Summary
Este protocolo descreve a preparação de tecido nervoso ciático inteiro de rato para estimulação eletrofisiológica ex vivo e registro em um banho salino ambientalmente regulado, com dois compartimentos e perfumado.
Abstract
As preparações ex vivo permitem o estudo de muitos processos neurofisiológicos isolados do resto do corpo, preservando a estrutura tecidual local. Este trabalho descreve a preparação de nervos ciáticos de ratos para neurofisiologia ex vivo, incluindo preparação de tampão, procedimentos animais, instalação de equipamentos e gravação neurofisiológica. Este trabalho fornece uma visão geral dos diferentes tipos de experimentos possíveis com este método. O método delineado visa fornecer 6h de estimulação e registro em tecido nervoso periférico extraído em condições bem controladas para a melhor consistência nos resultados. Os resultados obtidos usando este método são potenciais de ação composto de fibra A (CAP) com amplitudes de pico a pico na faixa de milívolo durante toda a duração do experimento. As amplitudes e formas da CAP são consistentes e confiáveis, tornando-as úteis para testar e comparar novos eletrodos aos modelos existentes, ou os efeitos de intervenções no tecido, como o uso de produtos químicos, alterações cirúrgicas ou técnicas de estimulação neuromodulatória. Ambos os eletrodos convencionais de punho disponíveis comercialmente com contatos de platina-irídio e eletrodos de elastômero condutivo personalizados foram testados e deram resultados semelhantes em termos de resposta de resistência ao estímulo nervoso.
Introduction
A compreensão atual da função nervosa fundamental modelada no sílico está em falta em vários aspectos, notadamente no que diz respeito aos efeitos da compartimentação do tecido nervoso fora da soma, axônio e dendritos. As interações axon-mielina ainda são mal compreendidas como evidenciadas pelo fato de que mesmo modelos detalhados de nervo computacional, como o MRG1 (para nervos mamíferos) que captam adequadamente a resposta convencional de estimulação elétrica, não capturam outros comportamentos experimentalmente observados, como o transporte de blocos de alta frequência2 ou a resposta de início secundário3.
Este protocolo fornece um método para investigar eficientemente processos neurofisiológicos ao nível nervoso em um pequeno modelo animal de laboratório agudo, utilizando um protocolo de preparação padronizado para isolar o nervo, controlar seu ambiente e removê-lo de um contexto in vivo para um contexto ex vivo. Isso evitará outros processos corporais ou anestésicos usados por protocolos de estimulação nervosa in vivo para alterar o comportamento nervoso e confundir resultados medidos ou sua interpretação 4,5. Isso permite o desenvolvimento de modelos mais realistas focando apenas em efeitos específicos para tecidos nervosos que são mal compreendidos. Este protocolo também é útil como um teste para novos materiais e geometrias de estimulação nervosa e gravação, bem como novos paradigmas de estimulação, como o bloco de alta frequência 2,3. Variações dessa técnica têm sido utilizadas anteriormente para estudar fisiologia nervosa em condições bem controladas6, por exemplo, para medir a dinâmica e propriedades do canal de íons ou os efeitos dos anestésicos locais7.
Esta técnica oferece várias vantagens em comparação com alternativas como a experimentação aguda in vivo de pequenos animais8. A técnica evita a necessidade de manter a profundidade da anestesia, uma vez que o tecido foi extraído do corpo, reduzindo a quantidade de equipamentos necessários, como difusor anestésico, concentrador de oxigênio e almofada de aquecimento. Isso simplifica o protocolo experimental, reduzindo o risco de erros. Como os anestésicos podem potencialmente alterar a função nervosa4, esta técnica garante que as medidas não serão confundidas por efeitos colaterais desses compostos anestésicos. Finalmente, essa técnica é mais apropriada do que experimentos in vivo agudos ao estudar os efeitos de compostos neurotóxicos como a tetrodotoxina, que mataria um animal anestesiado por paralisia.
