Summary
Het huidige protocol beschrijft door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide type 2 alveolaire epitheelachtige cellen (iAT2s). Deze cellen kunnen worden gekweekt als zelfvernieuwende bollen in 3D-cultuur of worden aangepast aan de air-liquid interface (ALI) -cultuur.
Abstract
In de longen is het alveolaire epitheel een fysieke barrière tegen omgevingsstimuli en speelt het een essentiële rol bij homeostase en ziekte. Type 2 alveolaire epitheelcellen (AT2's) zijn de facultatieve voorlopers van het distale longepitheel. Disfunctie en letsel van AT2's kan het gevolg zijn van en bijdragen aan verschillende longziekten. Een beter begrip van at2-biologie is dus van cruciaal belang voor het begrijpen van longbiologie en -ziekte; primaire menselijke AT2's zijn echter over het algemeen moeilijk te isoleren en beperkt in aanbod. Om deze beperkingen te overwinnen, kunnen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide type 2 alveolaire epitheelcellen (iAT2's) worden gegenereerd via een gericht differentiatieprotocol dat de in vivo longontwikkeling samenvat. iAT2's groeien in feedervrije omstandigheden, delen een transcriptomisch programma met menselijke volwassen primaire AT2's en voeren belangrijke functies van AT2's uit, zoals productie, verpakking en afscheiding van oppervlakteactieve stoffen. Dit protocol beschrijft de methoden voor het handhaven van zelfvernieuwende iAT2's door seriële passaging in driedimensionale (3D) cultuur of het aanpassen van iAT2's aan lucht-vloeistof interface (ALI) cultuur. Een eencellige suspensie van iAT2's wordt gegenereerd voordat ze worden geplateerd in 3D-opgeloste keldermembraanmatrix (hierna "matrix" genoemd), waar ze zichzelf assembleren tot monolagige epitheliale bollen. iAT2's in 3D-cultuur kunnen serieel worden gedissocieerd in eencellige suspensies om te worden gepasseerd of verguld in 2D ALI-cultuur. In de ALI-cultuur vormen iAT2's een gepolariseerde monolaag waarbij het apicale oppervlak wordt blootgesteld aan lucht, waardoor dit platform gemakkelijk vatbaar is voor blootstelling aan het milieu. Vandaar dat dit protocol een onuitputtelijke voorraad iAT2's genereert, die meer dan 1 x 1030 cellen per invoercel produceert over 15 passages met behoud van het AT2-programma dat wordt aangegeven door SFTPCtdTomato-expressie . De resulterende cellen vertegenwoordigen een reproduceerbaar en relevant platform dat kan worden toegepast om genetische mutaties te bestuderen, omgevingsblootstellingen te modelleren of geneesmiddelen te screenen.
Introduction
In de longen zijn de luchtweg en alveolaire epitheelcellen de eersten die te maken krijgen met inhalatie van blootstelling aan het milieu, waaronder pathogenen die worden overgedragen via ingeademde aerosolen en schadelijke stimuli zoals sigarettenrook. Type 2 alveolaire epitheelcellen (AT2's) zijn essentieel bij het handhaven van longhomeostase omdat ze de facultatieve voorlopers zijn van het distale longepitheel, oppervlakteactieve stoffen produceren om de alveolaire oppervlaktespanning te verlichten en de aangeboren immuunrespons op geïnhaleerde blootstellingen te verhogen 1,2. AT2-disfunctie kan echter het gevolg zijn van longletsel of mutaties in genen die selectief tot expressie komen in AT2's, zoals SFTPC, SFTPB en ABCA3 3,4,5. Eerdere benaderingen voor het bestuderen van deze genetische mutaties zijn gebaseerd op muismodellen6 of gemanipuleerde, mutatiebevattende vectoren geïntroduceerd in onsterfelijke cellijnen7. Daarom zijn platforms nodig die de effecten van genetische en omgevingsverstoringen op AT2's in de fysiologisch relevante celtypen en in een productief in vitro systeem kunnen modelleren om de rol van AT2's in gezondheid en ziekte verder te begrijpen.
