler och förstärk under dessa förhållanden: 94 °C i 30 s för denaturering, 30 cykler med 94 °C i 30 s, 57 °C i 45 s för glödgning, 68 °C i 1 min och en slutlig förlängning på 68 °C i 5 min.
        OBS: Glödgningstemperaturen för PCR-reaktionen varierar beroende på primers sammansättning. Överväg att använda en smälttemperaturräknare innan du utför PCR.
      4. För att bekräfta rätt produktstorlek, blanda 3 μL av PCR-produkterna med 2 μL vatten och 1 μL 6x färgämne. Kör på en 1,5% agarosgel och bekräfta rätt produktstorlek.
    4. Rena DNA med magnetiska pärlor.
      OBS: Spinnkolumner kan också användas för PCR-rengöring. Nedan finns procedurer för rening av PCR-produkter med magnetiska pärlor.
      1. Ta bort magnetiska pärlor från 4 °C och låt dem nå rumstemperatur.
      2. Kort virvel och snabbt centrifugera PCR-blandningen.
      3. Tillsätt en volym pärlor som är lika med 1,8× volymen på PCR-blandningen. Pipettera PCR-pärlblandningen 10x för att säkerställa att lösningen är lika blandad.
      4. Inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
      5. Överför PCR-pärlblandningen till en PCR-platta och placera den på en magnetplatta.
      6. Inkubera plattan på magneten i 5 min. Efter 5 minuter, kontrollera att lösningen är klar och att pärlorna är bundna till magneten innan du går vidare till nästa steg.
      7. Kassera supernatanten.
      8. Tillsätt 200 μl 70% etanol till brunnen och inkubera i 30 s.
        OBS: 70% etanol bör beredas strax innan rengöringen utförs för att förhindra DNA-förlust.
      9. Kassera supernatanten och upprepa steg 7.4.4.8.
      10. Ta bort supernatanten och låt torka i 3 min vid rumstemperatur för att ta bort spår av etanol.
      11. Ta bort plattan från magneten och tillsätt 22 μl vatten till provet. Pipettera upp och ner 10x för att blanda vatten och pärlor.
      12. Inkubera proverna i 3 min vid rumstemperatur.
      13. Överför plattan tillbaka till magneten och inkubera i 3 minuter eller tills lösningen är klar.
      14. Överför 20 μl av provet till ett PCR-rör. Se till att inga pärlor överförs.
    5. Sekvensrenad DNA-amplicon genom Sanger-sekvensering.
    6. Ladda upp .ab1-sekvensfiler för behandlade och kontrollera (obehandlade) prover till Tracking of indels by Decomposition (TIDE)16 för att kvantifiera indels på målplatsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av pläterbara primära hepatocyter från levern
Den övergripande processen för leverperfusion och hepatocytisolering illustreras i figur 1. I detta experiment användes vildtypiga, 8-10 veckor gamla C57BL6 / 6J-möss. Förfarandet förväntas ge 20-50 × 106 celler per mus med en livskraft mellan 85% och 95%. Om livskraften är <70% bör percoll-behandling följas för att avlägsna döda celler. Nyligen isolerade hepatocyter bör pläteras på kollagen I-belagda eller kvävehaltiga vävnadsodlingsplattor. Inom 3-12 timmar efter plätering förväntas hepatocyterna fästa vid plattan, och cellmorfologin antar ett typiskt polygonalt eller hexagonalt utseende inom 24 timmar (figur 2). Hepatocyter är de enda cellerna i levern som lagrar glukos i form av glykogen. För att verifiera renheten hos de isolerade cellerna utförs glykogenfärgning med användning av periodiskt syra-Schiff-reagens vid 24 timmar efter plätering. Cytoplasman hos de färgade hepatocyterna uppträder magenta (Figur 3).