As seções nervosas periféricas são um sistema ex vivo único, pois há uma grande chance de que as fibras responsáveis pelos sinais neurais registrados não contenham nenhuma soma. Como estes normalmente seriam localizados, para neurônios motores, na coluna vertebral, e para neurônios sensoriais no gânglio dorsal ao lado da coluna vertebral, a preparação de uma seção do nervo mamífero pode ser aproximadamente modelada como uma coleção de membranas tubulares com canais de íons, abertas em ambas as extremidades9. O metabolismo é mantido pelas mitocôndrias localizadas no axônio no momento da dissecação tecidual10. A sutura das extremidades abertas do axolemma é encorajada após a extração para fechá-las e, assim, ajudar a manter os gradientes iônicos existentes em toda a membrana, que são essenciais para a função nervosa normal.
Para manter a homeostase tecidual fora do corpo, várias variáveis ambientais devem ser fortemente controladas. Sãotemperaturas 11, oxigenação12, osmolaridade, pH13,14 e acesso à glicose para manter o metabolismo. Para este protocolo, a abordagem é usar um buffer Krebs-Henseleit modificado 15,16 (mKHB) continuamente arejado com uma mistura de oxigênio e dióxido de carbono. O mKHB está na família de tampões cardioplégicos 6,17 usados para preservar tecidos dissecados fora do corpo, por exemplo, em experimentos ex vivo. Estes tampões não contêm hemoglobina, antibióticos ou antifúngicos e são, portanto, adequados apenas para preparações envolvendo pequenas quantidades de tecido por um tempo limitado. o controle de pH foi alcançado com o par de carbonato e dióxido de carbono redox, exigindo aeração constante do tampão com dióxido de carbono para manter o equilíbrio do pH. Isto é para evitar o uso de outros agentes de buffering comuns, como o HEPES, que pode modificar a função da célula nervosa18. Para oxigenar o tampão e fornecer controle de pH, foi utilizada uma mistura de 5% de dióxido de carbono em oxigênio chamado carbogen (95% O2, 5% CO2). Um agitador de aquecimento foi usado para o controle de temperatura de um recipiente tampão, e o tampão foi perfundido através de um banho nervoso, e depois recirculado para o recipiente de partida. Um experimento típico duraria de 6-8 h antes que o nervo perca sua viabilidade e não responda mais o suficiente à estimulação de medidas representativas do tecido saudável.
Para otimizar a relação sinal-ruído, foram utilizados eletrodos de cloreto de prata para gravação, que foram preparados de acordo com os métodos descritos anteriormente19. Para estimulação, uma combinação de eletrodos comerciais de punho de platina fora da prateleira e eletrodos de manguitos condutores personalizados podem ser usados. Os eletrodos condutores do manguito de polímero têm capacidades de carga notavelmente mais elevadas, que são úteis ao estimular o nervo usando formas de onda de alta amplitude20.
O estimulador utilizado neste protocolo foi descrito anteriormente20. Documentação, arquivos de design e scripts de software para usá-lo estão disponíveis publicamente21. Outros estimuladores podem ser usados para executar este protocolo; no entanto, o estimulador personalizado também é capaz de bloquear 2,20 blocos de corrente alternativa de alta frequência (HFAC), que permite uma gama mais ampla de experimentos de neurofisiologia. Para usar o bloco HFAC, recomenda-se que as algemas elastômeras condutoras evitem danos ao nervo. As algemas hemóstulas condutoras são matrizes de eletrodos suaves e totalmente poliméricas produzidas a partir de elastômeros condutivos como componente condutor e polidimtilsiloxano como o isolamento22. Os dispositivos foram fabricados em uma configuração bipolar utilizando técnicas convencionais de microfabização a laser.
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Protocol
Todos os cuidados e procedimentos de animais foram realizados sob licenças apropriadas emitidas pelo Escritório do Reino Unido sob a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) (1986) e foram aprovados pelo Conselho de Bem-Estar Animal e Revisão Ética do Imperial College London.
1. Preparação de tampões
NOTA: Esta parte do protocolo pode ser realizada bem antes do resto do protocolo, exceto para as etapas finais envolvendo a preparação do Buffer Krebs-Henseleit modificado (mKHB) na concentração de 1x.
- Prepare a solução de estoque cacl 2 de 1 M CaCl2
- Adicione 14,701 g de diethidrato caCl2 a um béquer limpo de 100 mL. Adicione ~75 mL de água deionizada e mexa até a dissolução completa do sal.
- Transfira a solução para um frasco graduado de 100 mL e adicione água deionizada até que o volume de 100 mL seja atingido. Transfira a solução para uma garrafa e armazene-a em uma geladeira a 4 °C.