In termen van het modelleren van blootstellingen in de lucht, zijn air-liquid interface (ALI) culturen van primaire luchtwegepitheelcellen met succes gebruikt om belangrijke moleculaire reacties op sigarettenrook8 en op luchtweginfectie 9,10 te onthullen. Een vergelijkbaar ALI-kweeksysteem voor het alveolaire epitheel, een belangrijke plaats van infectie of letsel bij ziekte, is veel minder ontwikkeld in vergelijking met het luchtwegepitheelmodelsysteem. Onsterfelijke cellijnen zijn gekweekt bij ALI als een proxy voor het alveolaire epitheel11,12, maar deze cellijnen zijn transcriptomisch verschillend van primaire alveolaire epitheelcellen13 en missen belangrijke cellulaire machines, zoals het vermogen om oppervlakteactieve stoffen af te scheiden of tight junctions te vormen bij ALI12. Primaire menselijke AT2's kunnen worden gekweekt in 3D-bollen in de aanwezigheid van fibroblasten1,14, maar zijn onderhevig aan beperkingen, waaronder de beperkte toegankelijkheid van explant longen en hun neiging om te senesce of cellulair fenotype te verliezen in de meeste culturen tot nu toe. Deze kenmerken vormen een belemmering voor de wijdverbreide toepassing van primaire AT2-in vitrostudies, hoewel er recente vooruitgang is geboekt bij het optimaliseren van feedervrije 3D-culturen voor de uitbreiding van primaire AT2's 15,16,17,18.
Gerichte differentiatieprotocollen zijn ontwikkeld om in vivo ontwikkelingsmijlpalen samen te vatten om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide type 2 alveolaire epitheelcellen (iAT2s)19 te genereren. iAT2's groeien als zelfvernieuwende bollen in 3D-serumvrije cultuur in een gedefinieerd medium met CHIR99021, KGF, dexamethason, cAMP en 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), genaamd "CK + DCI"19, in afwezigheid van fibroblastfeeders en kunnen worden gekweekt voor >20 passages20,21. Bovendien delen iAT2's een transcriptomisch programma met menselijke volwassen primaire AT2's, vormen ze lamellaire lichamen en produceren en verpakken ze oppervlakteactieve stof 19,21,22. Dit protocol beschrijft de seriële passaging van iAT2's door de cellen te dissociëren naar een eencellige suspensie. Op dit punt kunnen iAT2's opnieuw worden geplateerd en verder worden uitgebreid in 3D-cultuur of verguld in 2D ALI-cultuur23. Deze methoden kunnen worden gebruikt om de intrinsieke biologie van AT2's in homeostase en ziekte20,22 te bestuderen en om de effecten van verbindingen of stimuli te ondervragen in een schaalbaar, fysiologisch relevant platform23,24, zoals eerder is aangetoond.
Protocol
Alle experimenten met de differentiatie van menselijke iPSC-lijnen werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Review Board van Boston University (protocol H33122). De dermale fibroblasten, aangeschaft voor herprogrammering naar iPSC's, werden verkregen van een donor met schriftelijke geïnformeerde toestemming, onder de goedkeuring van het Human Research Protection Office van de Washington University School of Medicine, St. Louis, MO. Geherprogrammeerde iPSC's werden gegenereerd in het Center for Regenerative Medicine aan de Boston University en boston medical center, Boston, MA.
1. Dissociatie van de alveolosfeer
- Bereid volledige serumvrije differentiatiemedia (cSFDM) voor volgens de in tabel 1 vermelde samenstelling.
- Bereid CK + DCI-media voor in de voorbereide cSFDM-basis volgens tabel 2.
- Ontdooi 2D (human embryonale stamcel-gekwalificeerde) en/of 3D (groeifactor verminderde) matrix op ijs zoals vereist voor de experimentele behoeften.
- Zuig al het CK + DCI-medium op met behulp van een pipet of een aanzuigende pipet met vacuüm uit de 3D-matrixdruppels met alveolosferen, afgeleid van gerichte differentiatie19, in een 12-putplaat.
- Voeg 1 ml dispase (2 mg/ml) per druppel toe. Pipetteer de druppel voorzichtig in de dispase met behulp van een P1000 pipet. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur en pipetteer na 30 min eenmaal op en neer.
