Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न प्रकार 2 वायुकोशीय उपकला जैसी कोशिकाओं (आईएटी 2 एस) का वर्णन करता है। इन कोशिकाओं को 3 डी संस्कृति में आत्म-नवीनीकरण क्षेत्रों के रूप में सुसंस्कृत किया जा सकता है या वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
फेफड़ों में, वायुकोशीय उपकला पर्यावरणीय उत्तेजनाओं से एक शारीरिक बाधा है और होमियोस्टेसिस और बीमारी में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। टाइप 2 वायुकोशीय उपकला कोशिकाएं (एटी 2 एस) डिस्टल फेफड़ों के उपकला के संकाय पूर्वज हैं। एटी 2 की शिथिलता और चोट के परिणामस्वरूप और विभिन्न फेफड़ों की बीमारियों में योगदान हो सकता है। एटी 2 जीव विज्ञान की बेहतर समझ, इस प्रकार, फेफड़ों के जीव विज्ञान और बीमारी को समझने के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि, प्राथमिक मानव एटी 2 आम तौर पर अलग करना मुश्किल होता है और आपूर्ति में सीमित होता है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न प्रकार 2 वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (आईएटी 2 एस) को एक निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है जो विवो फेफड़ों के विकास में पुनरावृत्ति करता है। आईएटी 2 फीडर-मुक्त स्थितियों में बढ़ते हैं, मानव वयस्क प्राथमिक एटी 2 के साथ एक ट्रांसक्रिप्टोमिक कार्यक्रम साझा करते हैं, और उत्पादन, पैकेजिंग और सर्फैक्टेंट के स्राव जैसे एटी 2 के प्रमुख कार्यों को निष्पादित करते हैं। यह प्रोटोकॉल तीन आयामी (3 डी) संस्कृति में सीरियल पासिंग के माध्यम से आत्म-नवीनीकरण आईएटी 2 को बनाए रखने या एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृति के लिए आईएटी 2 को अनुकूलित करने के तरीकों का विवरण देता है। आईएटी 2 एस का एक एकल-सेल निलंबन 3 डी घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (इसके बाद "मैट्रिक्स" के रूप में संदर्भित) में चढ़ाना से पहले उत्पन्न होता है, जहां वे मोनोलेयर्ड उपकला क्षेत्रों में स्वयं इकट्ठा होते हैं। 3 डी संस्कृति में आईएटी 2 को 2 डी एएलआई संस्कृति में पारित या चढ़ाया जाने के लिए एकल-सेल निलंबन में क्रमिक रूप से अलग किया जा सकता है। अली संस्कृति में, आईएटी 2 एस हवा के संपर्क में आने वाली एपिकल सतह के साथ एक ध्रुवीकृत मोनोलेयर बनाते हैं, जिससे यह मंच पर्यावरणीय एक्सपोजर के लिए आसानी से उत्तरदायी हो जाता है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल आईएटी 2 एस की एक अटूट आपूर्ति उत्पन्न करता है, जो एसएफटीपीसीटीडीटोमैटो अभिव्यक्ति द्वारा इंगित एटी 2 कार्यक्रम को बनाए रखते हुए 15 मार्गों पर प्रति इनपुट सेल प्रति 1 एक्स10 30 कोशिकाओं के ऊपर का उत्पादन करता है। परिणामी कोशिकाएं एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रासंगिक मंच का प्रतिनिधित्व करती हैं जिसे आनुवंशिक उत्परिवर्तन, मॉडल पर्यावरणीय एक्सपोजर या स्क्रीन दवाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
फेफड़ों में, वायुमार्ग और वायुकोशीय उपकला कोशिकाएं साँस के पर्यावरणीय जोखिमों का सामना करने वाले पहले व्यक्ति होते हैं, जिसमें साँस एरोसोल और सिगरेट के धुएं जैसे हानिकारक उत्तेजनाओं के माध्यम से प्रेषित रोगजनकशामिल हैं। टाइप 2 वायुकोशीय उपकला कोशिकाएं (एटी 2 एस) फेफड़ों के होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में आवश्यक हैं क्योंकि वे डिस्टल फेफड़ों के उपकला के संकाय पूर्वज हैं, वायुकोशीय सतह तनाव को दूर करने के लिए सर्फैक्टेंट्स का उत्पादन करते हैं, और साँसएक्सपोजर 1,2 के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को माउंट करते हैं। हालांकि, एटी 2 डिसफंक्शन फेफड़ों की चोटों या जीनों में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप हो सकता है जो चुनिंदा रूप से एटी 2 में व्यक्त किए जाते हैं, जैसे कि एसएफटीपीसी, एसएफटीपीबी, और एबीसीए 3 3,4,5। इन आनुवांशिक उत्परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए पिछले दृष्टिकोणों ने माउस मॉडल6 या इंजीनियर, उत्परिवर्तन युक्त वैक्टर पर भरोसा किया है जो अमर सेल लाइनों7 में पेश किए गए हैं। इसलिए, प्लेटफ़ॉर्म जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेल प्रकारों में और इन विट्रो सिस्टम में उत्पादक में एटी 2 पर आनुवंशिक और पर्यावरणीय गड़बड़ी के प्रभावों को मॉडल कर सकते हैं, स्वास्थ्य और बीमारी में एटी 2 की भूमिका को समझने के लिए आवश्यक हैं।