Elektroporering av CRISPR-Cas9 RPP och mRNA till isolerade mushepatocyter
Nyligen isolerade mushepatocyter elektroporerades med eGFP mRNA, Cas9 mRNA tillsammans med Hpd-riktad sgRNA eller Cas9-protein komplex med Hpd-sgRNA (RNP). Hpd-sgRNA modifierades kemiskt med 2′-O-metylfosfortioatbindningar till de första och sista tre på varandra följande nukleotiderna på 5 ′ och 3 ′ ändarna14. Streptococcus pyogenes Cas9 användes för experiment. Hepatocyterna avbildades 24 timmar efter elektroporering med hjälp av ett fluorescensmikroskop, och andelen GFP-positiva celler räknades i bilderna (figur 4A). I genomsnitt var 89,8% [intervall 87,1% -92,4%] av hepatocyterna GFP-positiva. Vid 3 dagar efter elektroporering analyserades Cas9-inducerade infogningar och deletioner (indels) i Hpd-locus med användning av TIDE16. Resultaten visar on-target indels på 47,4% i hepatocyter elektroporerade med CRISPR-Cas9 mRNA och 78,4% indels för Cas9 RNP (Figur 4B). MTT- och albuminanalyser utfördes för att utvärdera hepatocytviabilitet och funktionalitet efter elektroporering av CRISPR-Cas9. MTT-resultaten visar en viabilitet på 35,4% och 45,9% i hepatocyter behandlade med CRISPR-Cas9 mRNA respektive RNP (Figur 4C). I överensstämmelse med MTT-resultaten var de normaliserade albuminnivåerna 31,8% i hepatocyter behandlade med Cas9 mRNA och 34,5% för Cas9 RNP (figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Schematisk för hepatocytperfusions- och isoleringsprotokollet. Efter kannulering av den underlägsna vena cava skärs portalvenen och Perfusion Solutions 1, 2 och 3 pumpas genom levern. Leverkapseln spricker och cellerna frigörs med hjälp av en celllyftare. Frigjorda celler silas och centrifugeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Nyligen isolerade primära hepatocyter. Hepatocyter isolerade från C57BL/6J-möss pläterades på kollagen I-belagda 6-brunnsplattor med hepatocytpläteringsmedia. Bilder tagna vid 24 h efter plätering. Skalstreck = 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Glykogenfärgning. Nyligen isolerade primära mushepatocyter färgades för glykogen för att bekräfta renhet. Färgning gjordes med Schiff Reagent vid 24 h efter plätering. Cytoplasma hos de färgade hepatocyterna verkar magenta. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Elektroporering av Hpd-riktad CRISPR-Cas9 till nyligen isolerade primära mushepatocyter. (A) Faskontrast- och grönfluorescensmikroskopibilder av nyligen isolerade mushepatocyter vid 24 timmar efter elektroporering. Bilder i den övre raden är hepatocyter transfekterade med eGFP mRNA och bilderna i den nedre raden är otransfekterade kontrollhepatocyter. Skalstänger = 400 μm. (B) On-target indels för mushepatocyter elektroporerade med Cas9 mRNA i kombination med sgRNA eller RNP. (C) Viabilitet normaliserad till otransfekterade kontrollhepatocyter i MTT-analys vid 24 timmar efter elektroporering. D) Albuminnivåer i konditionerat medium normaliserade till otransfekterade kontrollhepatocyter uppmätta vid 24 timmar efter elektroporering(n = 3) med två tekniska replikat. Statistisk analys utfördes av oparade t-tester. Denna siffra ändrades från 14. Förkortningar: Hpd = 4-hydroxifenylpyruvatdioxygenas; CRISPR = grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar; Cas9 = CRISPR-associerat protein 9; sgRNA = enkelstyr-RNA; RNP = ribonukleoprotein; INDEL = insättning-radering; MTT = 3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5 difenyltetrazoliumbromid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Felsökning för protokollet för leverperfusion och hepatocytisolering. Denna tabell belyser vanliga problem som uppstått under protokollet och föreslår möjliga lösningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande figur S1: Musens bukhåla under operationen. Kateter sätts in i den underlägsna vena cava (blå prick) före njurgrenarna (ses ej). Förkortningar: L = Lever; K = Njure; I = Tunntarmen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S1: Cas9-guide och PCR-primersekvenser. Styrsekvensen och PAM för sgRNA-inriktning på Hpd och PCR-primersekvenser för förstärkning av Hpd. Förkortningar: Hpd = 4-hydroxifenylpyruvatdioxygenas; CRISPR = grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar; Cas9 = CRISPR-associerat protein 9; sgRNA = enkelstyr-RNA; PAM = protospacer-intilliggande motiv. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stegen som beskrivs i protokollet för hepatocytisolering är utmanande och kräver övning för färdighet. Det finns flera viktiga steg för framgångsrik hepatocytisolering från levern. För det första är korrekt kannulering av den underlägsna vena cava avgörande för fullständig leverperfusion. Frånvaron av blanchering i levern efter perfusion indikerar förskjutning av katetern (tabell 1). Den underlägsna vena cava (retrograd perfusion) kannulerades i proceduren eftersom den är enklare och mer tillgänglig än portalvenen (antegrad perfusion)17,18. Vissa protokoll använder suturer för att säkra katetern19; suturer komplicerar dock processen. Suturering av katetern kan resultera i oönskade resultat, såsom felplacering av katetern och gör det omöjligt att justera dess position. Dessutom är det möjligt att utföra kannuleringen i levern utan att ta bort nålen, vilket ytterligare kan förenkla leverperfusionen. Att ansluta pumpen till katetern är onödig med nålen i venen. Dessutom finns det en minskad möjlighet att oavsiktligt dra ut katetern och bilda blodproppar. Att endast sätta in kateterns spets med en plan vinkel i förhållande till venen förbättrade kanuleringen. Den underlägsna vena cava har flera grenar, så att sätta in katetern på fel plats kommer att orsaka perfusion i en annan del av kroppen och inte levern (tabell 1). Därför är det viktigt att placera katetern på en plats som undviker grenarna. Kärlstrukturen varierar något mellan olika möss; Därför är det viktigt att undersöka venerna innan de kannuleras för att bestämma den bästa platsen för att injicera katetern. Blodflödet inuti katetern efter att nålen har tagits bort är en utmärkt indikation på korrekt kannulering. Korrekt kannulering kan också kontrolleras genom att leta efter leversvullnad när tryck tillfälligt appliceras på portalvenen (steg 1.3.13).