- Breng de gedissocieerde organoïden (uit stap 1.5) over van één matrixdruppel in de dispase naar een conische buis van 15 ml. Voeg om te wassen 10 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM, zie Tabel met materialen) toe.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Aspiraleer het supernatant met behulp van een pipet of een aanzuigende pipet met vacuüm, zodat er zo min mogelijk bovennatuurlijk overblijft.
OPMERKING: Het is belangrijk om alle dispase te verwijderen, omdat elke resterende dispase de matrix kan oplossen waarin de cellen vervolgens zullen worden gezaaid. Als er een heldere waas boven de pellet wordt gezien, heeft de dispase de matrix niet volledig opgelost en kan er nog eens 20-30 minuten bij 37 °C meer dispase aan de pellet worden toegevoegd. - Resuspend de cellen in 1 ml van 0,05% trypsine per druppel en breng terug naar de 12-putplaat. Incubeer bij 37 °C gedurende 12-15 min. Observeer de dissociatie onder een microscoop. Vermijd het overpipeteren van de cellen in dit stadium.
OPMERKING: Aan het einde van de incubatie moeten de cellen een eencellige suspensie bereiken na 3-5 keer pipetteren met een P1000-pipet. Voor het doorgeven van iAT2s aan ALI (stap 3) moet de trypsinisatietijd worden geminimaliseerd (maximaal 12 minuten), zodat de cellen zich in 2-3-cels klonten bevinden in plaats van eencellige suspensie wanneer ze klaar zijn voor plating op de celkweekinzet. - Stop de werking van trypsine met een gelijk volume FBS-bevattend medium (10% ES-gekwalificeerde FBS in DMEM). Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met 10 ml IMDM. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Resuspend de cellen in een geschikt volume om te tellen en tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Van één confluent 50 μL matrixdruppel gezaaid bij 400 cellen/μL is de verwachte opbrengst 500.000 tot 1,5 x 106 cellen per druppel. - Gebruik de eencellige suspensie van iAT2-cellen om alveolosferen te genereren door plating in de 3D-matrix (stap 2) en/of plating op celkweekinzetstukken voor ALI-cultuur (stap 3).
2.3D beplating van iAT2s
- Bepaal na het tellen (stap 1.11) het aantal gewenste cellen dat opnieuw moet worden geplat in de 3D-matrix (400 cellen / μL van de matrix met 50-100 μL 3D-matrixdruppels per put van een 12-well plaat). Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder zoveel mogelijk bovennatuurlijk materiaal met een pipet.
- Resuspend de cellen in de 3D-matrix. Resuspend snel en op ijs, indien nodig, om te voorkomen dat de matrix polymeriseert (wat optreedt als het warm is).
- Gebruik een P200-pipet om één 3D-matrixdruppel per put in een voorverwarmde 12-putplaat te doseren. Pipetteer voorzichtig om te voorkomen dat er bubbels in de matrixdruppel ontstaan. Laat de celsuspensie niet bezinken tijdens het doseren van meerdere druppels.
- Plaats de plaat gedurende 20-30 minuten in een incubator van 37 °C om de matrixdruppels te laten polymeriseren.
- Voeg 1 ml CK + DCI + 10 μM Y-27632 medium (zie materiaaltabel) per put toe om de matrixdruppel te bedekken.
- Verander na 72 uur het medium in CK + DCI zonder 10 μM Y-27632.
- Vervang het medium elke 48-72 uur door verse CK + DCI.
OPMERKING: iAT2's moeten meestal ongeveer elke 10-14 dagen worden gepasseerd, afhankelijk van de cellijn en platingdichtheid.
3. Doorgeven van iAT2's aan ALI
- Bereid vers gecoate 6,5 mm celkweekinzetstukken 1 uur voor gebruik voor door de 2D-matrix in Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) te verdunnen tot werkoplossing volgens de instructies van de fabrikant voor de 2D-matrix (zie Materiaaltabel). Voeg vervolgens 100 μL van de verdunde matrix toe per celkweekinzet van 6,5 mm. Laat de matrix polymeriseren in een incubator van 37 °C gedurende 30 minuten of bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Zuig de overtollige matrix uit de celkweekinzetstukken op met behulp van een pipet of een aanzuigende pipet met vacuüm en spoel eenmaal met DMEM/F12. Zuig deze was op vlak voordat u de cellen toevoegt.
