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Bioengineering

Chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63877
Automatic Translation
1, 1
1The Salk Institute

Summary

Oligonukleotid-5′-Triphosphate sind allgegenwärtige Bestandteile in essentiellen biologischen Signalwegen und werden zunehmend in biotechnologischen Anwendungen eingesetzt. Hier beschreiben wir Techniken zur routinemäßigen Synthese und Aufreinigung von Oligonukleotid-5′-Triphosphaten, ausgehend von Oligonukleotiden, die durch automatisierte Standardsynthesetechniken hergestellt werden.

Abstract

Das 5′-Triphosphat ist eine essentielle Nukleinsäuremodifikation, die während des gesamten Lebens vorkommt und zunehmend als funktionelle Modifikation von Oligonukleotiden in der Biotechnologie und der synthetischen Biologie eingesetzt wird. Oligonukleotid-5′-triphosphate wurden in der Vergangenheit in vitro mit enzymatischen Methoden hergestellt. Diese Methoden beschränken sich jedoch auf natürliche RNA-Oligonukleotide, haben starke Sequenzpräferenzen und neigen dazu, heterogene Produkte herzustellen. Neue Methoden der chemischen Triphosphorylierung ergänzen sowohl die reduzierten Kosten der automatisierten Oligonukleotidsynthese durch Phosphoramidchemie als auch die vielfältigen Nukleotidmodifikationen, die jetzt verfügbar sind. Somit ist nun die Synthese von Oligonukleotidtriphosphaten beliebiger Sequenz und Länge, die gegebenenfalls verschiedene nichtnatürliche Modifikationen enthalten, zugänglich.

In diesem Beitrag werden die geeigneten Methoden und Techniken zur chemischen Triphosphorylierung von Oligonukleotiden unter Verwendung von Salicylphosphorochloridit und Pyrophosphat vorgestellt. Diese Methode verwendet kommerziell erhältliche Reagenzien, ist mit den meisten Oligonukleotiden kompatibel, die mit Standard-Festphasensynthesemethoden hergestellt werden, und kann in 2 h nach der Oligonukleotidsynthese vor Deprotektion und Reinigung abgeschlossen werden. Es werden zwei Anwendungen von chemisch triphosphorylierten Oligonukleotiden als Substrate für katalytische RNA-Enzyme demonstriert, darunter die Synthese einer spiegelbildlichen Version des Hammerkopf-Ribozyms aus nichtbiologischen L-RNA-Triphosphaten.

Introduction

Die 5′-triphosphorylierte Form der RNA ist in der Biologie allgegenwärtig, da sie durch RNA-Transkription in allen Bereichen des Lebens und durch RNA-Replikation während des Lebenszyklus vieler RNA-Viren erzeugt wird. Diese Triphosphate dienen als Substrat für die Bildung von 7-Methylguanylat-gekappter mRNA in Eukaryoten und spielen daher eine wesentliche Rolle bei der Proteinexpression1. Im Gegensatz dazu wird das Triphosphat in Bakterien und Viren zurückgehalten; Somit werden RNA 5′-Triphosphate von angeborenen Immunitätsreaktionsregulatoren in Eukaryoten 2,3,4,5,6,7 erkannt. Außerhalb der Biologie wurde eine Vielzahl von RNA-Ligase-Ribozymen entwickelt, um das 5′-Triphosphat in vitro8 zu verwenden und für die Verwendung in diagnostischen Assays 9,10,11,12,13,14,15 modifiziert. Ein solches Ribozym kann für die vorlagenabhängige Synthese von L-RNA, dem nichtbiologischen "spiegelbildlichen" Enantiomer der natürlichen D-RNA, aus kleinen L-RNA-Oligonukleotid-5′-Triphosphaten16,17,18 verwendet werden. Die routinemäßige Herstellung von triphosphorylierten Oligonukleotiden unterschiedlicher Sequenz und Rückgratzusammensetzung ist für die Untersuchung dieser Systeme unerlässlich.

Die gebräuchlichste und zugänglichste Methode zur Herstellung von RNA-5′-Triphosphaten im Labor ist die In-vitro-Transkription. Die mit dieser Methode hergestellte RNA ist jedoch in Sequenz und Größe durch die Promotor- und Substratanforderungen des RNA-Polymerase-Enzyms eingeschränkt. T7-RNA-Polymerase und spezialisierte Derivate sind die am häufigsten verwendeten Polymerasen für diesen Zweck 19,20,21,22. In vitro transkribierte RNA, die mit diesen Enzymen hergestellt wird, muss mit einem 5'-terminalen Purin initiiert werden und ist stark auf Purine in den ersten 10 Nukleotiden23,24 ausgerichtet. Darüber hinaus ist der enzymatische Einbau von Basen- oder Rückgrat-modifizierten Nukleotiden bestenfalls ineffizient und mit natürlichen Polymerasen häufiger unmöglich, was die Möglichkeit einschränkt, Oligonukleotid-5′-Triphosphate herzustellen, die aus etwas anderem als natürlicher D-RNA bestehen. Ein weiterer limitierender Faktor ist, dass RNA, die durch In-vitro-Transkription erzeugt wird, eine erhebliche 5′- und 3′-Heterogenität aufweisen kann und als extrem heterogene Produkte produziert wird, wenn sie kürzer als 20 nt23,24,25,26,27 ist.

Im Gegensatz dazu kann die chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden, die durch Festphasenphosphoramiditsynthese 28,29,30,31,32,33,34,35 hergestellt werden, verwendet werden, um Oligonukleotid-5′-Triphosphate 3-50 nt Länge beliebiger Sequenz herzustellen. Darüber hinaus kann eine breite Palette von Nukleinsäuremodifikationen, die für die Phosphoramiditensynthese zugänglich sind, vor der 5′-Triphosphorylierung 14,15,16,17,18,29,36 an Oligonukleotide angehängt werden. Viele dieser Methoden verwenden das Phosphitylationsreagenz Salicylphosphorochloridit, das von Ludwig und Eckstein für die Lösungsphasentriphosphorylierung von Mononukleosiden37 entwickelt wurde. Die Triphosphorylierung von Oligonukleotiden mit diesem Reagenz erfolgt in der festen Phase durch Phosphitylierung des Oligonukleotids 5′-hydroxyl, Umwandlung in das Triphosphat durch Reaktion mit Pyrophosphat und Oxidation, gefolgt von Standardverfahren zur Spaltung des Oligonukleotids aus dem festen Träger, Deprotektion und Reinigung (Abbildung 1)28.

Figure 1
Abbildung 1: Schema für die Triphosphorylierung von synthetischen Oligonukleotiden. Im ersten Schritt wird das Oligonukleotid 5ʹ-hydroxyl mit SalPCl phosphityliert. Im nächsten Schritt wird der 5'-Salicylphosphit mit TBAP zum cyclischen Metaphosphit umgesetzt, dann im dritten Schritt oxidiert, um das cyclische 5'-Trimetaphosphat in DNA/RNA-Synthesizer-Oxidationslösung (0,1 M Jod/Pyridin/H2O/THF) zu erzeugen, das schnell hydrolysiert wird, um das lineare 5'-Triphosphat in derselben Lösung28,33 zu erhalten. 37. Die anschließende alkalische Spaltung aus der festen CPG-Unterstützung und Deprotektion des Oligonukleotids in wässrigem MeNH2 / Ammoniak hydrolysiert jedes verbleibende cyclische Trimetaphosphat in die lineare Form. Abkürzungen: SalPCl = Salicylphosphorochloridit; TBAP = Tributylammoniumpyrophosphat; THF = Tetrahydrofuran; CPG = kontrolliertporiges Glas; MeNH2 = Methylamin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Obwohl frühe veröffentlichte Berichte mit dieser Methode oft unter schlechten Erträgen und unerwünschten Nebenprodukten litten28,37,38, ist die sorgfältige Aufrechterhaltung wasserfreier Bedingungen alles, was notwendig ist, um routinemäßig hohe Erträge zu erzielen. Dies kann durch eine sorgfältige Vorbereitung von Reagenzien und die Verwendung einer einfachen Reaktionsvorrichtung erreicht werden, die aus Standard-Kunststoffkomponenten zusammengesetzt ist. Hier demonstrieren wir die geeigneten Schritte zur chemischen Triphosphorylierung von Oligonukleotiden, einschließlich der Herstellung von Reagenzien, der Montage der Reaktionskammer, der Triphosphorylierungsreaktion und der anschließenden Deprotektion und Reinigung der triphosphorylierten Oligonukleotide. Ebenfalls enthalten ist die repräsentative Verwendung von 5′-triphosphorylierten Oligonukleotiden als Substrate für Ligase-Ribozyme zur Synthese größerer Nukleinsäureprodukte mit natürlicher D-RNA und abiotischen L-RNA-Rückgraten.