- Prepare 10x estoque mKHB concentrado
- Adicione 66,03 g de cloreto de sódio (NaCl), 3,57 g de cloreto de potássio (CÍNula), 1,63 g de fosfato de dihidrogênio de potássio (KH2PO4) e 1,44 g de sulfato de magnésio a um béquer de 2 L.
- Adicione ~750 mL de água deionizada ao béquer e mexa até que os sais tenham dissolvido (pode haver pequenos cristais de sal deixados na parte inferior). Adicione 25 mL de 1 M CaCl2 solução de estoque (passo 1.1) e mexa; certifique-se de que este é o último sal adicionado.
- Transfira a solução para um frasco graduado em 1 L e adicione água deionizada para atingir um volume total de 1 L. Transfira a solução para uma garrafa de 1 L. Armazene concentrado 10x mKHB a 4 °C em uma geladeira.
NOTA: O estoque concentrado de mKHB pode ser armazenado por aproximadamente 1 mês antes da substituição.
- Prepare a placa de dissecção Petri (revestimento)
- Prepare uma placa de vidro limpo (120 mm de diâmetro) para revestimento, lavando e secando cuidadosamente o prato.
- Seguindo as instruções do fabricante para o uso e a cura do revestimento alkoxy conformal, cubra a parte inferior da Placa de Petri com ~3-5 mm de revestimento, despejando cuidadosamente a mistura de revestimento conformal no prato até que a espessura desejada tenha sido atingida.
- Cure o revestimento em um forno a 60 °C até ficar firme ao toque. A placa de dissecção Petri está pronta.
NOTA: A limpeza suave do prato após cada uso garantirá que o revestimento dure por anos antes da necessidade de substituição. Ao substituir o revestimento, certifique-se de remover todo o material de revestimento antes de aplicar um novo revestimento. Observe que o revestimento alkoxy conformal (Tabela de Materiais) utilizado neste protocolo tem uma vida útil menor que um ano.
2. Preparações de pré-dissecação
NOTA: Esta etapa inicia o experimento. As etapas abaixo devem ser realizadas no mesmo dia, nesta ordem.
- Prepare 1x mKHB
- Prepare um béquer 2 L limpo para o buffer. Transfira 200 mL de 10x mKHB para o béquer 2 L. Adicione 2,1 g de carbonato de sódio (NaHCO3) e 0,99 g de Dextrose anidro (D-glicose) ao béquer 2 L.
- Adicione aproximadamente 1 L de água deionizada ao béquer. Mexa até que os sais tenham sido completamente dissolvidos. Transfira a solução para um frasco graduado em 2 L e adicione água deionizada para atingir um volume total de 2 L.
- Transfira a solução para uma garrafa de vidro 2 L colocada em um agitador de aquecimento com a temperatura definida para 37 °C.
NOTA: O agitador de aquecimento menor muitas vezes não será capaz de atingir a temperatura alvo de 37 °C devido à inércia térmica de grandes recipientes cheios de água. Ajuste a temperatura para cima para que o conteúdo da garrafa atinja 37 °C com agitação. Monitore a temperatura durante o experimento e reduza a temperatura definida em caso de sobrecarga. - Coloque um termômetro na garrafa 2 L para monitorar a temperatura, usando pinças para evitar que o termômetro seja impactado pela pulga agitada. Aerar o tampão com carbogen por um mínimo de 30 minutos para oxigenar a solução. Isso deve definir o pH para 7,4. Meça o pH com um medidor de pH para garantir que ele esteja dentro de 0,1 pH unidades de 7,4 (a 37 °C).
NOTA: Para ajustar o pH para 7,4, use ácido clorídrico ou hidróxido de sódio quando necessário. - Encha dois tubos de centrífugas de 15 mL e uma garrafa de 100 mL com mKHB e coloque-os no gelo para esfriar.
NOTA: Os tubos de centrífugas e a garrafa podem ser limpos e reutilizados após cada experimento sem autoclaving. - Para partes posteriores do experimento, continue a aerar o tampão na garrafa de 2 L com carbogen a 37 °C com agitação contínua.