- Bepaal na het tellen het aantal cellen dat nodig is om het gewenste aantal cellen in de kweekinzetstukken te zaaien (520.000 levende cellen / cm2, overeenkomend met 172.000 levende cellen per 6,5 mm celkweekinzet). Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder zoveel mogelijk bovennatuurlijk mogelijk.
- Resuspend de cellen in het juiste volume om te zaaien met 100 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 per celkweekinvoeging (celsuspensie moet 1.720 cellen / μL zijn ). Voeg 100 μL toe aan het apicale compartiment van de celkweekinzet. Roer de plaat voorzichtig in een kruispatroon om een gelijkmatige verdeling van cellen over de celkweekinzet te garanderen en bevestig dit door onder een microscoop te controleren op 4x objectief.
OPMERKING: De zaaidichtheid is van cruciaal belang en moet mogelijk worden geoptimaliseerd, variërend van 160.000-300.000 cellen per celkweekinzetstuk van 6,5 mm. Calceïnegroen (zie Tabel van materialen) celdoorlatende kleurstof kan aan de cellen worden toegevoegd en op een omgekeerde fluorescerende microscoop worden bekeken om de cellen na het zaaien te visualiseren. - Voeg 500 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 toe aan het basolaterale compartiment van elke celkweekinzet.
- Aspiraat apicale CK + DCI + 10 μM van Y-27632 medium 48 h na het zaaien met behulp van een pipet om ALI te initiëren (bekend als "luchtlift").
OPMERKING: De cellen moeten op dit punt 100% confluent zijn. Als de cellen niet 100% confluent zijn, moeten stappen 3.7-3.8 nog steeds worden uitgevoerd op de aangegeven tijdstippen; confluent cel monolagen kunnen langer duren om zich te vormen. - Verander de basolaterale CK + DCI + 10 μM van Y-27632 medium na 72 h in CK + DCI zonder 10 μM Y-27632.
OPMERKING: Er moet minimaal of geen "lek" van medium naar de apicale kant zijn. Als dit echter in de eerste paar dagen gebeurt, blijf dan dagelijks de apicale kant aspirateren totdat er geen verdere lekkage is. - Vervang het basolaterale medium elke 48-72 uur door verse CK + DCI.
OPMERKING: De iAT2's die in ALI-culturen worden gebruikt, worden maximaal gerijpt 5-14 dagen na het plateren. - Onderhoud de cellen met zorgvuldige monitoring tot 28 dagen na het platen, indien nodig, voor meer langdurige experimenten.
OPMERKING: Zichtbare tekenen van ALI-falen, zoals het afpellen van de cellen weg van de rand van de insert of de vorming van gaten in de monolaag, kunnen worden waargenomen na een te lange tijd in cultuur, op welk moment de ALI niet langer bruikbaar is voor experimenten.
Representative Results
De iAT2's werden doorgegeven aan een eencellige suspensie en vervolgens opnieuw geplateerd in 3D-matrix of in 2D op celkweekinzetstukken voor ALI-cultuur (figuur 1). Na eencellige dissociatie werden de iAT2's geanalyseerd door flowcytometrie. Kortom, de cellen geresuspendeerd in 1% foetaal runderserum (FBS) in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met calceïneblauwe levensvatbaarheidskleurstof (1:1000) werden geanalyseerd op een flowcytometer, gating voor niet-fragmenten, singlets en tdTomato. Hier is bijvoorbeeld de SPC2-lijn (SPC2-ST-B2-kloon20), die een tdTomato-reporter heeft die is gericht op de endogene SFTPC-locus voor eenvoudige visualisatie en tracking van het AT2-programma in de loop van de tijd in cultuur (Figuur 2A). De iAT2 SFTPC-tdTomato-expressie bleef behouden wanneer deze in de 3D-matrix als bollen werd geplatet (figuur 2B) en wanneer deze werd verguld op celkweekinzetstukken (figuur 2C). Transepitheel elektrische weerstand (TEER) kan worden gemeten om de integriteit van de ALI-cultuur te bepalen (figuur 2D). Om TEER te meten, werd een voltohmmeter gebruikt (zie tabel met materialen), waarbij 100 μL CK + DCI-medium aan de apicale kamer werd toegevoegd. De celkweekinzetstukken bedekt met Matrigel in afwezigheid van zaadcellen werden behandeld als blanco's. Op drie locaties in elke put werden metingen gedaan.