Vid isolering av hepatocyter är det andra kritiska steget att känna igen när fullständig leverförtunning har inträffat. Enzymkvaliteten och koncentrationen är avgörande för korrekt matsmältning. I motsats till de protokoll som finns i 20,21 föreslår detta protokoll att man använder Liberase, bestående av två kollagenasisoformer, eftersom det ger bättre konsistens i enzymaktivitet och minskad batch-till-batch-variation än vanligt kollagenas22. Variationer i matsmältningsenzymets kvalitet och aktivitet kan orsaka inkonsekvenser i isoleringen. Det är viktigt att övervaka levern under matsmältningen och stoppa matsmältningen omedelbart efter att levern har mjuknat. En smält lever kommer att vara flexibel och visa en förlust i elasticitet verifierad genom att trycka ner levern med pincett eller bomullspinne för att bekräfta att indragningar bildas utan att vävnaden studsar tillbaka. I detta protokoll är den maximala mängden Liberase-lösning som rekommenderas per lever 50 ml; en högre volym skulle leda till överdigestion. Om kannuleringen utförs perfekt är 30 ml liberase-lösningen tillräcklig för att uppnå korrekt matsmältning. De sista kritiska stegen i proceduren är isolerings- och tvättstegen. Efter att ha dissekerat levern och överfört den till en steril petriskål som innehåller iskall DMEM med FBS är det viktigt att undvika att skära levern i bitar. Använd i detta skede en celllyftare för att släppa cellerna försiktigt och maximera cellviabiliteten. Att luta skålen för att sänka levern i DMEM underlättar frisättningen av celler från kapseln till suspension och måste göras långsamt och på is. Det ska vara lätt att störa Glissons kapsel under frigöringssteget, och mediet ska bli grumligt och brunt. Svårigheter vid störning av kapseln är en indikator på dålig matsmältning (tabell 1).