NOTA: O uso não supervisionado de carbogen pode ser perigoso se nenhum sistema automático estiver no local para desligar o fluxo de gás em caso de vazamento. Um sensor automatizado e uma válvula de desligamento eletrônico podem mitigar isso; caso contrário, uma pessoa deve ser deixada para supervisionar o equipamento se a dissecção ocorrer em uma sala diferente. Em todos os casos, um sensor de oxigênio deve ser usado perto da configuração para alertar os operadores quando a concentração de oxigênio ambiente sobe acima de 25%. Use uma sala com ventilação ativa, se possível.
- Ligue o dispositivo de aquisição de sinal, preamplificador de baixo ruído, filtro de ruído de linha e osciloscópio para gravação e estimulação, para permitir tempo suficiente para estabilização da temperatura.
- Certifique-se de que todos os equipamentos de gravação elétrica estão configurados corretamente
- Defina o preamplificador de baixo ruído para a entrada acoplada ao AC com o filtro de banda-pass de entrada definido para 6 dB roll-off por década, e as frequências de corte definidas para 30 Hz e 3 kHz para os filtros de alta passagem e baixa passagem, respectivamente.
- Defina o ganho do preamplificador com baixo ruído para 100.
3. Anestesia animal e eutanásia
NOTA: Foram utilizados ratos fêmeas entre 250 e 330 g (Tabela de Materiais) para os estudos.
- Preparar ferramentas cirúrgicas e materiais de consumo: tesoura reta de 12 cm (contundente); Tesoura de mola angular de 2 mm; Tesoura fina de 4 cm, afiada ou semi-afiada; #7 Fórceps Dumont; 45° angulado de fórceps finos e 6-0 suturando seda ou rosca.
- Coloque o rato em um recipiente de anestesia ou câmara. Conecte oxigênio e o difusor anestésico ao recipiente. Defina a concentração anestésico (isoflurane) para 3,5% e espere aproximadamente 10 minutos ou até que o animal mostre sinais de anestesia, como perda de reflexo de direito.
- Depois que o rato mostrar sinais de anestesia, confirme a perda de consciência com um teste de reflexo de abstinência do dedo do dedo. Proceda somente quando não houver retirada do dedo do dedo; caso contrário, verifique todas as conexões e níveis anestésicos no difusor e repita o passo 3.2.
- Tire o animal do recipiente e proceda com luxação cervical, seguida de incisão de artéria femoral para confirmação da morte.
4. Protocolo de dissecação
NOTA: Coloque o animal com a barriga para baixo na mesa de dissecção. Repita os passos a seguir para ambas as pernas. Normalmente, a perna direita é dissecada primeiro.
- Segurando o tornozelo firmemente entre o polegar, o dedo indicador e o dedo médio, corte o tendão calcâneo usando uma tesoura sem corte de 12 cm.
- Com uma tesoura fina e afiada, faça uma incisão de pele do tendão calcâneo ao longo da parte de trás da perna até a base da coluna vertebral, tomando cuidado para não dissecar o tecido muscular abaixo.
- Usando fórceps finos e tesouras finas, faça incisões cuidadosas através das camadas musculares perto do meio da parte de trás da perna até que o nervo ciático seja exposto. Assim que o nervo ciático estiver visível, hidratar a cavidade usando mKHB gelado para evitar que o nervo seque.
- Usando hemostatas, puxe os retalhos de pele de cada lado e mantenha a incisão aberta para um trabalho de dissecção mais fino. A partir da localização da incisão do tendão calcâneo, com uma tesoura fina, interrompa o músculo do lado medial da perna para liberar o nervo. Continue mantendo os níveis de umidade na área com mKHB gelado.
- À medida que o nervo é exposto enquanto se move para cima da perna, dissecar o tecido muscular sobreposto. Liberte o nervo mais próximo da coluna vertebral dos tecidos conjuntivos até atingir a fissura espinhal, momento em que há uma torção no nervo. Não tente limpar o nervo ainda, pois a velocidade é essencial nesta fase.
- Corte o nervo o mais próximo possível da coluna com uma tesoura fina. Para facilitar a dissecção, puxe suavemente a extremidade do nervo perto do tornozelo usando fórceps. Nunca belisque o nervo no meio, mas apenas as pontas. Nunca puxe um nervo tenso.
OPCIONAL: Neste ponto, se o tempo permitir, a sutura das duas extremidades do nervo pode ser realizada para ajudar a manter a viabilidade. Continue manuseando ao mínimo para evitar danos. Se houver tempo insuficiente (ver passo 4.5), pule esta etapa e siga o passo 5.2 mais tarde. - Coloque o nervo dissecado no tubo de centrífuga de 15 mL preenchido com mKHB (passo 2.1.5), feche o tubo e coloque o tubo de volta no gelo até o início do procedimento de limpeza.