Figuur 1: Schematische weergave van de protocolworkflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van het protocol. (A) Representatieve flowcytometrieresultaten voor SFTPC-tdTomato in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide type 2 alveolaire epitheelachtige cellen (iAT2s) gekweekt in 3D. De getoonde negatieve controle is niet-longendoderm (CD47lo). (B) Representatieve live-cell imaging van iAT2's gekweekt in 3D op verschillende dagen na passage (dpp) (SFTPC-tdTomato, schaalbalk = 50 μm). (C) Representatieve live-cell imaging van iAT2's verguld op lucht-vloeistof interface (SFTPC-tdTomato, scale bar = 500 nm). D) Representatieve transepitheel elektrische weerstand van iAT2's op het lucht-vloeistof grensvlak. n = 3, geven foutbalken de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagentia | Volume voor 500 ml | Eindconcentratie |
| Iscove's Gemodificeerde Dulbecco's Medium (IMDM) | 375 ml | 75% |
| Ham's F-12 voedingsmengsel (F12) | 125 ml | 25% |
| B-27 (met RA) supplement | 5 ml | 1% |
| N-2 aanvulling | 2,5 ml | 0.50% |
| BSA (7,5% aandeel) | 3,3 ml | 0.05% |
| Primocine (50 mg/ml bouillon) | 1 ml | 100 μg/ml |
| Glutamax (100x voorraad) | 5 ml | 1x |
| Ascorbinezuur (50 mg/ml bouillon) | 500 μL | 50 μg/ml |
| 1-Thioglycerol (MTG) (vanaf 26 μL in 2 ml IMDM) | 1,5 ml | 4,5 x 10-4 M |
Tabel 1: Samenstelling van de volledige serumvrije differentiatiemedia (cSFDM).
| Reagens | Eindconcentratie |
| Chir99021 | 3 μM |
| RhKGF | 10 ng/ml |
| Dexamethason | 50 nm |
| 8-bromoadenosine 30,50-cyclisch monofosfaat natriumzout (cAMP) | 0,1 mM |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | 0,1 mM |
Tabel 2: Samenstellingen van de CK + DCI media.
Discussion
AT2's handhaven longhomeostase en disfunctie van deze belangrijke alveolaire cellen kan zowel oorzaak als gevolg zijn van verschillende longziekten. Vanwege de moeilijkheid om toegang te krijgen tot primaire menselijke AT2's en deze te isoleren, worden iAT2's gegenereerd. Door de elders beschreven gerichte differentiatiemethoden toe te passen25 en de hier beschreven expansie en celzaaiing, kunnen iPSC's die uit elk individu worden gegenereerd, worden gedifferentieerd in robuust zelfvernieuwende iAT2's, waardoor patiëntspecifieke cellen worden geleverd voor biomedisch onderzoek, inclusief fundamentele biomedische onderzoeksontwikkelingsstudies, ziektemodellering, celgebaseerde therapieën of medicijnscreenings. Het huidige protocol beschrijft een methode voor het dissociëren van iAT2's naar een eencellige suspensie, die vervolgens opnieuw kan worden geplateerd in 3D Matrigel om alveolospheres te genereren voor celuitbreiding of opnieuw kan worden geplateerd in 2D ALI-cultuur voor verdere experimenten.