Detta protokoll är lämpligt för att generera höga nivåer av CRISPR-Cas9-redigeringar i nyligen isolerade mushepatocyter. Indels genererade av Cas9 RNP och mRNA jämfördes i studien. Högre nivåer av genredigering observerades i hepatocyter elektroporerade med Cas9 RNP än mRNA, vilket överensstämmer med resultaten från andra studier 14,23,24. Fördelen med Cas9 RNP jämfört med mRNA är att det ger lägre redigering utanför målet eftersom Cas9-proteinet finns i cellen under kortare perioder än mRNA23,24. Eftersom effektiviteten hos sgRNA varierar beroende på design och målplats, bör flera sgRNA utformas och testas för redigeringseffektivitet vid genen av intresse. Välj den högre specificitetspoängdesignen när du väljer mellan sgRNA med hög geneffektivitet. Om genredigeringen är konsekvent låg, överväg att samleverera en reporter, till exempel eGFP mRNA, för att bekräfta leveransen. Låga nivåer av eGFP-positiva celler efter elektroporering kan indikera utgången elektroporeringsbuffert, problem med elektroporeringsanordningen eller luftbubblor i reaktionen. Om det finns ett stort antal eGFP-positiva celler men låg redigeringseffektivitet, testa sgRNA-designen i en cellinje för att bekräfta redigeringsaktiviteten och justera mängden Cas9 och sgRNA som elektroporeras i celler. Slutligen, överväga metoden som används för att utvärdera redigeringsaktivitet. Gelbaserade analyser, såsom T7 Endonuclease I, kan underrapportera genredigering på grund av låg känslighet för 1 bp-missmatchningar på skärplatsen. Djupsekvensering är den mest exakta metoden för att kvantifiera Cas9-genredigering, särskilt för lågredigeringshändelser på platser utanför målet.

En annan utmanande aspekt av protokollet är odling av nyligen isolerade hepatocyter efter elektroporering. Användare måste hantera celler försiktigt under varje steg i protokollet för att erhålla livskraftiga, platterbara hepatocyter efter elektroporering. Undvik att sprida hepatocyter genom virvel; istället, rocka injektionsflaskan som innehåller celler försiktigt tills cellerna blir återsuspenderade. Vid överföring av hepatocyter, använd pipettspetsar med bred borrning för att bibehålla livskraften. Inkubering av kuvetterna på is i 15 minuter efter elektroporering gör att cellmembranet kan återförslutas och förbättra livskraften. Efter plätering, placera plattan i inkubatorn och flytta försiktigt plattan horisontellt och vertikalt i en nord-till-syd och öst-till-väst-rörelse för att säkerställa att hepatocyterna sprids jämnt och upprätthåller cellviabiliteten. Om hepatocyterna inte fäster vid plattan, överväg att öka antalet celler till 1,3 × 106 i elektroporeringsreaktionen.

En lovande applikation för protokollet är generering av musmodeller av mänskliga IMD i levern. Mushepatocyter som är positiva för genen som kodar för fumarylacetoacetathydrolas (Fah) har visat sig effektivt engrafera och återbefolka levern efter transplantation hos Fah-bristfälliga (Fah-/-) möss25. Ett nytt tillvägagångssätt för att utveckla musmodeller av IMD i levern är genom att elektroporera CRISPR-Cas9 till vildtypsmushepatocyter för att införa redigeringar associerade med en sjukdom, följt av transplantation av de genredigerade hepatocyterna hos Fah-/- möss. De Cas9-redigerade hepatocyterna skulle ha en naturlig selektiv fördel efter transplantation jämfört med de inhemska Fah-bristfälliga cellerna för att återbefolka levern.