- Repita as etapas 4.1-4.7 para a outra perna. Idealmente, cada nervo deve levar de 5 a 10 minutos para extrair, a fim de maximizar a viabilidade tecidual.
5. Procedimento de limpeza nervosa
- Encha a placa de Petri revestida aproximadamente no meio do caminho com mKHB oxigenado refrigerado. Coloque um dos nervos ciáticos dissecados no prato e fixe ambas as extremidades do nervo para o prato de tal forma que o nervo é reto sem torções, torção ou torções. Fixar o nervo o mais perto possível das extremidades.
- Usando suturas de seda 6-0 ou rosca fina, amarre um nó duplo em cada extremidade do nervo para evitar o vazamento de citoso no tampão. Coloque os nós ao lado dos pinos de insetos ao lado mais perto do centro do nervo, pois isso evitará o vazamento do tecido nervoso no tampão. Não realize esta etapa se o nervo já foi previamente ligado.
- Usando o microscópio para precisão e a tesoura de mola angular de 2 mm, remova gordura, vasos sanguíneos e tecido muscular do nervo. Podar quaisquer ramos nervosos que não serão usados no protocolo de estimulação e gravação.
- A cada 5 minutos de limpeza, substitua o tampão por mKHB oxigenado fresco. Use fórceps finos para puxar tecidos conjuntivos, gordura e vasos sanguíneos para facilitar a dissecção.
- Coloque os nervos de volta nos tubos de transporte cheios de mKHB resfriado fresco e coloque os tubos no gelo.
6. Configuração do equipamento
NOTA: A configuração do equipamento utilizada para realizar experimentos é ilustrada na Figura 1. Resumidamente, consiste em um banho de nervo de compartimento duplo, uma garrafa de 2 L colocada em um agitador de aquecimento, uma fonte de carbogen para aeração do buffer, e tubos para permitir que o tampão flua da garrafa para o banho, e de volta para a garrafa usando uma bomba peristáltica. O banho pode ser usinado a partir de plexiglass ou impresso em 3D a partir de materiais impermeáveis. Tem uma profundidade de aproximadamente 2 cm, e a partição que separa as duas câmaras do banho apresenta um orifício de 1,5 mm de diâmetro para permitir a rosca de um nervo periférico em ambas as câmaras. Uma câmara é grande, deve ter pelo menos 4 ou 5 cm de comprimento, e será preenchida com tampão. A outra câmara deve ter pelo menos 3 cm de comprimento e será preenchida com silicone ou óleo mineral. O banho não deve ser muito grande, pois isso irá degradar o controle da perfusão, temperatura e pH. Diferentes tamanhos de banho podem ser necessários dependendo do tamanho do tecido nervoso que está sendo estudado.
- Prepare um banho de nervo de câmara dupla limpo (consulte Arquivo Suplementar para especificações de design). Coloque o banho de nervo abaixo do nível da garrafa 2 L colocada no agitador de aquecimento, usando cabeças e pegadores padrão de laboratório. Conecte o dreno do banho à entrada da bomba peristáltica.
- Conecte a saída da bomba peristáltica a um tubo que leva de volta ao frasco tampão 2 L. Conecte a entrada do banho a um tubo com uma válvula de fluxo ajustável e coloque o tubo dentro da garrafa de 2 L. Use uma válvula de três vias com uma seringa conectada à tomada do meio para ajudar a preparar o tubo como um sifão para entrada de buffer assistido pela gravidade.
- Prime o sifão desenhando a seringa até que o buffer flua para dentro dele. Configure a válvula de tal forma que a taxa de fluxo do buffer no banho seja ~5-6 mL·min-1. O fluxo pode ser aumentado inicialmente para encher o banho. Uma vez que o nível do tampão do banho tenha atingido o ralo, coloque os nervos no banho.
- Usando um pino de inseto, fixe a extremidade do nervo no canto da câmara de banho cheia de tampão. Usando fórceps finos de ângulo de 45° e beliscando o nervo apenas nas extremidades, enfie cuidadosamente o nervo para ser estimulado através do orifício na divisória entre as duas câmaras de banho.
- Fixar a outra extremidade do nervo na câmara de óleo do banho com um pino de inseto, garantindo que o nervo esteja reto sem ser esticado e esteja livre de torções e torções. Usando graxa de silicone, faça uma vedação para evitar o vazamento de tampão da câmara tampão na câmara de óleo. Encha a câmara de óleo com silicone ou óleo mineral.
- Coloque os ganchos de eletrodo Ag/AgCl na câmara de banho de óleo e fixe-os usando cabeças de chefe e pinças. Coloque a porção do nervo no banho de óleo sobre os ganchos sem puxar o nervo esticado. Não belisque o nervo; usar fórceps angulares para levantar o nervo sem beliscar.
- Ajuste ou repare a vedação de graxa de silicone se algum vazamento for observado após mover o nervo.
- Conecte o eletrodo Ag/AgCl de referência ao solo do amplificador e coloque o eletrodo na câmara de banho cheia de buffer, fixando-o usando um gripper de laboratório.
7. Implantação de eletrodo no nervo no banho
- Prepare um eletrodo de punho nervoso limpo para estimulação de acordo com a referência21. Coloque o eletrodo na câmara de banho cheia de tampão. Usando fórceps ou pinças finas com pontas cegas ou angulares, abra o eletrodo no banho para molhar o interior da braçadeira.
- Se as bolhas permanecerem, use uma seringa fina para extrair tampão do banho e forçar as bolhas a sair da braçadeira. Com uma pinça sob o nervo, abra suavemente a braçadeira e deslize-a sob o nervo. Feche a braçadeira ao redor do nervo, tomando cuidado para evitar qualquer torção ou torção do nervo.
- Conecte o eletrodo de estimulação ao estimulador e proteja o chumbo eletrodo de estimulação com fita. Conecte o eletrodo de retorno atual ao estimulador e fixe o chumbo com fita. Se usar uma folha de platina quadrada como o eletrodo de retorno atual, posicione a folha longe do nervo no banho.
8. Estimulação e gravação
- Conecte a saída do sinal TTL estimulador ao canal 4 do osciloscópio, que será usado para acionar o osciloscópio. Na tela do osciloscópio, pressione a guia Do canal Trigger e especifique o Canal 4 como o canal de acionamento. Defina o nível do gatilho para 1 V usando o botão Level .
- No osciloscópio, defina a resolução de tempo para 1 ms/divisão e resolução de tensão para 10 mV/divisão. Centralizar a referência do gatilho no tempo e definir o nível do gatilho para 1 V.
NOTA: Siga as etapas 8.3 a 8.6 se usar o estimulador personalizado (ver Tabela de Materiais). Presume-se que o software MATLAB e os drivers de dispositivos foram instalados no computador de laboratório usando instruções fornecidas livremente on-line para o estimulador neural personalizado21. Caso contrário, siga as instruções do fabricante para o uso de um estimulador comercialmente disponível como alternativa. - Conecte o estimulador ao computador de laboratório. Ligue o estimulador conectando a fonte de alimentação da bateria à entrada de alimentação. Inicie o software MATLAB no computador de laboratório.
- Execute o script MATLAB personalizado: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Tabela de Materiais).
NOTA: O cabo de comunicação USB entre o computador e o estimulador deve piscar de olhos. Se isso não acontecer, então há um erro de configuração, e a fonte de alimentação e conexões devem ser verificadas. - Abra o roteiro do MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Tabela de Materiais). Ao editar diretamente o script MATLAB, defina os parâmetros da seguinte forma: amplitude de pulso estimulador = --300 μA, largura do pulso do estimulador = 300 μs, número estimulador de pulsos = 10 e tempo estimulador entre pulsos = 1 s.
- Inicie o protocolo de estimulação clicando em Executar no software MATLAB.
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Representative Results
Resultados representativos que podem ser obtidos com este protocolo são os potenciais de ação composto consistentes das fibras nervosas do tipo A dentro do nervo ciático. Esses potenciais de ação normalmente têm uma amplitude de pico a pico de aproximadamente 1 mV no eletrodo e, portanto, 100 mV uma vez amplificados (Figura 2). Amplitudes de estimulação semelhantes e larguras de pulso devem produzir amplitudes PAC semelhantes. Os eletrodos de manguitos de elastômero condutores geralmente exigirão amplitudes de estimulação ligeiramente maiores, a fim de obter a mesma amplitude CAP em comparação com eletrodos de punho de platina disponíveis comercialmente. Essa diferença é geralmente pequena em comparação com a variação da amplitude de estimulação necessária para estimular nervos provenientes de diferentes animais. Isso ocorre porque pequenas diferenças no tamanho do nervo e no ajuste do punho têm um grande efeito sobre a amplitude de estimulação necessária para obter uma amplitude específica da PAC, independentemente do material da braçadeira. Isso pode ser usado para testar os efeitos de diferentes composições tampão, como diferentes concentrações de íons ou a adição de substâncias excitatórias nervosas ou inibitórias, como a tetrodotoxina. Se o tubo de resíduos tampão for encaminhado para um recipiente extra, a adição de substâncias que alteram a excitabilidade nervosa podem ser tornadas temporárias para o experimento, com taxas de lavagem dependentes da taxa de entrada de buffer.
A densidade mínima de corrente, calculada como amplitude de estimulação dividida pela área superficial dos eletrodos de estimulação, necessária para ativar as fibras do tipo A, e obter um potencial de ação composta observável do osciloscópio foi plotada versus largura de pulso na Figura 3. Os resultados mostrados na Figura 3 representam a excitabilidade típica do nervo tanto para as algemas nervosas padrão de platina disponíveis comercialmente quanto para as algemas do nervo elastômero condutiva personalizadas.
Os nervos extraídos devem permanecer viáveis por aproximadamente 6h após a extração e, portanto, os experimentos devem se encaixar dentro desta janela de tempo. A perda de viabilidade nervosa leva a um declínio progressivo na amplitude e velocidade de condução da PAC. Após a amplitude potencial de ação diminuir abaixo de 50% da amplitude inicial (no início do registro), o nervo não deve mais ser considerado viável, pois os resultados serão significativamente distorcidos. Os resultados representativos em relação à longevidade nervosa são mostrados na Figura 4. Os nervos ciáticos direito e esquerdo foram extraídos de um animal entre 10:00 e 11:00 em um determinado dia. Os CAPs iniciais foram obtidos do nervo ciático direito durante os testes iniciais antes dos experimentos, e os CAPs padrão foram obtidos a partir de nervos ciáticos esquerdo e direito, que haviam sido mantidos vivos usando este protocolo, no final dos experimentos. A redução mínima da amplitude da PAC foi observada com o nervo ciático direito, enquanto a amplitude do nervo ciático esquerdo da PAC a aproximadamente 3 mV foi semelhante à do nervo ciático direito no início do experimento mais de 6 h após a extração nervosa.
Figura 1: Representação esquemática da configuração experimental utilizada no protocolo. Este número foi modificado a partir de Rapeaux, A. et al. (2020)20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os CAPs representativos obtiveram ex vivo após a estimulação por matrizes metálicas e condutoras de manguitom nervoso elastômero. Reproduzido com modificações de Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Limiar de ativação de fibra A de matrizes metálicas e condutoras de manguitomer. As barras de erro representam ±1 desvio padrão da média. Reproduzido com modificações de Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Os CAPs representativos obtiveram ex vivo durante um dia de experimentos e utilizando ambos os nervos ciáticos de um animal. (A) Fibra tipo A CAP obtida perto do meio-dia a partir do nervo ciático direito. (B) CAP de fibra do tipo A obtido no meio da tarde do nervo ciático esquerdo. (C) CAP de fibra do tipo A obtido no final de experimentos com o mesmo nervo ciático esquerdo em (B). O eixo x corresponde à hora do dia em que as gravações foram feitas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Neste trabalho, descrevemos um protocolo para preparar nervos ciáticos de ratos para neurofisiologia ex vivo. A extração de tecidos leva aproximadamente 30 minutos, incluindo manuseamento animal, anestesia, abate e dissecção, enquanto a limpeza nervosa, a colocação no banho e a implantação de eletrodos devem exigir 30 minutos adicionais antes que a gravação possa ser iniciada. A preparação do buffer pode ser realizada em 30 minutos, embora isso possa ser feito antes do resto do experimento. Este tipo de preparação e experimento tem sido usado e descrito nos últimos 7,12, utilizando tampões semelhantes e para o mesmo tipo de tecido. Para o conhecimento dos autores, no entanto, esta é a primeira vez que uma descrição da preparação do buffer, dissecção, configuração de equipamentos e gravação subsequente foi dada no mesmo documento.
Este protocolo pode permitir uma grande variedade de experimentos em neurofisiologia que não seriam possíveis em contextos in vitro ou in vivo . Por exemplo, uma vantagem das preparações ex vivo é que elas preservam a macro e a microestruturnão do tecido extraído ao mesmo tempo em que isolam esse tecido do resto do corpo. Isso resulta em uma configuração mais simples, pois a anestesia não precisa ser mantida, o que é um requisito em experimentos in vivo . Em termos de habilitação de experimentos, as preparações ex vivo permitem o uso de substâncias como a tetrodotoxina, que são difíceis de justificar em um contexto in vivo 23 , pois possuem alto risco para o animal. Quando o uso dessas substâncias beneficia a investigação, eles são mais fáceis de usar em preparações ex vivo . O uso do estimulador personalizado20 permite experimentos usando o bloco HFAC para neuromodulação usando esta configuração experimental.
O passo mais crítico no protocolo é a etapa de dissecção, pois mesmo um pequeno erro usando a tesoura de dissecção pode danificar o nervo se não for tomado cuidado suficiente. A velocidade nesta fase também é essencial, pois o tecido deve ser rapidamente extraído do corpo e colocado em um tampão refrigerado para maximizar a viabilidade no início da gravação. Após a extração do tecido, enquanto deve-se tomar cuidado ao limpar o nervo e implantar quaisquer eletrodos, o protocolo é mais flexível em relação ao tempo, e o risco de erro do operador é, portanto, menor. Como os diâmetros dos nervos e a colocação de fascicles dentro dos nervos variam de animal para animal, alguma variabilidade nos resultados deve ser esperada mesmo se usar os mesmos eletrodos e protocolo de estimulação. O efeito dessa variabilidade pode ser visto nas barras de erro para limiares de estimulação na Figura 3. É importante não beliscar o nervo em qualquer fase da preparação, pois isso pode causar danos irreversíveis ao tecido. Manuseie o nervo apenas por suas extremidades usando fórceps e com muito cuidado para não puxar o nervo esticado.
Vários aspectos do protocolo em sua forma atual podem ser melhorados aumentando a quantidade de equipamentos e o tempo de configuração. Para ajudar no diagnóstico de problemas potenciais com essa configuração experimental, medições automatizadas de pH e oxigênio dissolvido no banho poderiam ser úteis, mas não foram implementadas aqui. Ambas as medições podem ser obtidas utilizando métodos amperométricos ou potencialmétricos12,19. O equipamento que exigirá manutenção regular é o tubo e os vidros, que acumulam depósitos de sal ao longo do tempo. Os ganchos de gravação agCl também exigirão recosamento ou substituição regulares, juntamente com a referência AgCl. Os eletrodos de estimulação devem ser limpos após cada uso, mas geralmente não exigirão substituição para muitos experimentos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
DECLARAÇÃO DE ACESSO ABERTO:
Para fins de acesso aberto, o autor solicitou uma licença de Atribuição Comum Criativa (CC BY) (quando permitida pela UKRI, 'Open Government Licence' ou 'Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) licença pode ser declarada em seu lugar) a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor.
COMPARTILHAMENTO DE DADOS:
Os dados brutos utilizados nos números deste artigo serão disponibilizados pelos autores, sem reserva indevida.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o Dr. Gerald Hunsberger da GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, Rei da Prússia, PA, EUA e Galvani Bioelectronics (Stevenage, Reino Unido) por compartilharem sua técnica original de preparação nervosa conosco. Os autores reconhecem Robert Toth pelo projeto do banho nervoso de Câmara Dupla. Os autores reconhecem o financiamento da bolsa do Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas (EPSRC). Os autores reconhecem o Centro de Sistemas Incorporados e Distribuídos de Alto Desempenho para Treinamento de Doutorado (HiPEDS CDT) do Imperial College London por financiar Adrien Rapeaux (EP/L016796/1 ). Adrien Rapeaux é atualmente financiado pelo Uk Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Os autores agradecem Zack Bailey do Imperial College, no Departamento de Bioengenharia, por ajuda com experimentos e acesso a tecidos animais durante a produção do artigo de vídeo jove.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
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