Het protocol heeft verschillende kritieke stappen om succesvolle passageing en replating in zowel 3D- als ALI-culturen te garanderen. Mechanische trituratie moet worden geminimaliseerd, omdat overmatig pipetteren de levensvatbaarheid van cellen kan verminderen. Bovendien is de zaaidichtheid van iAT2's in zowel 3D- als 2D ALI-culturen van cruciaal belang; voor 3D-cultuur is over het algemeen 400 cellen/μL 3D Matrigel optimaal voor de meeste iPSC-lijnen. Een reeks dichtheden van 100-500 cellen / μL is echter soms succesvol geweest en het optimaliseren van de dichtheid kan nodig zijn voor verschillende cellijnen. Voor ALI-cultuur is het optimaliseren van de zaaidichtheid van iAT2's op de celkweekinzetstukken ook essentieel om 48 uur na het zaaien (d.w.z. op de dag van de luchtlift) een confluente monolaag van cellen te bereiken. Sommige iAT2-lijnen vereisen meer cellen per insert; dus als probleemoplossing vereist is, wordt een bereik van 160.000-300.000 cellen / insert voor 24-well celkweekinzetstukken aanbevolen. 3D-culturen kunnen ook worden geschaald naar 24- en 48-well-platen door de zaaidichtheid op 400 cellen / μL 3D-matrix te houden en de matrixdruppelgrootte te verminderen tot respectievelijk 25 μL en 20 μL. ALI-culturen kunnen worden geschaald naar 96-well celkweekinzetstukken door elke insert te coaten met 30 μL van de matrix, 80.000 cellen in 30 μL per insert te platen en te voeden met 150 μL basolaterale media per put. Seeding-dichtheid en matrix- en mediavolumes moeten dienovereenkomstig worden geschaald en geoptimaliseerd voor andere plaatformaten.
Een beperking van dit protocol is dat de cellen die worden gebruikt voor ALI-plating voldoende moeten worden gezuiverd om NKX2-1 + en SFTPC + 19,20,21,23 te zijn om iAT2-OSI's te vormen, en ALI-cultuurvorming kan van lijn tot lijn variëren. Bovendien maakt dit protocol uitbreiding en generatie van AT2-only culturen mogelijk, waardoor een reductionistisch modelsysteem wordt geboden op basis van een enkel belangrijk alveolair celtype. Belangrijk is dat andere relevante alveolaire celtypen, zoals alveolaire type 1-cellen, ontbraken op deze platforms. Andere groepen hebben succes gehad met het kweken van primaire menselijke AT2's als sferoïden of organotypische culturen met of zonder fibroblasten 1,14,15,16,17; primaire menselijke AT2's hebben echter de neiging om hun expressie van belangrijke oppervlakteactieve stoffen te verliezen wanneer ze worden gekweekt in normale 2D-cultuur zonder ALI-omstandigheden26. Bovendien heeft recent werk aangetoond dat iAT2's hogere proliferatieve markers en lagere AT2-rijpingsmarkers uitdrukken dan verse, ongecultiveerde menselijke primaire AT2s27. Ondanks deze verschillen tussen iAT2's en verse primaire menselijke AT2's, ontdekten we dat zelfs gekweekte primaire AT2's transcriptomische verschillen vertoonden van verse, niet-gekweekte primaire AT2's27, en concluderen dus dat deze in vitro modellen verschillende sterke punten en beperkingen hebben voor het modelleren van in vivo longbiologie.
Het iAT2-platform kan worden toegepast om genetische mutaties van patiënt-afgeleide iPSC's19,20 te bestuderen. Het systeem kan ook aanzienlijk worden opgeschaald om geneesmiddelenscreening met een hoge doorvoer mogelijk te maken. Bovendien zijn iAT2 ALI's geschikt voor blootstelling aan het milieu, zoals virale of bacteriële infecties of blootstelling aan sigarettenrook, e-sigaretdamp of andere aerosolen23. Kortom, dit protocol voor het genereren van zowel 3D- als 2D ALI-culturen van iAT2's maakt langdurige kweek van een ziekterelevant celtype mogelijk en biedt een fysiologisch, schaalbaar platform dat het gebruik van deze cellen in vele toepassingen mogelijk maakt.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken de leden van de laboratoria Wilson, Kotton en Hawkins oprecht voor hun nuttige discussies. We zijn ook Greg Miller (CReM Laboratory Manager) en Marianne James (iPSC Core Manager) erg dankbaar voor hun onschatbare steun. We bedanken Brian Tilton en de BUMC Flow Cytometry Core voor hun technische hulp bij het sorteren van cellen (ondersteund door NIH grant #1S10OD021587-01A1). Dit werk werd ondersteund door een CJ Martin Early Career Fellowship van de Australian National Health and Medical Research Council toegekend aan RBW; NIH-subsidie F30HL147426 aan KMA; een I.M. Rosenzweig Junior Investigator Award van The Pulmonary Fibrosis Foundation en een Integrated Pilot Grant Award via Boston University Clinical & Translational Science Institute (1UL1TR001430) aan KDA; Zwitserse National Science Foundation (P2ELP3_191217) aan ABA; NIH verleent U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 en R01HL095993 aan DNK; en NIH verleent U01TR001810, R01DK101510 en R01DK117940 toegekend aan AAW; iPSC-onderhoud, bankieren en delen worden ondersteund door NIH-subsidie NO1 75N92020C00005. Figuur 1 is gemaakt met behulp van Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
| 12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
| 1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
| 2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
| 3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
| 8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
| Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
| B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
| Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
| Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
| Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
| Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
| Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
| Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
| Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
| Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
| Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. American Review of Respiratory Disease. 115 (6), Pt 2 81-91 (1977).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein C gene associated with familial interstitial lung disease. New England Journal of Medicine. 344 (8), 573-579 (2001).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein B gene responsible for fatal neonatal respiratory disease in multiple kindreds. Journal of Clinical Investigation. 93 (4), 1860-1863 (1994).
- Shulenin, S., et al. ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency. New England Journal of Medicine. 350 (13), 1296-1303 (2004).
- Nureki, S. I., et al. Expression of mutant Sftpc in murine alveolar epithelia drives spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 4008-4024 (2018).
- Katzen, J., et al. An SFTPC BRICHOS mutant links epithelial ER stress and spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (6), 126125 (2019).
- Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (7), 489-503 (2013).
- Purkayastha, A., et al. Direct exposure to SARS-CoV-2 and cigarette Smoke increases infection severity and alters the stem cell-derived airway repair response. Cell Stem Cell. 27 (6), 869-875 (2020).
- Matrosovich, M. N., Matrosovich, T. Y., Gray, T., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4620-4624 (2004).
- Tollstadius, B. F., Silva, A. C. G. d, Pedralli, B. C. O., Valadares, M. C. Carbendazim induces death in alveolar epithelial cells: A comparison between submerged and at the air-liquid interface cell culture. Toxicology in Vitro. 58, 78-85 (2019).
- Winton, H. L., et al. Cell lines of pulmonary and non-pulmonary origin as tools to study the effects of house dust mite proteinases on the regulation of epithelial permeability. Clinical and Experimental Allergy. 28 (10), 1273-1285 (1998).
- Kanagaki, S., et al. Hydroxypropyl cyclodextrin improves amiodarone-induced aberrant lipid homeostasis of alveolar cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 64 (4), 504-514 (2021).
- Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
- Kobayashi, Y., et al. Persistence of a regeneration-associated, transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis. Nature Cell Biology. 22, 934-946 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904 (2020).
- Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
- Alysandratos, K. -D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).
- Hurley, K., et al. Reconstructed single-cell fate trajectories define lineage plasticity windows during differentiation of human PSC-derived distal lung progenitors. Cell Stem Cell. 26 (4), 593-608 (2020).
- Sun, Y. L., et al. Heterogeneity in human iPSC-derived alveolar epithelial type II cells revealed with ABCA3/SFTPC reporters. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 65 (4), 442-460 (2021).
- Abo, K. M., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar type 2 cells mature and respond to environmental exposures in air-liquid interface culture. Journal of Clinical Investigation Insight. 7 (6), (2022).
- Huang, J., et al. SARS-CoV-2 infection of pluripotent stem cell-derived human lung alveolar type 2 cells elicits a rapid epithelial-intrinsic inflammatory response. Cell Stem Cell. 27 (6), 962-973 (2020).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
- Alysandratos, K. D., et al. Impact of cell culture on the transcriptomic programs of primary and iPSC-derived human alveolar type 2 cells. bioRxiv. , (2022).