एयरबोर्न एक्सपोजर मॉडलिंग के संदर्भ में, प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृतियों का सफलतापूर्वक उपयोग सिगरेट के धुएं8 के लिए प्रमुख आणविक प्रतिक्रियाओं को प्रकट करने और वायुमार्ग संक्रमण 9,10 मॉडल करने के लिए किया गया है। वायुकोशीय उपकला के लिए एक तुलनीय अली संस्कृति प्रणाली, बीमारी में संक्रमण या चोट की एक प्रमुख साइट, वायुमार्ग उपकला मॉडल प्रणाली की तुलना में बहुत कम विकसित है। वायुकोशीय उपकला11,12 के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में एएलआई में अमर सेल लाइनों को सुसंस्कृत किया गया है, लेकिन ये सेल लाइनें प्राथमिक वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं13 से ट्रांसक्रिप्टोमिक रूप से अलग हैं और प्रमुख सेलुलर मशीनरी की कमी है, जैसे कि सर्फैक्टेंट्स को स्रावित करने या एएलआई12 में तंग जंक्शन बनाने की क्षमता। प्राथमिक मानव एटी 2 को फाइब्रोब्लास्ट1,14 की उपस्थिति में 3 डी क्षेत्रों में सुसंस्कृत किया जा सकता है, लेकिन सीमाओं के अधीन हैं, जिसमें एक्सप्लैंट फेफड़ों से सीमित पहुंच और आज तक अधिकांश संस्कृतियों में सेलुलर फेनोटाइप को सेनेस या खोने की उनकी प्रवृत्ति शामिल है। ये विशेषताएं इन विट्रो अध्ययनों में प्राथमिक एटी 2 के व्यापक गोद लेने के लिए बाधाएं प्रस्तुत करती हैं, हालांकि प्राथमिक एटी 2 एस 15,16,17,18 के विस्तार के लिए फीडर-मुक्त 3 डी संस्कृतियों को अनुकूलित करने में हाल ही में प्रगति की गई है।
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न प्रकार 2 वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (आईएटी 2 एस) 19 उत्पन्न करने के लिए विवो विकास ता्मक मील के पत्थर में पुनरावृत्ति के लिए निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। आईएटी 2 एस 3 डी सीरम-मुक्त संस्कृति में एक परिभाषित माध्यम में आत्म-नवीनीकरण क्षेत्रों के रूप में बढ़ते हैं जिसमें चीर 99 021, केजीएफ, डेक्सामेथासोन, सीएएमपी, और 3-आइसोब्यूटिल -1-मिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स) शामिल हैं, जिसे फाइब्रोब्लास्ट फीडर की अनुपस्थिति में "सीके + डीसीआई" 19 कहा जाता है और >20 मार्ग20,21 के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है। इसके अलावा, आईएटी 2 मानव वयस्क प्राथमिक एटी 2 एस के साथ एक ट्रांसक्रिप्टोमिक कार्यक्रम साझा करते हैं, लैमेलर निकाय बनाते हैं, और सर्फैक्टेंट19,21,22 का उत्पादन और पैकेज करते हैं। यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं को एकल-सेल निलंबन से अलग करके आईएटी 2 एस के सीरियल पासिंग का विवरण देता है। इस बिंदु पर, आईएटी 2 एस को 3 डी संस्कृति में आगे बढ़ाया और विस्तारित किया जा सकता है या 2 डी अली संस्कृति23 में चढ़ाया जा सकता है। इन विधियों का उपयोग होमियोस्टेसिस और बीमारी20,22 में एटी 2 एस के आंतरिक जीव विज्ञान का अध्ययन करने और एक स्केलेबल, शारीरिक रूप से प्रासंगिक मंच23,24 में यौगिकों या उत्तेजनाओं के प्रभावों से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पहले दिखाया गया है।
Protocol
मानव आईपीएससी लाइनों के भेदभाव से जुड़े सभी प्रयोग बोस्टन विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल एच 33122) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुपालन में किए गए थे। आईपीएससी को पुन: प्रोग्राम करने के लिए खरीदे गए त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट, वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, सेंट लुइस, एमओ के मानव अनुसंधान संरक्षण कार्यालय के अनुमोदन के तहत लिखित सूचित सहमति के साथ एक दाता से प्राप्त किए गए थे।
1. एल्वियोलोस्फीयर पृथक्करण
- तालिका 1 में उल्लिखित संरचना के अनुसार पूर्ण सीरम-मुक्त भेदभाव मीडिया (सीएसएफडीएम) तैयार करें।
- तालिका 2 के अनुसार तैयार सीएसएफडीएम आधार में सीके + डीसीआई मीडिया तैयार करें।
- पिघलना 2 डी (मानव भ्रूण स्टेम सेल-योग्य) और / या 3 डी (विकास-कारक कम) बर्फ पर मैट्रिक्स के रूप में प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए आवश्यक है।
- 12-अच्छी तरह से प्लेट में निर्देशित भेदभाव19 से व्युत्पन्न अल्वियोलोस्फीयर युक्त 3 डी मैट्रिक्स बूंदों से वैक्यूम के साथ एक विंदुक या एस्पिरेटिंग विंदुक का उपयोग करके सभी सीके + डीसीआई माध्यम को एस्पिरेट करें।
- प्रति बूंद 1 एमएल डिस्पेस (2 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। धीरे एक P1000 विंदुक का उपयोग कर dispase में छोटी बूंद विंदुक. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 30 मिनट के बाद एक बार ऊपर और नीचे पाइपिंग।
- अलग-अलग ऑर्गेनोइड्स (चरण 1.5 से) को डिस्पेस में एक मैट्रिक्स बूंद से 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। धोने के लिए, इस्कोव के संशोधित डल्बेको के माध्यम (आईएमडीएम, सामग्री की तालिका देखें) के 10 एमएल जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। वैक्यूम के साथ एक विंदुक या एस्पिरेटिंग विंदुक का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट करें, जितना संभव हो उतना कम सतह पर तैरनेवाला छोड़ दें।
नोट: सभी असंतोष को दूर करना महत्वपूर्ण है क्योंकि कोई भी शेष डिस्पेस मैट्रिक्स को भंग कर सकता है जिसे कोशिकाओं को बाद में वरीयता दी जाएगी। यदि गोली के ऊपर एक स्पष्ट धुंध देखी जाती है, तो डिस्पेस ने मैट्रिक्स को पूरी तरह से भंग नहीं किया है, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 20-30 मिनट के लिए गोली में अधिक डिस्पेस जोड़ा जा सकता है। - प्रति बूंद 0.05% ट्रिप्सिन के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 12-अच्छी तरह से प्लेट में वापस स्थानांतरित करें। 12-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक माइक्रोस्कोप के तहत पृथक्करण का निरीक्षण करें। इस स्तर पर कोशिकाओं को ओवर-पाइपिंग से बचें।
नोट: इनक्यूबेशन के अंत में, कोशिकाओं को पी 1000 विंदुक के साथ 3-5 बार पाइप करने के बाद एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने की आवश्यकता होती है। एएलआई (चरण 3) के लिए आईएटी 2 एस को पास करने के लिए, ट्रिप्सिनाइजेशन समय को कम से कम (अधिकतम 12 मिनट) करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि कोशिकाएं सेल संस्कृति डालने पर चढ़ाना के लिए तैयार होने पर एकल-सेल निलंबन के बजाय 2-3-सेल क्लंप में होती हैं। - एफबीएस युक्त माध्यम (डीएमईएम में 10% ईएस-योग्य एफबीएस) की समान मात्रा के साथ ट्रिप्सिन की कार्रवाई को रोकें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
- आईएमडीएम के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
- गिनती के लिए एक उपयुक्त मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और फिर हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: एक confluent 50 μL मैट्रिक्स बूंद से 400 कोशिकाओं / μL पर वरीयता प्राप्त, अपेक्षित उपज 500,000 से 1.5 x 106 कोशिकाओं प्रति छोटी बूंद है। - 3 डी मैट्रिक्स (चरण 2) में चढ़ाना और / या एएलआई संस्कृति (चरण 3) के लिए सेल संस्कृति आवेषण पर चढ़ाना द्वारा अल्वियोलोस्फीयर उत्पन्न करने के लिए आईएटी 2 कोशिकाओं के एकल-सेल निलंबन का उपयोग करें।
2.3D आईएटी 2 एस की चढ़ाना
- गिनती के बाद (चरण 1.11), 3 डी मैट्रिक्स में फिर सेप्लेट करने के लिए वांछित कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें (मैट्रिक्स के 400 कोशिकाओं / कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। एक विंदुक का उपयोग कर संभव के रूप में ज्यादा सतह पर तैरनेवाला निकालें।
- 3 डी मैट्रिक्स में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। मैट्रिक्स को बहुलक बनाने से रोकने के लिए, यदि आवश्यक हो, तो जल्दी से और बर्फ पर फिर से निलंबित करें (जो गर्म होने पर होता है)।
- एक पी 200 विंदुक का उपयोग करें एक पूर्व गर्म 12 अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से एक 3 डी मैट्रिक्स बूंद बांटने के लिए। मैट्रिक्स छोटी बूंद में बुलबुले बनाने से बचने के लिए सावधानी से विंदुक। कई बूंदों को वितरित करते समय सेल निलंबन को व्यवस्थित करने की अनुमति न दें।
- मैट्रिक्स बूंदों बहुलक करने के लिए अनुमति देने के लिए 20-30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट प्लेस।
- मैट्रिक्स बूंद को कवर करने के लिए सीके + डीसीआई + वाई -27632 माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 एमएल को अच्छी तरह से जोड़ें।
- 72 घंटे के बाद, वाई -27632 के 10 μM के बिना मध्यम को सीके + डीसीआई में बदल दें।
- हर 48-72 घंटे में ताजा सीके + डीसीआई के साथ माध्यम को बदलें।
नोट: आईएटी 2 एस को आमतौर पर सेल लाइन और चढ़ाना घनत्व के आधार पर लगभग हर 10-14 दिनों में पारित करने की आवश्यकता होगी।
3. एएलआई के लिए आईएटी 2 एस का पासिंग
- पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 (डीएमईएम / एफ 12) में 2 डी मैट्रिक्स को पतला करके उपयोग करने से पहले ताजा लेपित 6.5 मिमी सेल संस्कृति आवेषण 1 घंटे तैयार करें 2 डी मैट्रिक्स के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार काम करने वाले समाधान के लिए ( सामग्री की तालिका देखें)। फिर, 6.5 मिमी सेल संस्कृति डालने के प्रति पतला मैट्रिक्स के 100 μL जोड़ें। मैट्रिक्स को 30 मिनट के लिए या 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बहुलक करने की अनुमति दें।
- वैक्यूम के साथ एक विंदुक या आकांक्षी विंदुक का उपयोग करके सेल संस्कृति आवेषण से अतिरिक्त मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें और डीएमईएम / कोशिकाओं को जोड़ने से तुरंत पहले इस धोने को एस्पिरेट करें।
- गिनती के बाद, संस्कृति आवेषण में कोशिकाओं की वांछित संख्या बीज के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें (520,000 जीवित कोशिकाओं / सेमी2, प्रति 6.5 मिमी सेल संस्कृति डालने के लिए 172,000 जीवित कोशिकाओं के बराबर)। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला निकालें।
- सीके + डीसीआई + 10 μL सीके + डीसीआई + 10 μM वाई -27632 प्रति सेल संस्कृति डालने के साथ बीज के लिए उपयुक्त मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (सेल निलंबन 1,720 कोशिकाओं / सेल संस्कृति डालने के एपिकल डिब्बे में 100 μL जोड़ें। धीरे सेल संस्कृति डालने भर में कोशिकाओं का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक पार पैटर्न में प्लेट आंदोलन, और 4x उद्देश्य पर एक माइक्रोस्कोप के तहत जाँच करके इसकी पुष्टि करें।
नोट: सीडिंग घनत्व महत्वपूर्ण है और अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, 160,000-300,000 कोशिकाओं प्रति 6.5 मिमी सेल संस्कृति डालने से लेकर। कैल्सीन ग्रीन ( सामग्री की तालिका देखें) सेल-पारगम्य डाई को कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है और बोने के बाद कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर देखा जा सकता है। - प्रत्येक सेल कल्चर डालने के बेसोलेटरल डिब्बे में सीके + डीसीआई + वाई -27632 के 10 μ एम के 500 μL जोड़ें।
- एएलआई (जिसे "एयर-लिफ्ट" के रूप में जाना जाता है) शुरू करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करके बोने के बाद वाई -27632 मध्यम 48 घंटे के एस्पिरेट एपिकल सीके + डीसीआई + 10 μM।
नोट: कोशिकाओं को इस बिंदु पर 100% संयोजित होना चाहिए। यदि कोशिकाएं 100% संयोजित नहीं हैं, तो चरण 3.7-3.8 अभी भी संकेतित समय बिंदुओं पर किया जाना चाहिए; कंफ्लुएंट सेल मोनोलेयर्स को बनने में अधिक समय लग सकता है। - 72 घंटे के बाद वाई -27632 माध्यम के बेसोलेटरल सीके + डीसीआई + 10 μM को 10 μM Y-27632 के बिना सीके + डीसीआई में बदलें।
नोट: एपिकल पक्ष में माध्यम के "रिसाव" यदि कोई हो, तो न्यूनतम होना चाहिए। हालांकि, यदि यह पहले कुछ दिनों में होता है, तो जब तक कोई और रिसाव न हो, तब तक दैनिक एपिकल पक्ष को एस्पिरेट करना जारी रखें। - हर 48-72 घंटे में ताजा सीके + डीसीआई के साथ बेसोलेटरल माध्यम को बदलें।
नोट: अली संस्कृतियों में उपयोग किए जाने वाले आईएटी 2 को अधिकतम रूप से 5-14 दिनों के बाद चढ़ाना में परिपक्व किया जाता है। - अधिक लंबे समय तक प्रयोग के लिए, यदि आवश्यक हो, तो चढ़ाना के बाद 28 दिनों तक सावधानीपूर्वक निगरानी के साथ कोशिकाओं को बनाए रखें।
नोट: अली विफलता के दृश्यमान संकेत, जैसे कि मोनोलेयर में डालने या छेद के गठन के किनारे से दूर कोशिकाओं को छीलने के रूप में, संस्कृति में एक अतिरंजित समय के बाद देखा जा सकता है, जिस बिंदु पर एएलआई अब प्रयोगों के लिए उपयोग करने योग्य नहीं है।
Representative Results
आईएटी 2 को एकल-सेल निलंबन के लिए पारित किया गया था और फिर 3 डी मैट्रिक्स में या एएलआई संस्कृति (चित्रा 1) के लिए सेल संस्कृति आवेषण पर 2 डी में फिर से तैयार किया गया था। एकल-कोशिका पृथक्करण के बाद, आईएटी 2 एस का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। संक्षेप में, कैल्सीन ब्लू व्यवहार्यता डाई (1: 1000) के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) में फिर से निलंबित कोशिकाओं का विश्लेषण प्रवाह साइटोमीटर पर किया गया था, गैर-टुकड़ों, सिंगल्स और टीडीटोमैटो के लिए गेटिंग। यहां, एक उदाहरण के रूप में, एसपीसी 2 लाइन (एसपीसी 2-एसटी-बी 2 क्लोन20) है, जिसमें संस्कृति में समय के साथ एटी 2 कार्यक्रम के विज़ुअलाइज़ेशन और ट्रैकिंग में आसानी के लिए अंतर्जात एसएफटीपीसी लोकस को लक्षित एक टीडीटोमेटो रिपोर्टर है (चित्रा 2 ए)। आईएटी 2 एसएफटीपीसी-टीडीटोमैटो अभिव्यक्ति को बनाए रखा गया था जब 3 डी मैट्रिक्स में क्षेत्रों (चित्रा 2 बी) के रूप में फिर से तैयार किया गया था और जब सेल संस्कृति आवेषण (चित्रा 2 सी) पर चढ़ाया गया था। ट्रांस-एपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) को अली संस्कृति (चित्रा 2 डी) की अखंडता निर्धारित करने के लिए मापा जा सकता है। टीईईआर को मापने के लिए, एक वोल्टोहममीटर का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें), सीके + डीसीआई माध्यम के 100 μL के साथ एपिकल चैम्बर में जोड़ा गया था। वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की अनुपस्थिति में मैट्रिगेल के साथ लेपित सेल संस्कृति आवेषण को रिक्त स्थान के रूप में माना जाता था। हर कुएं में तीन स्थानों पर रीडिंग ली गई।
चित्र 1: प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न प्रकार 2 वायुकोशीय उपकला जैसी कोशिकाओं (आईएटी 2 एस) में एसएफटीपीसी-टीडीटोमैटो के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री परिणाम 3 डी में सुसंस्कृत हैं। दिखाया गया नकारात्मक नियंत्रण गैर-फेफड़े एंडोडर्म (सीडी 47 एलओ) है। (बी) विभिन्न दिनों के बाद पारित होने (डीपीपी) (एसएफटीपीसी-टीडीटोमेटो, स्केल बार = 50 μm) पर 3 डी में सुसंस्कृत आईएटी 2 एस के प्रतिनिधि लाइव-सेल इमेजिंग। (सी) एयर-लिक्विड इंटरफेस (एसएफटीपीसी-टीडीटोमैटो, स्केल बार = 500 एनएम) पर चढ़ाया गया आईएटी 2 एस का प्रतिनिधि लाइव-सेल इमेजिंग। (डी) वायु-तरल इंटरफ़ेस पर चढ़ाया गया आईएटी 2 एस के प्रतिनिधि ट्रांस-एपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध। एन = 3, त्रुटि सलाखों मानक विचलन इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| अभिकर्मकों | 500 एमएल के लिए वॉल्यूम | अंतिम एकाग्रता |
| इस्कोव के संशोधित डुल्बेको का माध्यम (आईएमडीएम) | 375 mL | 75% |
| हैम के एफ -12 पोषक तत्व मिश्रण (एफ 12) | 125 mL | 25% |
| बी -27 (आरए के साथ) पूरक | 5 एमएल | 1% |
| एन -2 पूरक | 2.5 एमएल | 0.50% |
| बीएसए (7.5% स्टॉक) | 3.3 एमएल | 0.05% |
| प्राइमोसिन (50 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक) | 1 mL | 100 μg/mL |
| ग्लूटामैक्स (100x स्टॉक) | 5 एमएल | 1x |
| एस्कॉर्बिक एसिड (50 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक) | 500 μL | 50 μg/mL |
| 1-थियोग्लिसरॉल (एमटीजी) (2 एमएल आईएमडीएम में 26 μL से) | 1.5 एमएल | 4.5 x 10-4 M |
तालिका 1: पूर्ण सीरम-मुक्त भेदभाव मीडिया (सीएसएफडीएम) की संरचना।
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | अंतिम एकाग्रता |
| CHIR99021 | 3 μM |
| आरएचकेजीएफ | 10 एनजी/एमएल |
| डेक्सामेथासोन | 50 nM |
| 8-ब्रोमोएडेनोसाइन 30,50-चक्रीय मोनोफॉस्फेट सोडियम नमक (सीएएमपी) | 0.1 mM |
| 3-आइसोब्यूटिल -1-मिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स) | 0.1 mM |
तालिका 2: सीके + डीसीआई मीडिया की रचनाएं।
Discussion
एटी 2 फेफड़ों के होमियोस्टेसिस को बनाए रखता है, और इन प्रमुख वायुकोशीय कोशिकाओं की शिथिलता विभिन्न फेफड़ों की बीमारियों का कारण और परिणाम दोनों कर सकती है। प्राथमिक मानव एटी 2 एस तक पहुंचने और अलग करने की कठिनाई के कारण, आईएटी 2 उत्पन्न होते हैं। कहीं औरवर्णित निर्देशित भेदभाव विधियों और यहां वर्णित विस्तार और सेल सीडिंग को लागू करके, किसी भी व्यक्ति से उत्पन्न आईपीएससी को मजबूत रूप से स्व-नवीनीकरण आईएटी 2 एस में विभेदित किया जा सकता है, इस प्रकार बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए रोगी-विशिष्ट कोशिकाएं प्रदान की जा सकती हैं, जिसमें बुनियादी बायोमेडिकल अनुसंधान विकास अध्ययन, रोग मॉडलिंग, सेल-आधारित उपचार, या दवा स्क्रीन शामिल हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में आईएटी 2 को एकल-सेल निलंबन से अलग करने के लिए एक विधि का विवरण दिया गया है, जिसे तब सेल विस्तार के लिए एल्वियोलोस्फीयर उत्पन्न करने के लिए 3 डी मैट्रिगेल में फिर से तैयार किया जा सकता है या आगे के प्रयोगों के लिए 2 डी एएलआई संस्कृति में फिर से तैयार किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल में 3 डी और एएलआई संस्कृतियों दोनों में सफल पासिंग और रिप्लेटिंग सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। मैकेनिकल ट्रिटरेशन को कम से कम किया जाना चाहिए, क्योंकि अत्यधिक पाइपिंग सेल व्यवहार्यता को कम कर सकती है। इसके अलावा, 3 डी और 2 डी एएलआई संस्कृतियों दोनों में आईएटी 2 एस का सीडिंग घनत्व महत्वपूर्ण है; 3 डी संस्कृति के लिए, सामान्य तौर पर, 3 डी मैट्रिगेल के 400 कोशिकाओं / हालांकि, 100-500 कोशिकाओं / μL से घनत्व की एक श्रृंखला, कभी-कभी, सफल रही है, और घनत्व को अनुकूलित करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों के लिए आवश्यक हो सकता है। अली संस्कृति के लिए, सेल संस्कृति आवेषण पर आईएटी 2 एस के सीडिंग घनत्व को अनुकूलित करना भी सीडिंग के 48 घंटे बाद कोशिकाओं के एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है (यानी, एयर-लिफ्ट के दिन)। कुछ आईएटी 2 लाइनों को प्रति डालने के लिए अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता होती है; इस प्रकार, यदि समस्या निवारण की आवश्यकता होती है, तो 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण के लिए 160,000-300,000 कोशिकाओं / 3 डी संस्कृतियों को 3 डी मैट्रिक्स के 400 कोशिकाओं / μL पर बोने घनत्व को बनाए रखने और मैट्रिक्स बूंद आकार को क्रमशः 25 μL और 20 μL तक कम करके 24- और 48-अच्छी तरह से प्लेटों तक बढ़ाया जा सकता है। अली संस्कृतियों को मैट्रिक्स के 30 μL के साथ प्रत्येक डालने कोटिंग करके 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है, प्रति सम्मिलित 30 μL में 80,000 कोशिकाओं चढ़ाना, और प्रति अच्छी तरह से बेसोलेटरल मीडिया के 150 μL के साथ खिलाना। सीडिंग घनत्व और मैट्रिक्स और मीडिया वॉल्यूम को अन्य प्लेट प्रारूपों के लिए तदनुसार स्केल और अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि अली चढ़ाना के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं को आईएटी 2 एएलआई बनाने के लिए एनकेएक्स 2-1 + और एसएफटीपीसी + 19,20,21,23 होने के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध किया जाना चाहिए, और एएलआई संस्कृति गठन लाइन से लाइन तक भिन्न हो सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एटी 2-केवल संस्कृतियों के विस्तार और पीढ़ी की अनुमति देता है, जो एक प्रमुख वायुकोशीय सेल प्रकार के आधार पर एक न्यूनीकरणवादी मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि अन्य प्रासंगिक वायुकोशीय सेल प्रकार, जैसे वायुकोशीय प्रकार 1 कोशिकाएं, इन प्लेटफार्मों से गायब थीं। अन्य समूहों को फाइब्रोब्लास्ट 1,14,15,16,17 के साथ या उसके बिना स्फेरॉइड या ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों के रूप में प्राथमिक मानव एटी 2 एस को संवर्धन करने में सफलता मिली है; हालांकि, प्राथमिक मानव एटी 2 एस एएलआई स्थितियों26 के बिना सामान्य 2 डी संस्कृति में सुसंस्कृत होने पर प्रमुख सर्फैक्टेंट्स की अपनी अभिव्यक्ति खो देते हैं। इसके अलावा, हाल के काम से पता चला है कि आईएटी 2 एस ताजा, असभ्य मानव प्राथमिक एटी 2 एस27 की तुलना में उच्च प्रोलिफेरेटिव मार्कर और कम एटी 2 परिपक्वता मार्करों को व्यक्त करते हैं। आईएटी 2 एस और ताजा प्राथमिक मानव एटी 2 एस के बीच इन मतभेदों के बावजूद, हमने पाया कि यहां तक कि सुसंस्कृत प्राथमिक एटी 2 ने ताजा, असभ्य प्राथमिक एटी 2एस 27 से ट्रांसक्रिप्टोमिक मतभेद प्रदर्शित किए, और इस प्रकार निष्कर्ष निकाला कि इन इन विट्रो मॉडलों में विवो फेफड़ों के जीव विज्ञान में मॉडलिंग के लिए विभिन्न ताकत और सीमाएं हैं।
आईएटी 2 प्लेटफ़ॉर्म को रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी 19,20 से आनुवंशिक उत्परिवर्तनका अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग को समायोजित करने के लिए सिस्टम को काफी हद तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, आईएटी 2 एएलआई पर्यावरणीय एक्सपोजर जैसे वायरल या बैक्टीरियल संक्रमण या सिगरेट के धुएं, ई-सिगरेट वाष्प, या अन्य एरोसोल23 के संपर्क में आने के लिए उपयुक्त हैं। संक्षेप में, आईएटी 2 एस के 3 डी और 2 डी अली संस्कृतियों दोनों को उत्पन्न करने के लिए यह प्रोटोकॉल एक रोग-प्रासंगिक सेल प्रकार की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुमति देता है और एक शारीरिक, स्केलेबल मंच प्रदान करता है जो कई अनुप्रयोगों में इन कोशिकाओं के उपयोग को सक्षम बनाता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम ईमानदारी से विल्सन, कोटन और हॉकिन्स प्रयोगशालाओं के सदस्यों को उनकी सहायक चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं। हम ग्रेग मिलर (सीआरईएम प्रयोगशाला प्रबंधक) और मैरिएन जेम्स (आईपीएससी कोर मैनेजर) के अमूल्य समर्थन के लिए भी बहुत आभारी हैं। हम सेल सॉर्टिंग (एनआईएच अनुदान #1S10OD021587 -01 ए 1 द्वारा समर्थित) के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए ब्रायन टिल्टन और बीयूएमसी फ्लो साइटोमेट्री कोर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद से सीजे मार्टिन अर्ली करियर फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था जो आरबीडब्ल्यू को सम्मानित किया गया था; एनआईएच केएमए को एफ 30 एचएल 147426 अनुदान देता है; द पल्मोनरी फाइब्रोसिस फाउंडेशन से आईएम रोसेनज़वेग जूनियर इन्वेस्टिगेटर अवार्ड और केडीए को बोस्टन यूनिवर्सिटी क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट (1यूएल 1 टीआर 001430) के माध्यम से एक एकीकृत पायलट अनुदान पुरस्कार; एबीए के लिए स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (P2ELP3_191217); एनआईएच डीएनके को यू01एचएल 148692, यू01एचएल 134745, यू01एचएल 134766 और आर 01एचएल 0 9 5 99 3 प्रदान करता है; और एनआईएच अनुदान यू01टीआर001810, आर 01 डीके 101510, और आर 01 डीके 117940 एएडब्ल्यू को सम्मानित किया गया; आईपीएससी रखरखाव, बैंकिंग और साझाकरण एनआईएच अनुदान संख्या 1 75 एन 9 2020 सी 00005 द्वारा समर्थित हैं। चित्रा 1 Biorender.com का उपयोग करके बनाया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
| 12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
| 1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
| 2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
| 3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
| 8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
| Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
| B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
| Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
| Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
| Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
| Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
| Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
| Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
| Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
| Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
| Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. American Review of Respiratory Disease. 115 (6), Pt 2 81-91 (1977).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein C gene associated with familial interstitial lung disease. New England Journal of Medicine. 344 (8), 573-579 (2001).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein B gene responsible for fatal neonatal respiratory disease in multiple kindreds. Journal of Clinical Investigation. 93 (4), 1860-1863 (1994).
- Shulenin, S., et al. ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency. New England Journal of Medicine. 350 (13), 1296-1303 (2004).
- Nureki, S. I., et al. Expression of mutant Sftpc in murine alveolar epithelia drives spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 4008-4024 (2018).
- Katzen, J., et al. An SFTPC BRICHOS mutant links epithelial ER stress and spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (6), 126125 (2019).
- Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (7), 489-503 (2013).
- Purkayastha, A., et al. Direct exposure to SARS-CoV-2 and cigarette Smoke increases infection severity and alters the stem cell-derived airway repair response. Cell Stem Cell. 27 (6), 869-875 (2020).
- Matrosovich, M. N., Matrosovich, T. Y., Gray, T., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4620-4624 (2004).
- Tollstadius, B. F., Silva, A. C. G. d, Pedralli, B. C. O., Valadares, M. C. Carbendazim induces death in alveolar epithelial cells: A comparison between submerged and at the air-liquid interface cell culture. Toxicology in Vitro. 58, 78-85 (2019).
- Winton, H. L., et al. Cell lines of pulmonary and non-pulmonary origin as tools to study the effects of house dust mite proteinases on the regulation of epithelial permeability. Clinical and Experimental Allergy. 28 (10), 1273-1285 (1998).
- Kanagaki, S., et al. Hydroxypropyl cyclodextrin improves amiodarone-induced aberrant lipid homeostasis of alveolar cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 64 (4), 504-514 (2021).
- Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
- Kobayashi, Y., et al. Persistence of a regeneration-associated, transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis. Nature Cell Biology. 22, 934-946 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904 (2020).
- Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
- Alysandratos, K. -D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).
- Hurley, K., et al. Reconstructed single-cell fate trajectories define lineage plasticity windows during differentiation of human PSC-derived distal lung progenitors. Cell Stem Cell. 26 (4), 593-608 (2020).
- Sun, Y. L., et al. Heterogeneity in human iPSC-derived alveolar epithelial type II cells revealed with ABCA3/SFTPC reporters. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 65 (4), 442-460 (2021).
- Abo, K. M., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar type 2 cells mature and respond to environmental exposures in air-liquid interface culture. Journal of Clinical Investigation Insight. 7 (6), (2022).
- Huang, J., et al. SARS-CoV-2 infection of pluripotent stem cell-derived human lung alveolar type 2 cells elicits a rapid epithelial-intrinsic inflammatory response. Cell Stem Cell. 27 (6), 962-973 (2020).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
- Alysandratos, K. D., et al. Impact of cell culture on the transcriptomic programs of primary and iPSC-derived human alveolar type 2 cells. bioRxiv. , (2022).