Protocol

1. Automatisierte Festphasensynthese von 5′-Hydroxyl-Oligonukleotiden auf einem festen Träger

  1. Bereiten Sie den automatisierten DNA/RNA-Synthesizer mit Reagenzien und Phosphoramiditen gemäß der Zieloligonukleotidzusammensetzung und den Instrumentenanweisungen vor.
  2. Laden Sie eine Synthesesäule mit Feststoffstütze auf den Synthesizer und synthetisieren Sie Oligonukleotide gemäß den Protokollen des Synthesizerinstruments.
    HINWEIS: Das Triphosphorylierungsverfahren wurde für Oligonukleotide optimiert, die im 1-μmol-Maßstab hergestellt werden.
  3. Entfernen Sie die 5′-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe, um das feststoffgestützte Oligonukleotid-5'-hydroxyl als Teil der Oligonukleotidsynthese im vorherigen Schritt zu erhalten, oder indem Sie einen terminalen Detritylationsschritt gemäß den Protokollen des Synthesizer-Instruments durchführen.
  4. Entfernen Sie die Säule, die das 5′-Hydroxyl-Oligonukleotid auf festem Träger enthält, aus dem Synthesizer, trocknen Sie unter einem Hausvakuum für 10 Minuten, um Lösungsreste zu entfernen, und fahren Sie mit der Triphosphorylierung fort (Abschnitte 3 und 4), sobald Materialien für die Triphosphorylierung vorbereitet sind (Abschnitt 2).
    HINWEIS: Bei nicht sofortiger Verwendung kann die getrocknete Säule unter normaler Atmosphäre in einem versiegelten Kunststoffbehälter mit Trockenmittel bei -20 °C gelagert werden. Eine weitere Trocknung ist in diesem Stadium nicht erforderlich, da die Kolonne vor der Triphosphorylierung in Abschnitt 3 gründlich getrocknet wird.

2. Aufbereitung von Materialien für die Triphosphorylierung

  1. Befestigen Sie eine trockene Argonquelle mit einstellbarem Druck an einem Gasverteiler mit mindestens zwei Leitungen und schließen Sie sie an einen Bubbler an. Stellen Sie sicher, dass die Leitungen in 1-ml-Kunststoffspritzen enden, um den Anschluss an das Reaktionsgerät zu erleichtern.
  2. Sammeln Sie Geräte für die Triphosphorylierung, einschließlich 1-ml-Kunststoffspritzen, eines Drei-Wege-Polypropylen-Absperrhahns, nicht kernender Nadeln, 1,5-ml-Polypropylenröhrchen und eines kleinen Metallspatels. Lagern Sie sie in einem versiegelten Behälter oder Exsikkator mit Trockenmittel bei Raumtemperatur für mindestens 1 Tag vor der Verwendung.
  3. Bereiten Sie jeweils 30 ml wasserfreies 1,4-Dioxan, 3:1 Dioxan:Pyridin nach Volumen, N,N-Dimethylformamid (DMF) und Acetonitril (ACN) in getrockneten 30 ml Glasflaschen mit Trocknungsfallen (4 Å Molekularsiebe in versiegelten Membranpaketen) mindestens 1 Tag vor Gebrauch vor. Mit Gummisepten verschließen und in einem Exsikkator mit Trockenmittel aufbewahren.
  4. Bewahren Sie festes 2-Chlor-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (Salicylphosphorochloridit, SalPCl) in seinem Originalbehälter in einem verschlossenen Glas mit Trockenmittel bei 4 °C auf. Spülen Sie den Behälter zwischen den Anwendungen immer mit Argon.
  5. Bereiten Sie mindestens 5 Tage vor der Triphosphorylierungsreaktion eine Tributylammoniumpyrophosphat (TBAP)-Lösung vor:
    1. Wiegen Sie 1-5 g festes TBAP in einer getrockneten 30-ml-Glasflasche und lösen Sie es in 1 ml DMF und 0,5 ml Tributylamin pro g TBAP auf.
    2. Fügen Sie drei Trockenfallen hinzu, verschließen Sie die Flasche mit einem Gummiseptum unter Argon und blasen Sie mit Argon für 30 Minuten, um zu entgasen.
    3. In einem verschlossenen Glas mit Trockenmittel bei 4 °C für 5 Tage aufbewahren, damit die Molekularsiebe das gesamte Spurenwasser aufnehmen können. Das Glas bei -20 °C lagern und nach 6 Monaten frisch zubereiten.

3. Montage und Verwendung der Triphosphorylierungsvorrichtung

  1. Lassen Sie die Synthesesäule auf Raumtemperatur erwärmen, wenn Sie bei -20 °C aus der Lagerung entnommen werden.
  2. Montage der in Abbildung 2 gezeigten Reaktionskammer:
    1. Bereiten Sie die Vorkammer vor: Entfernen Sie den Kolben aus einer trockenen 1-ml-Spritze, schneiden Sie die Oberseite der Spritze mit einer Schere oder einer Rasierklinge ab und befestigen Sie die Spritze an der Synthesesäule. Befestigen Sie den Drei-Wege-Absperrhahn an der Oberseite der Spritze und befestigen Sie den seitlichen Einlass des Absperrhahns mit dem Bubbler an der trockenen Argonquelle, so dass der obere Einlass des Absperrhahns der Reagenzieninjektionsanschluss ist.
    2. Befestigen Sie diese Apparatur an einem Ständer mit Klemmen und dichten Sie alle vorgeschalteten Verbindungen mit Wachsdichtfolie ab. Stellen Sie den Absperrhahn so ein, dass der Einspritzanschluss geschlossen ist und die Vorrichtung zur Argonquelle hin offen ist. Schließen Sie den Bubbler und lassen Sie Argon bei niedrigem Druck (<10 psi) 5 min lang durch die Reaktionskammer strömen.
      HINWEIS: Mehrere Reaktionskammern können parallel zu Triphosphorylat 2-4 Oligonukleotiden eingestellt werden. Eine Linie aus dem Verteiler sollte jedoch für die Versorgung der Reagenzflaschen mit Argon reserviert werden.
    3. Öffnen Sie den Bubbler erneut und befestigen Sie eine Spritze an der Unterseite der Synthesesäule, bei der es sich um die Abfallspritze handelt. Ziehen Sie Argon wiederholt mit der Abfallspritze durch die Säule; Befestigen Sie dann die Spritze wieder, wobei der Kolben vollständig eingedrückt ist.
      HINWEIS: Sofern keine Reagenzien geladen werden, sollte der Absperrhahn so eingestellt werden, dass der Injektionsanschluss geschlossen und die Vorrichtung zur Argonquelle hin geöffnet ist, wie in Abbildung 2A dargestellt. Ebenso sollte die Abfallspritze befestigt und die Verbindung zur Synthesesäule mit Wachssiegelfolie verschlossen werden, es sei denn, Reagenzien werden aktiv entfernt.
  3. So fügen Sie ein Reagenz oder Lösungsmittel hinzu:
    1. Befestigen Sie eine Nadel an der trockenen Argonquelle und führen Sie sie in das Reagenz- oder Lösungsmittelflaschenseptum ein, wobei Sie darauf achten, die Nadel nicht in den Flascheninhalt zu tauchen.
    2. Montieren Sie eine Trockenspritze mit einer Nadel und führen Sie sie in das Reagenz- oder Lösungsmittelflaschenseptum ein, ohne sie in den Flascheninhalt einzutauchen. Füllen Sie die Spritze mit Argon, ziehen Sie die Nadel aus dem Septum und stoßen Sie das Argon aus. Füllen Sie die Spritze mit Argon und stoßen Sie sie erneut aus; Füllen Sie dann die Spritze mit dem erforderlichen Volumen an Lösungsmittel oder Reagenz unter Argondruck.
    3. Stellen Sie den Absperrhahn am Gerät so ein, dass die Argonquelle geschlossen und der Einspritzanschluss geöffnet ist (Abbildung 2B). Entfernen Sie schnell die gefüllte Spritze und die Nadel aus der Quellflasche, wischen Sie alle Lösungsmittel ab, die an der Seite oder Spitze der Nadel haften, und führen Sie die Nadel in den Injektionsanschluss ein. Stoßen Sie das Reagenz in die Vorkammer des Geräts aus, entfernen Sie die Nadel und schließen Sie die Injektionsöffnung, wobei Sie die Vorrichtung wieder für die Argonquelle öffnen.
    4. Ziehen Sie die Flüssigkeit vorsichtig aus dem Vorraum durch die Synthesesäule mit der Abfallspritze, so dass nun die gesamte Flüssigkeit in der Abfallspritze gehalten wird. Schieben Sie die Lösung nun langsam wieder in die Synthesesäule, um sicherzustellen, dass sich keine Gasblasen in der Säule befinden. Zum Mischen oder Rühren ziehen Sie die Lösung vorsichtig mit der Abfallspritze über die Säule auf und ab.
      HINWEIS: Bewegen Sie Flüssigkeit immer langsam und sanft durch die Reaktionskammer, um sicherzustellen, dass keine Dichtungen gebrochen werden, wodurch Luft in das Gerät eindringen kann.
  4. So entfernen Sie ein Reagenz oder Lösungsmittel aus der Säule:
    1. Ziehen Sie die Lösung langsam in die Abfallspritze. Nachdem der Großteil der Lösung in die Abfallspritze gelangt ist, ziehen Sie Argon durch, um das verbleibende Lösungsmittel aus der Säule zu spülen.
    2. Entfernen Sie die Wachsdichtungsfolie um die Abfallspritzenfuge, entfernen Sie dann die Spritze und entsorgen Sie die Abfalllösung. Ersetzen Sie die Abfallspritze durch eine neue, trockene Spritze und verschließen Sie die Verbindung erneut mit Wachssiegelfolie.

Figure 2
Abbildung 2: Triphosphorylierungsapparatur. Während des Mischens oder der Reaktionen ist das Gerät (A) für die Argonquelle (i) offen und durch Einstellen des Drei-Wege-Absperrhahns (ii) zur Luft geschlossen. Reagenzien werden mit Hilfe der Abfallspritze (v) aus der Vorkammer (iii) in die Synthesesäule (iv) gezogen. Reagenzien werden entfernt, indem die gesamte Flüssigkeit in die Abfallspritze (v) gezogen und entsorgt wird. Beim Laden von Reagenzien (B) ist der Drei-Wege-Absperrhahn (ii) zur Atmosphäre hin offen, und das Reagenz wird mittels einer Spritze und einer Nadel (vi) in die Vorkammer (iii) geladen. (C) Ein Foto des montierten Geräts, das gemäß Buchstabe A) zum Mischen und Reagieren von Reagenzien eingestellt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. On-Säulen-Triphosphorylierung von synthetischem 5'-hydroxyl-Oligonukleotid

  1. Entfernen Sie die SalPCl- und TBAP-Lösung bei -20 °C aus dem Lager, und lassen Sie sie vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.
  2. Gemäß den Schritten 3.3.1-3.3.3 werden 200 μL Pyridin/Dioxan in die Vorkammer gegeben. Bis Schritt 4.4 wird jedoch kein Lösungsmittel auf die Synthesesäule geladen.
  3. Verwenden Sie einen trockenen Metallspatel, um 6-12 mg SalPCl in ein trockenes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu wiegen, und lösen Sie es in 100 μL Dioxan auf, indem Sie das Lösungsmittel vorsichtig im Mikrozentrifugenröhrchen auf und ab spritzen.
  4. Das gelöste SalPCl wird in die Vorkammer gegeben und nach Schritt 3.3 auf die Synthesesäule geladen. Lassen Sie es 15 min reagieren und rühren Sie die Lösung alle 5 min. Entfernen und verwerfen Sie die SalPCl-Lösung gemäß Schritt 3.4.
    HINWEIS: SalPCl wird im großen Überschuss zugegeben und saugt jegliches Wasser, das während der Vorbereitung und des Ladens absorbiert wird, in die Reaktionskammer. Die Einführung von Feuchtigkeit während der Schritte 4.5 und 4.6 beeinträchtigt jedoch die endgültige Oligonukleotid-5′-Triphosphatausbeute.
  5. 250 μL TBAP-Lösung in die Vorkammer geben und nach Schritt 3.3 auf die Synthesesäule laden. Lassen Sie es 20 min reagieren und rühren Sie alle 5 min. Entfernen und verwerfen Sie die TBAP-Lösung gemäß Schritt 3.4.
  6. Waschen Sie die Säule mit 0,5 ml DMF, dann 0,5 ml ACN und entfernen Sie das Lösungsmittel nach jeder Zugabe gemäß den Schritten 3.3 und 3.4.
  7. 250 μL Oxidationsmittellösung (0,1 M Jod in Tetrahydrofuran (THF)/Pyridin/Wasser, 88:10:2) in die Vorkammer geben und nach Schritt 3.3 auf die Synthesesäule laden. Lassen Sie es 30 min reagieren und rühren Sie alle 10 min. Entfernen Sie die Oxidationsmittellösung und entsorgen Sie sie gemäß Schritt 3.4.
  8. Waschen Sie die Säule mit 0,5 ml ACN und entfernen Sie sie gemäß den Schritten 3.3 und 3.4.
  9. Zerlegen Sie den Reaktionsapparat. Waschen Sie die Synthesesäule mit 5 ml ACN und trocknen Sie die Säule.

5. Spaltung durch feste Unterstützung, Entschutz und Reinigung

  1. Entfernen Sie das getrocknete feste Stützharz aus der Synthesesäule und geben Sie es auf ein 1,5 ml Polypropylen-Schraubverschluss-Siegelrohr mit einem Silikon-O-Ring.
  2. Suspendieren Sie das Harz in 1 ml einer 1: 1-Mischung aus 28% -30% wässrigem Ammoniak und 40% wässrigem Methylamin (AMA) und verschließen Sie das Röhrchen fest. Bei 65 °C für 10 min mit intermittierender Vermischung durch sanfte Inversion39 inkubieren. Verwenden Sie eine mildere Behandlung bei Raumtemperatur für 2 h für Oligonukleotide länger als 40 nt.
    ACHTUNG: Durch das Erhitzen der AMA-Lösung wird das Rohr unter hohen Druck gesetzt. Wenn der Schlauch nicht dicht verschlossen ist oder kein ammoniakkompatibler (Silikon-) O-Ring verwendet wird, kann der Schlauch Gas oder auslaufendes Lösungsmittel entlüften, was möglicherweise die Sicherheit oder die Endproduktausbeute beeinträchtigt. Öffnen Sie das Rohr niemals, während es sich über der Umgebungstemperatur befindet, da heiße AMA-Lösung Gas heftig entwickeln kann.
  3. Das Röhrchen auf Eis kühlen und kurz zentrifugieren (6.000-12.000 × g für 10 s). Entfernen Sie den Überstand aus dem Harz, filtern Sie durch eine Spritze, die mit einem 0,2-μm-Filter ausgestattet ist, und geben Sie ihn in ein neues, steriles Polypropylenröhrchen um. Verdampfen Sie die Lösung mit einer Vakuumzentrifuge, die mit einer ammoniakneutralisierenden chemischen Falle ausgestattet ist, zum Trocknen.
    HINWEIS: Wenn das synthetische Oligonukleotid keine RNA-Nukleotide mit 2′-Silyl-Schutzgruppen enthält, fahren Sie mit Schritt 5.8 fort.
  4. Silylschutzgruppen entfernen, indem das getrocknete Material in 1 ml 1 M Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) in THF gelöst, auf 55 °C erhitzt, erforderlichenfalls geschüttelt wird, um das Oligonukleotid vollständig aufzulösen, und bei Raumtemperatur für 16-24 h40,41 inkubiert wird.
  5. Löschen Sie die TBAF-Lösung mit 1 ml 1 M Tris-Puffer, pH 7,5, und entfernen Sie THF mit einer Vakuumzentrifuge.
  6. Entfernen Sie TBAF-Salze mithilfe einer Einweggrößen-Ausschlussspalte gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bei Oligonukleotiden kürzer als 15 nt ist die Elution des Produkts zu bestätigen, indem das Eluat in Fraktionen gesammelt und die Hauptproduktfraktionen durch Absorption bei 260 nm auf einem UV-Vis-Spektralphotometer identifiziert werden.
  7. Konzentrieren Sie das degeschützte RNA-Oligonukleotid durch Lyophilisation oder Vakuumzentrifuge, wenn weniger als 15 nt, oder durch Ethanolfällung, wenn es größer als 15 NT ist.
  8. Bereiten Sie eine präparative Skala 10% -20% Polyacrylamid / 8 M Harnstoff / 1x TBE-Gel mit 19: 1 Mono: Bis-Acrylamid-Material gemäß den entsprechenden Protokollen für Oligonukleotidgröße, Gelplatte und Ständer vor. Montieren Sie die Gelplatte im Gelständer mit 1x TBE in Reservoirs und Vorlauf bei 35 W (oder je nach Gelplattenformat) für mindestens 30 min.
  9. Das feste Oligonukleotid in Harnstoffgel-Beladungspuffer (8 M Harnstoff, 10% Saccharose, 50 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA mit Bromphenol- und Xylol-Lauffarbstoffen) auflösen und auf 80 °C erhitzen. Laden Sie auf das Polyacrylamidgel und laufen Sie für 1-2 h bei 25-35 W (oder je nach Gelplattenformat und Oligonukleotidgröße).
    HINWEIS: Bromphenolblau oder Xylolcyanol sollte aus dem Gelladepuffer für Oligonukleotide mit kürzeren als 15 NT ausgeschlossen werden, wenn eine der beiden mit dem Produkt mitmigriert, da es schwierig ist, diese Farbstoffe aus dem eluierten Oligonukleotid ohne Ethanolfällung zu entfernen.
  10. Wenn die Gelelektrophorese abgeschlossen ist, entfernen Sie die Gelplatte aus dem Gelständer, zerlegen Sie die Gelplatte und wickeln Sie das Gel in Polyvinylchloridfolie ein. Identifizieren Sie die Produktbänder durch Rückschatten mit 254 nm UV-Licht und entfernen Sie das Hauptproduktband mit einer Rasierklinge.
  11. Extrahieren Sie das Oligonukleotid aus dem ausgeschnittenen Gel mit der Crush-and-Soak-Methode42.
    1. Zerkleinern Sie das ausgeschnittene Gel, indem Sie es durch eine Kunststoffspritze oder mechanisch extrudieren.
    2. Für Oligonukleotide länger als 15 nT:
      1. Elutieren in 3x Volumina Crush und Einweichpuffer (300 mM NaCl; 10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) für mindestens 12 h mit Rühren oder Schütteln.
      2. Entfernen Sie feste Gelstücke, indem Sie die Lösung durch eine Spritze führen, die mit einem 0,2-μm-Filter ausgestattet ist, und konzentrieren Sie das Oligonukleotid durch Ethanolfällung.
    3. Für Oligonukleotide kürzer als 15 nt:
      1. In 3x Mengen nukleasefreiem Wasser für mindestens 12 h mit Rühren oder Schütteln eluieren.
      2. Entfernen Sie feste Gelstücke, indem Sie die Lösung durch eine Spritze führen, die mit einem 0,2-μm-Filter ausgestattet ist, und konzentrieren Sie sich durch Lyophilisation.
      3. Entfernen Sie Restsalze und gelöste Stoffe mithilfe einer Ausschlussspalte für Einweggrößen wie in Schritt 5.6. Konzentrat durch Lyophilisation.
  12. Lagern Sie gereinigte triphosphorylierte Oligonukleotide bei -20 °C im TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) oder in einem ähnlichen Oligonukleotid-Speicherpuffer.
    1. Bestimmen Sie die Konzentration des Oligonukleotids, indem Sie die Absorption bei 260 nm mit einem UV-Vis-Spektralphotometer messen.
      HINWEIS: Der geschätzte Extinktionskoeffizient des Oligonukleotids sollte nicht durch seinen 5′-Phosphorylierungszustand beeinflusst werden und kann aus seiner Sequenz mit einem Oligonukleotid-Extinktionskoeffizientenrechner berechnet werden.
    2. Nachweis der Triphosphorylierung durch Massenspektrometrie. Achten Sie auf eine erwartete Masse von +239,94 Da relativ zu der des 5′-Hydroxyl-Oligonukleotids.
      HINWEIS: Entweder matrixgestützte Laserdesorption/-ionisation oder Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie (MALDI-MS bzw. ESI-MS) eignen sich zur Identifizierung des Triphosphorylierungszustands des Oligonukleotids unter Verwendung von für Nukleinsäuren optimierten Protokollen. ESI-MS liefert jedoch aufgrund geringerer Ionenfragmentierungsraten konsistentere Ergebnisse; eine repräsentative kommerzielle Dienstleistung wird in der Materialtabelle erbracht.

6. Triphosphorylierte Oligonukleotide als Substrate für die Ribozym-Selbstreplikation

VORSICHT: 32P ist ein radioaktives Isotop und die folgenden Schritte sollten unter Verwendung von Standardsicherheitsprotokollen für die Arbeit mit radioaktiven Stoffen in einem Labor und von einem Forscher durchgeführt werden, der von den zuständigen Abteilungen für Umweltgesundheit und Sicherheit für die Verwendung radioaktiver Stoffe zertifiziert wurde. Alternativ kann selbstreplizierendes Ribozymsubstrat A synthetisch mit einem 5′-Fluorescein-Label14 hergestellt und fluoreszierend abgebildet werden, wie in Schritt 7.9.

  1. Bereiten Sie Lösung A als eine Mischung aus Selbstreplikator-Ribozym E und 5′-32 P-markiertem RNA-Substrat A14 auf Konzentrationen von 0,30 μM bzw. 30μM vor. Herstellung von Lösungen B-transkribiert und B-synthetisch mit 15 μM triphosphoryliertem RNA-Substrat B, hergestellt durch In-vitro-Transkription 14 bzw. chemische Triphosphorylierung wie oben, in 75 mM EPPS-Puffer, pH 8,5 und 37,5 MgCl2. Bringen Sie beide Lösungen auf 42 °C.
    HINWEIS: Alle RNA-Komponenten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
  2. Um die Selbstreplikation zu initiieren, mischen Sie schnell 5 μL Lösung A mit 10 μL Lösung B-transkribiert oder B-synthetisch zu einer Endkonzentration von 0,1 μM E, 10 μM A, 10 μM B, 25 mMMgCl 2 und 50 mM EPPS-Puffer, pH 8,5. Das Reaktionsgemisch wird bei 42 °C inkubiert.
  3. Nehmen Sie in regelmäßigen Abständen 0,5 μL Aliquots und löschen Sie 9,5 μL Formamid-Gel-Belastungspuffer (95% Formamid; 10 mM EDTA, pH 8) ein.
  4. Bereiten Sie ein analytisches Polyacrylamid / 8 M Harnstoff / 1x FSME-Gel gemäß den entsprechenden Protokollen für die Gelplatte und den Ständer vor. Montieren Sie das gegossene Gel und die Platte in einem Gelständer, füllen Sie die Behälter mit 1x FSME und führen Sie sie bei 40 W (oder gegebenenfalls für verschiedene Gelplatten und Ständer) für 30 min vor.
  5. Erhitzen Sie die abgeschreckten Reaktionsproben auf 80 °C, laden Sie 5 μL der Probe in jede Vertiefung und lassen Sie das Gel mit 40 W für ca. 40 min (oder je nach Bedarf für verschiedene Gelplatten und Ständer) laufen.
  6. Entfernen Sie die Gelplatte aus dem Gelständer, zerlegen Sie es und wickeln Sie es in Polyvinylchloridfolie ein. Decken Sie das Gel mit einem Phosphorsieb ab und belichten Sie es für 1 h (oder gegebenenfalls für 32P cpm); Scannen Sie den Bildschirm mit einem fluoreszierenden/phosphoreszierenden Gelscanner.
  7. Quantifizieren Sie die Reaktionsausbeute mit einer Gelbildquantifizierungssoftware.
    1. Öffnen Sie das Gelbild mit der Analysis Toolbox und wählen Sie Analyse | Formdefinition, wählen Sie Bereiche | der Rechteckform aus, und zeichnen Sie Rechtecke gleicher Größe um Bänder, die für jedes Mal und beide Reaktionen dem nicht umgesetzten A und dem Produkt E entsprechen.
    2. Wählen Sie Analyse | Hintergrundsubtraktion, wählen Sie Bereiche | der Rechteckform und zeichnen Sie ein Rechteck gleicher Größe in einem leeren Teil des Gelbildes. Ändern Sie die Hintergrundsubtraktionsmethode für alle Rechtecke in Bildrechteg.
    3. Wählen Sie Fenster | 2-Bereichsfenster und dann | bearbeiten Exportieren Sie nach Excel , um die quantifizierten Bandpixelvolumes in eine Tabellenkalkulationsdatei zu exportieren.
  8. Zeichnen Sie die Konzentration von Produkt E im Vergleich zur Zeit auf und passen Sie die Daten mit statistischer Datenanpassungssoftware an den logistischen Wachstums-Äq (1) an:
    [E] = Equation 1 (1)
    Wo a das maximale Ausmaß der Reaktion ist, b der Grad der Sigmoidizität und c die exponentielle Wachstumsrate ist.
    1. Teilen Sie in der exportierten Tabelle das Produkt-E-Volumen durch die Summe aus Substrat-A- und Produkt-E-Volumina, um die fraktionierte Produktausbeute für jedes Mal und beide Reaktionen zu bestimmen. Multiplizieren Sie mit der Anfangskonzentration von Substrat A (10 μM), um die Ausbeute von Produkt E als Funktion der Zeit zu bestimmen.
    2. Wählen Sie in der Software zur Anpassung statistischer Daten die Option Datei | Neue | Neue Projektdatei, wählen Sie XY unter Neue Tabelle & Diagramm und klicken Sie auf Erstellen. Geben Sie die Reaktionszeiten und Produkt-E-Ergebnisse für beide Reaktionen in benachbarten Spalten ein und beschriften Sie die Spalten entsprechend (z. B. "Zeit", "transkribiert B", "synthetisch B").
    3. Wählen Sie | einfügen Neue Analyse, wählen Sie XY-Analysen | Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie Wachstumskurven | Logistisches Wachstum und klicken Sie auf OK; Passen Sie keine anderen Parameter an. Beobachten Sie die Anpassungsparameter und Konfidenzintervalle unter Ergebnisse und das Diagramm von Datenpunkten und angepassten Kurven unter Diagramme.

7. Kreuzchirales Kopieren von L-RNA

  1. Es werden 10 μL RNA-Lösung hergestellt, die 20 μM D-RNA 27,3 t kreuzchirale Polymerase, 2 μM 5′-fluorescein-markierten L-RNA-Primer, 4 μM biotinylierte L-RNA-Hammerhead-Vorlage und je 20 μM L-RNA pppCUG, pppAUG, pppAGG und pppCGC in 10 μL von 50 mM Tris, pH 8,3 enthält. Die RNA wird geglüht, indem man sie für 1 min auf 90 °C erhitzt und in einem PCR-Thermocycler auf 23 °C bei 0,2 °C/s abkühlt. Weitere Informationen zu Polymerase, Primer und Schablone finden Sie in der Materialtabelle .
  2. Inkubieren Sie die RNA-Lösung bei 17 °C und beginnen Sie die Reaktion durch Zugabe von 10 μL 2x Startpuffer (400 mM MgCl2, 500 mM NaCl und 50 mM Tris, pH 8,3). Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentrationen aller Komponenten der Reaktion 10 μM Polymerase, 1 μM Primer, 2 μM Template, je 10 μM Trinukleotid 5′-Triphosphat, 200 mMMgCl 2, 250 mM NaCl und 50 mM Tris, pH 8,3 betragen.
  3. Während die Reaktion fortschreitet, nehmen Sie 10 μL Aliquots und löschen Sie mit 5 μL von 0,5 M EDTA, pH 8.
  4. Zu jeder abgeschreckten Reaktionsprobe werden 0,1 mg Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen (20 pmol Biotin-Oligonukleotid-Bindungskapazität) zugegeben, die in 10 μL 1 M NaCl in TE-Puffer mit 0,05% neutralem Reinigungsmittel suspendiert sind, um trimerverlängerte Primer über die biotinylierte Vorlage einzufangen und 30 min bei Raumtemperatur mit Schütteln zu inkubieren.
  5. Fangen Sie die Perlen auf einem Perleneinfangmagneten auf, entfernen und entsorgen Sie die Flüssigkeit und fügen Sie 50 μL Waschlösung hinzu (250 mM NaCl in TE mit 0,05% neutralem Reinigungsmittel). Mischen Sie die Perlen, fangen Sie sie erneut auf und entfernen Sie die Waschlösung. Wiederholen Sie den Vorgang.
  6. Um verlängerte Primer aus Perlen zu eluieren, fügen Sie 50 μL Elutionslösung (25 mM NaOH mit 0,05% neutralem Reinigungsmittel) hinzu und mischen Sie die Perlen. Die Perlen wieder einfangen, die Elutionslösung entfernen, mit 100 mM Tris (pH 7,5) abschrecken und mit Ethanol ausfallen.
  7. Bereiten Sie ein analytisches Polyacrylamid / 8 M Harnstoff / 1x FSME-Gel gemäß den entsprechenden Protokollen für die Gelplatte und den Ständer vor. Montieren Sie das gegossene Gel und die Platte in einem Gelständer, füllen Sie die Behälter mit 1x FSME und führen Sie sie bei 40 W (oder gegebenenfalls für verschiedene Gelplatten und Ständer) für 30 min vor.
  8. Die ausgefällte RNA wird in 10 μL Formamid-Gel-Belastungspuffer aufgelöst und ein nicht umgesetzter endmarkierter Primer bei 0,5 μM im Formamidgel-Belastungspuffer hergestellt. Erhitzen Sie die Proben auf 80 °C, laden Sie 5 μL der Probe in jede Vertiefung und lassen Sie das Gel bei 40 W für ca. 40 min (oder je nach Bedarf für verschiedene Gelplatten und Ständer) laufen.
  9. Entfernen Sie die Gelplatte aus dem Ständer und scannen Sie mit einem fluoreszierenden / phosphoreszierenden Gelscanner, um kreuzchirale L-RNA-Extensionsprodukte zu visualisieren.

Representative Results

Oligonukleotide sollten unter Verwendung von Standardprotokollen synthetisiert werden, die für die Phosphoramidite und den automatisierten DNA/RNA-Synthesizer geeignet sind, wobei das Produktoligonukleotid von der festen Stütze in der ursprünglichen Kunststoffsynthesesäule entfernt wird, wobei die 5ʹ-terminale Dimethoxytritylgruppe entfernt wird, um das freie 5ʹ-Hydroxyl zu erhalten (Abschnitt 1). Alle in dieser Demonstration verwendeten Oligonukleotide wurden unter Verwendung von 1.000 Å kontrolliertem Porenglasharz (CPG) als festem Träger hergestellt und auf der 0,2- oder 1-μmol-Skala durchgeführt. Repräsentative Beispiele für Synthesizersäulen, Harze, Reagenzien und Phosphoramidite finden Sie in der Materialtabelle. Bei Reaktionen größeren Maßstabs müssen möglicherweise Volumina und Zeiten, die in nachfolgenden Schritten verwendet werden, angepasst werden.

Die Triphosphorylierungsreaktion wird in einer speziell angefertigten Reaktionskammer (Abbildung 2, Abschnitt 3) unter Verwendung von handelsüblichen Standardkomponenten, die in der Materialtabelle aufgeführt sind, durchgeführt und folgt dem in Abbildung 1 (Abschnitt 4) 28 dargestellten Schema. Es ist wichtig, dass die Bedingungen während der Triphosphorylierung streng wasserfrei gehalten werden und dass alle Lösungsmittel und Reagenzien im Voraus über Molekularsieben hergestellt und vor der Verwendung vollständig getrocknet werden (Abschnitt 2). Die Triphosphorylierung dauert in der Regel 2 Stunden, und danach kann die gewaschene und getrocknete Säule gemäß den Standardverfahren zur Deprotektion und Reinigung von Oligonukleotiden behandelt werden (Abschnitt 5).

Nach der Deprotektion werden Oligonukleotidtriphosphate durch Denaturierung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigt, wobei durch UV-Rückschatten, die aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert werden können, ein einziges Hauptproduktband gezeigt wird. Das 5′-Triphosphat-Produkt lässt sich leicht von reaktionsseitigen Produkten für kurze Oligonukleotide trennen, wie für DNA-Trinukleotid-5'-Triphosphate, pppAAA und pppCCC und L-RNA-Trinukleotid 5ʹ-triphosphat pppGAA in Abbildung 3A,B gezeigt. Sowohl die 5′-Hydroxyl- als auch die 5′-Triphosphat-Produkte für AAA- und CCC-DNA-Trimer wurden massenspektrometrie ausgeschnitten und identifiziert und in Abbildung 3A entsprechend markiert. Zusätzliche Banden, wie sie für das AAA-DNA-Trimer sichtbar sind, enthalten im Allgemeinen nicht genügend Material, um sich zu erholen und zu identifizieren. Das Vorhandensein dieser Banden korreliert jedoch mit zusätzlichen Produktmassen in den ungereinigten Reaktionsprodukten (Abbildung 3C), die typischerweise 5′-Diphosphat-, Monophosphat- und H-Phosphonat-Nebenprodukte darstellen, wie unten erörtert.

Nach der PAGE-Reinigung können größere Oligonukleotide mit der Crush-and-Soak-Methode42 und anschließender Ethanolfällung eluiert werden. Oligonukleotide unter 15 nt können jedoch nicht effizient mit Ethanol ausgefällt werden und erfordern daher ein modifiziertes Verfahren zur Gelelution (Schritt 5.11.3). Die in der Materialtabelle aufgeführte Ausschlussspalte für Einweggrößen ist nur für die Verwendung mit Oligonukleotiden von mehr als 10 NT zugelassen. Wir haben jedoch festgestellt, dass Oligonukleotide, die so kurz wie Trimere sind, mit dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll effektiv entsalzt werden können. Dennoch wird empfohlen, beim Entsalzen kurzer Oligonukleotide (wie in den Schritten 5.6 und 5.11.3) das Säuleneluat in Fraktionen zu sammeln und Produktfraktionen durch Absorption bei 260 nm mit einem UV-Vis-Spektralphotometer zu identifizieren. Eine für kürzere Oligonukleotide optimierte Größenausschlussspalte wird in der Materialtabelle als alternative Wahl bereitgestellt. Die Endausbeute aus der Oligonukleotidsynthese im 1-μmol-Maßstab nach der Reinigung beträgt 50-300 nmol.

Die Triphosphorylierung kann durch Massenspektrometrie bestätigt werden, wobei das triphosphorylierte Produkt eine Masse von +239,94 Da größer als das 5′-Hydroxyloligonukleotid aufweist, obwohl häufig das Vorhandensein von Materialien beobachtet wird, die dem 5′-Di- und Monophosphat (+159,96 bzw. +79,98 Da) entsprechen. Ein 5′-H-phosphonat-Nebenprodukt mit einer Masse von +63,98 Da aus der 5′-OH-Masse kann ebenfalls beobachtet werden, und hohe Konzentrationen dieses Produkts deuten darauf hin, dass die Bedingungen während der Triphosphorylierung nicht ausreichend wasserfrei waren. Vor der Reinigung zeigen degeschützte Oligonukleotide typischerweise alle diese Produkte (Abbildung 3C), während gereinigtes Material einen Peak aufweist, der dem 5′-Triphosphatprodukt zusammen mit 5′-Di- und Monophosphaten entspricht (Abbildung 3D,E).

Die Massenspektrometrie allein ergibt aufgrund der unterschiedlichen Ionisationsraten und der Fragmentierung des Triphosphats während der Ionisation typischerweise kein strenges Maß für die Reinheit von 5′-Triphosphat. Zur Messung der Reinheit des Endprodukts werden die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und das Tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS) empfohlen, insbesondere bei längeren Oligonukleotiden. Die Analyse der D-RNA 5ʹ-Triphosphate pppACGAGG und pppGAGACCGCAACUUA mittels RP-LC/ESI-MS (Abbildung 4A,B) zeigt eine typische Endproduktreinheit, die 20% 5ʹ-Diphosphat enthält, da diese beiden Spezies schwer zu trennen sind, wenn sie auf längeren Oligonukleotiden vorhanden sind.

Synthetische 5′-Triphosphat-Oligonukleotide funktionieren typischerweise genauso gut oder besser als Materialien, die in biochemischen Studien enzymatisch hergestellt werden. In Abschnitt 6 wurden beispielsweise 5′-Triphosphat-14-nt-RNA-Substrate, die entweder synthetisch oder durch In-vitro-Transkription hergestellt wurden, in einer RNA-katalysierten Selbstreplikationsreaktion 14,15,43,44,45 verglichen. Ribozym E katalysiert die Verbindung der Substrate A und B, um eine neue Kopie von E in einer autokatalytischen Reaktion zu erhalten, die exponentielles Wachstum ermöglicht (Abbildung 5A). E- und 32P-markierte A-Komponenten wurden durch In-vitro-Transkription hergestellt, und triphosphoryliertes Substrat B wurde entweder synthetisch, wie oben beschrieben, oder durch In-vitro-Transkription 14 hergestellt. Der Fortschritt der Selbstreplikationsreaktion wurde überwacht, indem periodische Proben entnommen wurden, die durch Denaturierung von PAGE analysiert und über einen fluoreszierenden/phosphoreszierenden Gelscanner quantifiziert wurden. Die resultierenden Daten, die zu einer logistischen Wachstumsfunktion passen, zeigten, dass entweder transkribiertes oder synthetisches B-Substrat exponentielles Wachstum unterstützt, aber synthetisches B eine etwas größere Menge an Produkt liefert (Abbildung 5B). Dieses Ergebnis könnte die Heterogenität der Zusammensetzung am 5'-Ende der durch In-vitro-Transkription hergestellten RNA widerspiegeln23,24.

Die chemische Triphosphorylierung ermöglicht auch die Synthese von Oligonukleotidtriphosphaten, die weder in vitro noch in Zellen biologisch hergestellt werden können. In Abschnitt 7 wurden nichtbiologische Oligonukleotidtriphosphate aus L-RNA, dem Enantiomer der natürlichen D-RNA, hergestellt wie in den Abschnitten 1-5, als Substrate für die D-RNA "cross-chirale" Polymerase-Ribozyme 27.3t verwendet (Abbildung 6A), die die vorlagengerichtete Polymerisation eines längeren L-RNA-Produkts aus kurzen L-RNA-Oligonukleotid-5′-Triphosphaten in sequenzallgemeiner Weise katalysiert. Beispielsweise kann das Ribozym eine L-RNA-Version des Hammerkopf-Selbstspaltungsmotivs synthetisieren (Abbildung 6B)18. Gereinigte L-RNA-Trinukleotidtriphosphate wurden mit einem Fluorescein-markierten L-RNA-Primer und L-RNA-Template kombiniert (Abbildung 6C) und mit der kreuzchiralen Ligase reagiert. Die Proben im Verlauf der Reaktion wurden von PAGE analysiert und mit einem fluoreszierenden/phosphoreszierenden Gelscanner abgebildet, um die Synthese einer L-RNA-Version des von der Vorlage kodierten Hammerkopf-Ribozyms zu demonstrieren (Abbildung 6D).

Figure 3
Abbildung 3: Reinigung von Trinukleotid-5ʹ-triphosphaten. (A) PAGE-Analyse (visualisiert durch UV-Rückschatten) der Triphosphorylierung der DNA-Trinukleotide Tri-Desoxyadenosin (AAA, blau) und Tridesoxycytidin (CCC, rot), absichtlich überladen, um kleinere Nebenprodukte sichtbar zu machen. Sowohl das 5'-Triphosphat-Produkt (ppp) als auch das 5ʹ-hydroxyl (OH)-Ausgangsmaterial wurden von MALDI-MS herausgeschnitten und identifiziert. (B) Präparative PAGE der Triphosphorylierung von L-RNA-Trinukleotid GAA, wobei die Hauptproduktbande ausgeschnitten und von ESI-MS als 5ʹ-Triphosphat (ppp) identifiziert wurde. (C) MALDI-MS von rohen Reaktionsprodukten nach Deprotection und (D) gereinigte Produkte von (A). 5ʹ-Triphosphat (ppp; pppAAA erwartet 1.119 Da, beobachtet 1.118 Da; pppCCC erwartet 1.047 Da, beobachtet 1.046); 5ʹ-diphosphat (pp), 5ʹ-monophosphat (p), 5ʹ-hydroxyl (OH) und 5ʹ-H-phosphonat (Hp) sind gekennzeichnet. (E) Dekonvolutes Massenspektrum aus ESI-MS mit Direktinjektion von isoliertem 5ʹ-Triphosphat-Produkt aus (B), wobei identifizierte Peaks markiert sind (erwartete 1 181,6 Da, beobachtet 1 181,0 Da). 5'-Diphosphat (pp)-Produkte werden ebenso beobachtet wie Natriumionenpeaks sowohl für die Tri- als auch für die Diphosphatprodukte (+22 Da). Häufige Schadstoffspitzen sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Zur Vereinfachung des Vergleichs wurden Massenspektren auf die höchste in jedem Spektrum gemessene Intensität normalisiert und als Prozentsatz relativ zu diesem Wert angegeben. Abkürzungen: PAGE = Polyacrylamid-Gelelektrophorese; MALDI-MS = matrixgestützte Laserdesorption/-ionisation; ESI-MS = Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Analytisches RP-LC von 6 nt und 14 nt D-RNA Oligonukleotidtriphosphaten . (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ und (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3'. Tandem ESI-MS identifizierte den Hauptpeak beider (~ 70%) als 5ʹ-Triphosphat (ppp), mit geringeren Mengen des 5ʹ-Diphosphats (pp). Abkürzungen: RP-LC = Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie; nt = Nukleotide; ESI-MS = Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Vergleich von Oligonukleotid-5'-triphosphat-Substraten, die durch chemische Synthese oder In-vitro-Transkription hergestellt wurden . (A) Das selbstreplizierende Ribozym E ligiert RNA A und 5′-triphosphorylierte RNA B. (B) Vergleich von Selbstreplikationsreaktionen unter Verwendung von 10 μM A und 10 μM B, entweder synthetisch (offene Kreise) oder in vitro transkribiert (gefüllte Kreise). (B) Die Daten wurden an die logistische Wachstumsgleichung angepasst: [E] = a / (1 + b e-ct), wobei a der Endertrag, bder Grad der Sigmoidizität und c die exponentielle Wachstumsrate ist. Die Wachstumsraten für die beiden Reaktionen waren mit 1,14 h-1 identisch, während das endgültige Ausmaß für Reaktionen mit synthetischem B um 10% höher war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Kreuzchirale L-RNA-Polymerisation mit einem Ribozym. (A) Das D-RNA 27.3t Polymerase-Ribozym, das die vorlagenabhängige Ligation der L-RNA katalysiert. (B) Das durch 27,3 t synthetisierte L-RNA-Produkt ist Teil eines Hammerkopf-Endonuklease-Motivs. (C) L-RNA-Polymerisation, katalysiert durch 27,3 t unter Verwendung einer biotinylierten L-RNA-Vorlage (braun), eines endmarkierten L-RNA-Primers (Magenta) und vier synthetisch hergestellten L-RNA-Trinukleotidtriphosphaten (Cyan). (D) PAGE-Analyse von Erweiterungsprodukten von (B) bei 4 h und 24 h, wobei jeder Trinukleotideinbau bis zum Produkt in voller Länge (schwarzer Punkt) gezeigt wird. Nicht umgesetzter L-RNA-Primer ist als Referenzmarker enthalten. Abkürzungen: PAGE = Polyacrylamid-Gelelektrophorese; M = Referenzmarker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Das hier beschriebene Triphosphorylierungsverfahren ist weitgehend kompatibel mit der Oligonukleotidsynthese unter Verwendung der Standard-Phosphoramid-Chemie. Nukleosidphosphoramidite sollten basenlabile Schutzgruppen aufweisen, die mit einer schnellen Deprotektion in AMA39 kompatibel sind, einschließlich der Standard-β-Cyanoethyl auf dem Phosphit und Isobutyryl-, Dimethylformamidyl-, Acetyl-, Phenoxyacetyl- oder 4-Isopropylphenoxyacetylgruppen auf den exocyclischen Aminen der Nukleobasen. Ribose-2'-Hydroxylgruppen sollten durch Silylschutzgruppen geschützt werden, entweder t-Butyldimethylsilyl (TBDMS) oder Tri-iso-Propylsilyloxymethyl (TOM)40,41. Es wurde auch berichtet, dass die basenlabile Pivaloyloxymethylgruppe (PivOM) mit der chemischen Triphosphorylierung30 kompatibel ist.

Für die chemische Triphosphorylierung von synthetischen Oligonukleotiden 28,29,30,31,32,33,34,35 wurden mehrere Verfahren beschrieben. Wir haben festgestellt, dass die Triphosphorylierung mit dem Ludwig-Eckstein-Reagenz37 eine der zugänglichsten ist, die keine spezielle Synthese von Reagenzien und keine spezielle Ausrüstung erfordert. Oligonukleotid-5′-Triphosphate, die nach dieser Methode hergestellt wurden, wurden routinemäßig als Substrate für RNA-Ligase-Ribozyme verwendet, einschließlich der Verwendung von enzymatisch unzugänglichen L-RNA-Oligonukleotidtriphosphaten, um eine vorlagenabhängige Synthese und Replikation dieser "spiegelbildlichen" Nukleinsäurezu erreichen 14,16,17,18 . Die Methode eignet sich auch zur Herstellung von kleinen 5′-triphosphorylierten Stammschleifen-RNAs, die potente Aktivatoren der angeborenen Immunantwort bei Wirbeltierensind 6,7.

Das Ludwig-Eckstein-Reagenz, Salicylphosphorochloridit37, ist sehr reaktiv gegen Wasser und fängt effektiv jegliches Wasser ab, das beim Auflösen des Reagenzes vor dem Laden auf die Oligonukleotidsäule eingeführt wird. Nach diesem Punkt reagiert das 5′-phosphitylierte Oligonukleotid jedoch bevorzugt mit jeglichem Wasser, das über Pyrophosphat in das System eingeführt wird, und bildet nach Aufarbeitung 28,37,38 ein 5′-H-Phosphonat-Nebenprodukt. Die sorgfältige Herstellung von Triphosphorylierungsreagenzien und die Triphosphorylierungsreaktionskammer stellen sicher, dass dieses Nebenprodukt nicht gebildet wird. Für die Lösungsmitteltrocknung werden Molekularsiebe vom Typ 4 Å in Teflonbeuteln, die mit den meisten organischen Lösungsmitteln kompatibel sind, unter verschiedenen Markennamen von den meisten Oligonukleotidsynthese-Reagenzienunternehmen vorverpackt verkauft. Zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen, wie die Durchführung einer Triphosphorylierung in einem Handschuhfach unter wasserfreier Atmosphäre, sind in der Regel nicht erforderlich.

Die Reaktion des 5′-phosphitylierten Oligonukleotids mit TBAP bildet ein cyclisches 5′-Trimetaphosphitphit-Zwischenprodukt, das dann unter Verwendung einer Oligonukleotidsynthese-Oxidationslösung (Jod in Wasser/Pyridin/THF) zu dem cyclischen 5′-Trimetaphosphat oxidiert wird. Es sollte beachtet werden, dass kommerzielle Oxidationslösungen unterschiedliche Mengen an Jod verwenden, und es ist wichtig, die hohe Jodkonzentration von 0,1 M zu verwenden, um eine vollständige Oxidation des Triphosphats zu gewährleisten. Das cyclische Produkt wird in derselben Lösung37 zu dem endgültigen linearen 5′-Triphosphat hydrolysiert, und es müssen alternative, wasserfreie Oxidationslösungen verwendet werden, wenn eine Linearisierung mit anderen Nukleophilen als Wasser gewünscht ist (Anwendungen siehe unten)33. Jedes verbleibende cyclische Trimetaphosphat wird jedoch während der anschließenden alkalischen Deprotektion des Oligonukleotids linearisiert. Die Hydrolyse des cyclischen 5′-Trimetaphosphats ergibt nur das lineare und nicht das verzweigte Triphosphat 37,46.

Der Oligonukleotid-Deschutz muss in der Regel nicht modifiziert werden, um eine 5′-Triphosphorylierung aufzunehmen, aber es sollten einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Das Triphosphat ist relativ stabil gegenüber einer kurzen Exposition gegenüber alkalischen Bedingungen, aber es sollte darauf geachtet werden, dass das Triphosphat nicht länger als nötig AMA ausgesetzt wird. Der Schutz von Gruppen, die eine längere Behandlung in Ammoniak oder AMA für mehr als 10 Minuten bei 65 ° C benötigen, sollte vermieden werden. Schonendere Behandlungen, wie 2 h in Ammoniak bei Raumtemperatur, sind akzeptabel, wenn sie mit anderen Phosphoramidit-Schutzgruppen kompatibel sind. Eine gängige, schnelle Detektionsmethode für Silyl-geschützte synthetische RNA-Oligonukleotide verwendet Triethylamintrihydrofluorid und Hochtemperatur47; Dies sollte jedoch bei der Herstellung von RNA 5′-Triphosphaten vermieden werden, da die anhaltenden sauren Bedingungen die Triphosphathydrolyse31,32 beschleunigen.

Preparative PAGE hat sich als die einfachste und zuverlässigste Methode zur Nachreinigung von 5′-triphosphorylierten Oligonukleotiden erwiesen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Die präparative Umkehrphasen-HPLC kann jedoch auch zur Reinigung von triphosphorylierten Produkten eingesetzt werden. Das Vorhandensein von 5′-Diphosphat und, in geringerem Maße, 5′-Monophosphat-Produkten wird routinemäßig beobachtet, wenn die Triphosphorylierung durch Massenspektrometrie nachgewiesen wird. Wir haben eine 5′-Triphosphatfragmentierung während der Massenspektrometrie aus hochreinem Material beobachtet, das durch chemische Synthese oder Transkription hergestellt wurde, insbesondere wenn das Instrument nicht für die Analyse von Oligonukleotiden optimiert ist. Dennoch zeigt die RP-LC-Analyse häufig, dass 10%-20% des 5′-Diphosphat-Nebenprodukts in längeren 5′-triphosphorylierten Oligonukleotiden vorhanden sind (Abbildung 4). Kommerzielle Zubereitungen von Tributylammoniumpyrophosphat können mit bis zu 20% Monophosphat kontaminiert werden, was bei der Triphosphorylierung 5′-Diphosphat als Nebenproduktergibt 30,31. Eine sorgfältige Vorbereitung dieses Reagenzes im eigenen Haus kann viel mehr reine TBAP-Beständeergeben 31. Wir haben jedoch festgestellt, dass Oligonukleotide, die mit kommerziellen TBAP-Quellen triphosphoryliert wurden, immer noch eine vergleichbare oder größere Reaktivität aufweisen, wenn sie als Substrate in enzymatischen Reaktionen verwendet werden (Abbildung 5B), verglichen mit Material, das durch In-vitro-Transkription hergestellt wurde.

Eine bemerkenswerte weitere Verwendung der Oligonukleotid-Triphosphorylierung mit dem Ludwig-Eckstein-Reagenz nutzt das cyclische Trimetaphosphit-Zwischenprodukt33. Wird der anschließende Oxidationsschritt mit 1 M t-Butylperoxid in Hexanen durchgeführt, das häufig zur Oligonukleotidoxidation unter wasserfreien Bedingungen verwendet wird, erfolgt die Oxidation des Phosphits ohne Ringöffnungshydrolyse, wodurch das cyclische Trimetaphosphat entsteht. Dieses Zwischenprodukt kann dann mit primären Amin- oder Alkoholnukleophilen umgesetzt werden, um 5′-Triphosphate mit Modifikationen am γ-Phosphat zu erhalten. Zu diesen Modifikationen gehört die Zugabe eines lipophilen Tags, der durch eine Phosphoramidatbindung verbunden ist, was eine schnelle triphosphatspezifische Reinigung durch RP-LC ermöglicht, gefolgt von einer sauren Hydrolyse des Tags aus dem Triphosphat33. Fluoreszierende Modifikationen an der γ-Phosphat-Position können auch für den Einsatz als Echtzeit-Fluoreszenzreporter für Ribozym-katalysierte Ligationsreaktioneneingeführt werden 15,33.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski und Katrina Tjhung für nützliche Diskussionen über Best Practices für chemische Triphosphorylierungsreaktionen und Gerald Joyce für hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium MCB 2114588 der National Science Foundation unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm polyethersulfone syringe filter MilliporeSigma SLMP025SS Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5)
0.22 µm PTFE syringe filter MilliporeSigma SLLG013SL Syringe filter for removing CPG resin (Section 5)
1 mL plastic syringes ThermoFisher Scientific 14-823-434 (BD 309659) Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
1,4-Dioxane, anhydrous MilliporeSigma 296309 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) MilliporeSigma 324124 Triphosphorylation reagent (sections 2–4)
30 mL glass bottles MilliporeSigma 23232 Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2)
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene Bio-Rad Laboratories 7328103 Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 Bio-Rad Laboratories 1610144 For PAGE (sections 5–7)
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL Glen Research 40-4050-50 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
Ammonia-neutralizing Trap ThermoFisher Scientific ANT100 and ANS121 For use with Speedvac DNA130 (section 5)
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad Laboratories 1610700 For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7)
Aqueous ammonia, 28% MilliporeSigma 338818 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Aqueous methylamine, 40% TCI America TCI-M0137 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer any column-based synthesizer is acceptable (section 1)
Bead-capture magnet ThermoFisher Scientific 12320D For streptavidin bead capture (section 7)
Bromophenol blue Bio-Rad Laboratories 1610404 For PAGE urea loading buffer (section 5)
Deep vacuum oil pump ThermoFisher Scientific VLP200-115 For use with lyophilizer (section 5)
Drierite dessicant, 10-20 mesh MilliporeSigma 737828 Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2)
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase prepared in house18 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns Glen Research 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
D-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes ANP-3201, 3202, 3203, 3205 representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm Glen Research 20-0021-01 Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1)
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid MilliporeSigma E1894 Ribozyme reaction buffer component (section 6)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid MilliporeSigma EDS Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7)
Filters for Expedite synthesis columns Glen Research 20-0021-0F Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1)
Fluorescent/phosphorescent gel scanner Cytiva Amersham Typhoon RGB, 29187193 For visualizing analytical PAGE (sections 6–7)
Formamide, deionized VWR Life Science 97062 For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7)
Gel image quantitation software Cytiva ImageQuant TL For quantifying scanned gel images (section 6)
Glass desiccator MilliporeSigma CLS3121150 Triphosphorylation solvent storage (section 2)
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk ChemGenes N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
L-RNA hammerhead template prepared in house18 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA primer prepared in house18 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Lyophilizer/Freeze Dryer VirTis Benchtop K For concentrating oligonucleotides (section 5)
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid MilliporeSigma M2670 For ribozyme reactions (sections 6–7)
N,N-Dimethylformamide, anhydrous MilliporeSigma 227056 Triphosphorylation solvent (section 2)
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) ThermoFisher Scientific 45000150 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5)
Non-coring stainless steel needle, 20 G ThermoFisher Scientific 14-815-410 Needles for piercing rubber septa (sections 2–4)
Oligonucleotide extinction coefficient calculator Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5)
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water ChemGenes RN-1456 Triphosphorylation reagent (section 4)
PAGE plates Timberrock/CBS NGP-250-BO and NO For PAGE (sections 5–7)
PAGE power supply Bio-Rad Laboratories PowerPac HV 1645056 For PAGE (sections 5–7)
PAGE spacers and combs (analytical) Timberrock/CBS VGS-0725 and VGC-0714 For PAGE (sections 6–7)
PAGE spacers and combs (preparative) Timberrock/CBS VGS-3025R and VGC-3001 For PAGE (section 5)
PAGE stand Timberrock/CBS ASG-250 For PAGE (sections 5–7)
Parafilm M ThermoFisher Scientific 13-374-12 (Bemis PM999) Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
PCR thermocycler Bio-Rad Laboratories C1000 Touch Thermalcycler For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) MilliporeSigma GE17-0010-01 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5)
Phosphor screens Cytiva 28956480 For visualizing 32P-labeled RNA (section 6)
Phosphoramidite synthesis reagents Glen Research 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1)
Polypropylene screw-cap sealable tube MilliporeSigma BR780752 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5)
Pyridine, anhydrous MilliporeSigma 270970 Triphosphorylation solvent (section 2)
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) Novatia n/a Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5)
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white MilliporeSigma Z564702 Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2)
Self-replicator ribozyme E prepared in house14 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate A prepared in house14 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate B, transcribed prepared in house14 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves ChemGenes DMT-1975 Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2)
Sodium Chloride (NaCl), solid MilliporeSigma S7653 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Sodium Hydroxide (NaOH), solid MilliporeSigma S8045 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Statistical data-fitting software GraphPad Prism For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6)
Streptavidin-coated magnetic beads ThermoFisher Scientific 65002 For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
Sucrose MilliporeSigma 84097 For PAGE urea loading buffer (section 5)
TBE running buffer, 10x ThermoFisher Scientific AAJ62788K3 For PAGE (sections 5–7)
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran Aldrich 216143 For removing 2′-silyl protecting groups (section 5)
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad Laboratories 1610801 For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7)
Tributylamine MilliporeSigma 90781 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) MilliporeSigma P8533 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tris base MilliporeSigma T6666 Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7)
TWEEN20 polysorbate detergent MilliporeSigma P7949 Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7)
Urea MilliporeSigma U5378 For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7)
UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000, ND2000 For measuring oligonucleotide concentrations (section 5)
Vacuum centrifuge ThermoFisher Scientific Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator For removing AMA and THF (section 5)
Xylene cyanol Bio-Rad Laboratories 1610423 For PAGE urea loading buffer (section 5)

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Bioengineering Ausgabe 184
Chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden
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