Sammanfattningsvis utrustar detta protokoll användare med kapacitet att isolera primära hepatocyter från muslevern, följt av genredigering med CRISPR-Cas9 mRNA och RPP. Protokollet kan modifieras för användning i olika stammar av möss för att studera olika typer av genetiska sjukdomar som påverkar levern in vitro och in vivo och testa terapeutiska metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande intressen att avslöja.

Acknowledgments

RNC fick finansiering från South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilotbidrag med stöd av National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) vid National Institutes of Health, American Association for the Study of Liver Diseases Foundation och American Society of Gene &Cell Therapy under bidragsnummer P30 GM131959, 2021000920, respektive 2022000099. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från American Society of Gene &Cell Therapy eller American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Schemat för bild 1 skapades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural USA Scientific 1402-4700
6-well Collagen Plates Advanced Biomatrix 5073
accuSpin Micro 17R Fisher Scientific 13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope Keyence BZ-X810
Analog Vortex Mixer VWR 97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL ThermoFisher Scientific 2079GPK
Automated Cell Counter Bio-Rad Laboratories TC20
Blue Wax Dissection Tray Braintree Scientific Inc. DTW1 9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter Argos Technologies UX-04396-53 Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL) Fisher Scientific 339650
Conical tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Cotton applicators Fisher Scientific 22-363-170
Curved scissors Cooper Surgical 62131
Disposable Petri Dishes Falcon 351029 100mm,sterile
Disposable Petri Dishes VWR 25373-100 35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Instruments 250082
Falcon Cell strainer (70 µm) Fisher Scientific 08-771-2
Forceps Cooper Surgical 61864 Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters  BD 382612 24 G x 0.75 in
IV infusion set Baxter 2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge Benchmark Scientific 1220P38
Needles Fisher Scientific 05-561-20 25 G
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001 Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump Masterflex  HV-77120-42 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing Masterflex HV-96410-14 25 ft, silicone
Primaria Culture Plates Corning Life Sciences 353846 Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL) Fisher Scientific 12-567-604
Syringes BD 329464 1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories 1861096
Water bath ALT 27577 Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 IDT 1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL Fisher Scientific NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA Trilink Biotechnologies L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA Trilink Biotechnologies L-7201-100
Corning Matrigel Matrix Corning Life Sciences 356234
DMEM ThermoFisher Scientific 11885076 Low glucose, pyruvate
Ethanol 70% VWR 71001-652
Fetal bovine serum Thermoscientific 26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM) Lonza MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM) Lonza MP100
Mouse Albumin ELISA Kit Fisher Scientific NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit Lonza VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase New England Biolabs M0481L
PBS 10x pH 7.4  Thermoscientific 70011-044 No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution) Santa Cruz Biotechnology sc-500790A
Periodic acid Sigma-Aldrich P7875-25G
Permount Mounting Medium VWR 100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen Corporation QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent Sigma-Aldrich S5133
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay ThermoFisher Scientific V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
EBSS Fisher Scientific 14155063 Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M) Bioworld 40520008-1 200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM) Sigma C7902-500G 360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) Fisher Scientific 14-155-063 Complete to 200 mL
HEPES (1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM) Sigma 30391-25G 160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3  Prepared fresh prior to use
Solution 2 50 mL
Liberase Roche 5401127001 0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine 0.25 mg/mL final concentration
Ketamine 7.5 mg/mL final concentration
Xylazine 1.5 mg/mL final concentration
Software URL
Benchling https://www.benchling.com/
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition https://tide.nki.nl/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019).
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2022).
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M. Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).

Tags

Bioteknik utgåva 184
Elektroporeringsmedierad leverans av Cas9 Ribonukleoproteiner och mRNA i nyligen isolerade primära mushepatocyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C.,… More

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C., Parker, T., Cottle, R. N. Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (184), e63828, doi:10.3791/63828 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter