Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63877
Automatic Translation
1, 1
1The Salk Institute

Summary

Oligonükleotid 5′-trifosfatlar, esansiyel biyolojik yollarda her yerde bulunan bileşenlerdir ve biyoteknoloji uygulamalarında artan kullanım görmüştür. Burada, standart otomatik sentez teknikleriyle hazırlanan oligonükleotidlerden başlayarak oligonükleotid 5′-trifosfatların rutin sentezi ve saflaştırılması için teknikleri açıklıyoruz.

Abstract

5′-trifosfat, tüm yaşam boyunca bulunan ve biyoteknoloji ve sentetik biyolojide oligonükleotidlerin fonksiyonel bir modifikasyonu olarak giderek daha fazla kullanılan temel bir nükleik asit modifikasyonudur. Oligonükleotid 5′-trifosfatlar tarihsel olarak enzimatik yöntemlerle in vitro olarak hazırlanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler doğal RNA oligonükleotidleri ile sınırlıdır, güçlü sekans tercihlerine sahiptir ve heterojen ürünler üretme eğilimindedir. Yeni kimyasal trifosforilasyon yöntemleri, hem fosforamid kimyası ile otomatik oligonükleotid sentezinin azaltılmış maliyetini hem de şu anda mevcut olan çeşitli nükleotid modifikasyonlarını tamamlamaktadır. Böylece, keyfi dizi ve uzunluktaki oligonükleotid trifosfatların sentezi ve isteğe bağlı olarak çeşitli doğal olmayan modifikasyonlar içermesi artık erişilebilirdir.

Bu yazıda oligonükleotidlerin salisil fosforokloridit ve pirofosfat kullanılarak kimyasal trifosforilasyonu için uygun yöntem ve teknikler sunulmaktadır. Bu yöntem, ticari olarak temin edilebilen reaktifleri kullanır, standart katı faz sentez yöntemleriyle hazırlanan çoğu oligonükleotid ile uyumludur ve oligonükleotid sentezini takiben, korumadan ve saflaştırmadan önce 2 saat içinde tamamlanabilir. Katalitik RNA enzimleri için substratlar olarak kimyasal olarak trifosforile oligonükleotidlerin iki kullanımı, biyolojik olmayan L-RNA trifosfatlardan çekiç başlı ribozimin ayna görüntüsü versiyonunun sentezi de dahil olmak üzere gösterilmiştir.

Introduction

RNA'nın 5'-trifosforile formu, yaşamın tüm alanlarında RNA transkripsiyonu ve birçok RNA virüsünün yaşam döngüsü boyunca RNA replikasyonu ile üretildiği için biyolojide her yerde bulunur. Bu trifosfatlar, ökaryotlarda 7-metilguanlatla kaplı mRNA oluşumu için substrat görevi görür ve bu nedenle protein ekspresyonu1'de önemli bir rol oynar. Buna karşılık, trifosfat bakteri ve virüslerde tutulur; Böylece, RNA 5′-trifosfatlar, ökaryotlardaki doğuştan gelen bağışıklık yanıtı düzenleyicileri tarafındantanınır 2,3,4,5,6,7. Biyolojinin dışında, 5'-trifosfat in vitro8'i kullanmak için bir dizi RNA ligaz ribozimi evrimleştirildi ve 9,10,11,12,13,14,15 tanısal tahlillerinde kullanılmak üzere modifiye edildi. Böyle bir ribozim, doğal D-RNA'nın biyolojik olmayan "ayna görüntüsü" enantiyomeri olan L-RNA'nın şablona bağımlı sentezi için, küçük L-RNA oligonükleotid 5′-trifosfatlardan 16,17,18 için kullanılabilir. Farklı sekanslara ve omurga kompozisyonuna sahip trifosforile oligonükleotidlerin rutin olarak hazırlanması, bu sistemlerin araştırılması için esastır.

Laboratuvarda RNA 5′-trifosfatların hazırlanmasında en yaygın ve erişilebilir yöntem in vitro transkripsiyondur. Bununla birlikte, bu yöntemle üretilen RNA, RNA polimeraz enziminin promotör ve substrat gereksinimleri ile sıra ve boyut olarak sınırlandırılmıştır. T7 RNA polimeraz ve özel türevleri bu amaçla kullanılan en yaygın polimerazlardır 19,20,21,22. Bu enzimlerle hazırlanan in vitro transkribe RNA, 5'-terminal pürin ile başlatılmalıdır ve ilk 10 nükleotid23,24'teki pürinlere karşı güçlü bir şekilde önyargılıdır. Dahası, baz veya omurga modifiye nükleotidlerin enzimatik olarak dahil edilmesi, doğal polimerazlarla en iyi ihtimalle verimsiz ve daha sık imkansızdır, bu da doğal D-RNA'dan başka herhangi bir şeyden oluşan oligonükleotid 5'-trifosfatlar üretme fırsatını sınırlar. Diğer bir sınırlayıcı faktör, in vitro transkripsiyon ile üretilen RNA'nın önemli miktarda 5 ve 3 - heterojenlik içerebilmesi ve 20 nt 23,24,25,26,27'den kısa olduğunda aşırı heterojen ürünler olarak üretilmesidir.

Buna karşılık, katı faz fosforamid sentezi 28,29,30,31,32,33,34,35 tarafından hazırlanan oligonükleotidlerin kimyasal trifosforilasyonu, herhangi bir dizinin 3-50 nt uzunluğundaki oligonükleotid 5′-trifosfatları hazırlamak için kullanılabilir. Ek olarak, fosforamid sentezine erişilebilen çok çeşitli nükleik asit modifikasyonları, 5′-trifosforilasyon 14,15,16,17,18,29,36'dan önce oligonükleotidlere eklenebilir. Bu yöntemlerin çoğu, Ludwig ve Eckstein tarafından mononükleozitlerin çözelti fazı trifosforilasyonu için geliştirilen fosfitilasyon reaktifi salisil fosforokloriditi kullanır37. Oligonükleotidlerin bu reaktif ile trifosforilasyonu, oligonükleotid 5′-hidroksilin fosfitilasyonu, pirofosfat ve oksidasyon ile reaksiyona sokularak trifosfata dönüştürülmesi, ardından oligonükleotidin katı destekten ayrılması, deproteksiyonu ve saflaştırılması için standart prosedürler ile katı fazda elde edilir (Şekil 1)28.

Figure 1
Şekil 1: Sentetik oligonükleotidlerin trifosforilasyonu için şema. İlk adımda, oligonükleotid 5ʹ-hidroksil, SalPCl ile fosfitile edilir. Bir sonraki adımda, 5ʹ-salisil fosfit, siklik metafosfiti oluşturmak için TBAP ile reaksiyona sokuldu, daha sonra üçüncü adımda, aynı çözelti 28,33'te doğrusal 5ʹ-trifosfatı vermek için hızla hidrolize edilen DNA / RNA sentezleyici oksidasyon çözeltisinde (0.1 M İyot / piridin / H 2 O / THF) siklik 5ʹ-trimetafosfat üretmek için oksitlendi, 37. Sulu MeNH2 / amonyaktaki katı CPG desteğinden sonraki alkali bölünme ve oligonükleotidin korunmasının azaltılması, herhangi bir kalıntı siklik trimetafosfatı doğrusal forma hidrolize edecektir. Kısaltmalar: SalPCl = salisil fosforokloridit; TBAP = tributylammonium pyrophosphate; THF = tetrahidrofuran; CPG = kontrollü gözenekli cam; MeNH2 = metilamin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu yöntemi kullanan erken yayınlanmış raporlar genellikle düşük verimlerden ve istenmeyen yan ürünlerden muzdarip olsa da28,37,38, susuz koşulların dikkatli bir şekilde korunması, rutin olarak yüksek verim elde etmek için gerekli olan tek şeydir. Bu, reaktiflerin dikkatli bir şekilde hazırlanması ve standart plastik bileşenlerden monte edilmiş basit bir reaksiyon cihazının kullanılmasıyla sağlanabilir. Burada, reaktiflerin hazırlanması, reaksiyon odasının montajı, trifosforilasyon reaksiyonu ve daha sonra trifosforile oligonükleotidlerin korunmasının azaltılması ve saflaştırılması dahil olmak üzere oligonükleotidlerin kimyasal trifosforilasyonu için uygun adımları gösteriyoruz. Ayrıca, doğal D-RNA ve abiyotik L-RNA omurgaları ile daha büyük nükleik asit ürünlerinin sentezi için ligaz ribozimleri için substratlar olarak 5'-trifosforile oligonükleotidlerin temsili kullanımı da dahildir.

Protocol

1. Katı bir destek üzerinde 5'-hidroksil oligonükleotidlerin otomatik katı faz sentezi

  1. Hedef oligonükleotid bileşimine ve cihaz talimatlarına göre reaktifler ve fosforamiditlerle otomatik DNA / RNA sentezleyicisini hazırlayın.
  2. Sentezleyici üzerine katı destek içeren bir sentez sütunu yükleyin ve sentezleyici cihaz protokollerine göre oligonükleotidleri sentezleyin.
    NOT: Trifosforilasyon prosedürü, 1 μmol ölçeğinde hazırlanan oligonükleotidler için optimize edilmiştir.
  3. Önceki adımda oligonükleotid sentezinin bir parçası olarak katı destekli oligonükleotid 5′-hidroksil üretmek için 5′-dimetoksitritil koruma grubunu çıkarın veya sentezleyici cihaz protokollerine göre bir terminal detritilasyon adımı gerçekleştirin.
  4. Katı destek üzerindeki 5'-hidroksil oligonükleotid içeren sütunu sentezleyiciden çıkarın, artık çözücüyü çıkarmak için 10 dakika boyunca bir ev vakumu altında kurutun ve trifosforilasyon malzemeleri hazırlandıktan sonra trifosforilasyona (bölüm 3 ve 4) devam edin (bölüm 2).
    NOT: Hemen kullanılmazsa, kurutulmuş kolon normal bir atmosfer altında, -20 °C'de kurutucu ile kapalı plastik bir kapta saklanabilir. Bu aşamada daha fazla kurumaya gerek yoktur, çünkü kolon bölüm 3'teki trifosforilasyondan önce iyice kurutulur.

2. Trifosforilasyon için malzeme hazırlama

  1. Ayarlanabilir basınca sahip kuru bir argon kaynağını en az iki hatlı bir gaz manifolduna takın ve bir kabarcığa bağlayın. Reaksiyon aparatına bağlantıyı kolaylaştırmak için hatların 1 mL plastik şırıngalarda sonlandığından emin olun.
  2. 1 mL plastik şırıngalar, üç polipropilen tapa, ilişkisiz iğneler, 1,5 mL polipropilen tüpler ve küçük bir metal spatula dahil olmak üzere trifosforilasyon sırasında kullanılacak ekipmanları toplayın. Kullanımdan en az 1 gün önce oda sıcaklığında kurutucu ile kapalı bir kapta veya kurutucuda saklayın.
  3. Kullanımdan en az 1 gün önce susuz 1,4-dioksan, 3:1 dioksan:hacimce piridin, N,N-dimetilformamid (DMF) ve asetonitrilin (ACN) her birini, kurutma kapanlı kurutulmuş 30 mL cam şişelerde (kapalı membran paketlerinde 4 şmoleküler elekler) 30 mL hazırlayın. Kauçuk septa ile kapatın ve kurutuculu bir kurutucuda saklayın.
  4. Katı 2-kloro-4H-1,3,2-benzodioksafosforin-4-one (salisil fosforokloridit, SalPCl) orijinal kabında 4 ° C'de kurutucu ile kapalı bir kavanoz içinde saklayın. Kullanımlar arasında kabı daima argon ile yıkayın.
  5. Trifosforilasyon reaksiyonundan en az 5 gün önce bir tributylammonium pyrophosphate (TBAP) çözeltisi hazırlayın:
    1. Kurutulmuş 30 mL cam şişede 1-5 g katı TBAP tartın ve TBAP başına 1 mL DMF ve 0.5 mL tributilamin içinde çözün.
    2. Üç kurutma kapanı ekleyin, şişeyi argon altında kauçuk bir septumla kapatın ve gazı gidermek için 30 dakika boyunca argon ile kabarcıklayın.
    3. Moleküler eleklerin tüm eser suyu emmesini sağlamak için 5 gün boyunca 4 ° C'de kurutucu ile kapalı bir kavanozun içinde saklayın. Kavanozu -20 ° C'de saklayın ve 6 ay sonra taze hazırlayın.

3. Trifosforilasyon aparatının montajı ve kullanılması

  1. Sentez kolonunun -20 °C'de depodan alınması durumunda oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
  2. Şekil 2'de gösterilen reaksiyon odasını monte edin:
    1. Ön odacığı hazırlayın: pistonu kuru bir 1 mL şırıngadan çıkarın, şırınganın üstünü makas veya tıraş bıçağı kullanarak kesin ve şırıngayı sentez kolonuna takın. Üç yönlü stopcock'u şırınganın üstüne takın ve stopcock'un yan girişini bubbler ile kuru argon kaynağına takın, böylece stopcock'un üst girişi reaktif enjeksiyon portu olur.
    2. Bu aparatı kelepçeli bir standa sabitleyin ve tüm yukarı akış derzlerini balmumu sızdırmazlık filmi ile kapatın. Durdurma musluğunu, enjeksiyon portu kapalı olacak ve aparat argon kaynağına açık olacak şekilde ayarlayın. Kabarcığı kapatın ve düşük basınçta (<10 psi) argon'un reaksiyon odasından 5 dakika boyunca akmasına izin verin.
      NOT: Çoklu reaksiyon odaları, trifosforilat 2-4 oligonükleotidlere paralel olarak ayarlanabilir. Bununla birlikte, manifolddan bir hat, reaktif şişelerine argon tedarik etmek için ayrılmalıdır.
    3. Kabarcığı tekrar açın ve atık şırınga olacak sentez sütununun dibine bir şırınga takın. Atık şırıngayı kullanarak argonu sütundan tekrar tekrar çekin; daha sonra, şırıngayı piston tamamen içeri itilerek yeniden takın.
      NOT: Reaktifler yüklenmediği sürece, durdurma, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, enjeksiyon portu kapalı ve aparat argon kaynağına açılacak şekilde ayarlanmalıdır. Benzer şekilde, atık şırınga bağlanmalı ve reaktifleri aktif olarak çıkarmadıkça sentez kolonuna eklem balmumu sızdırmazlık filmi ile kapatılmalıdır.
  3. Bir reaktif veya çözücü eklemek için:
    1. Kuru argon kaynağına bir iğne takın ve iğneyi şişe içeriğine batırmamaya dikkat ederek reaktif veya çözücü şişe septumuna yerleştirin.
    2. Kuru bir şırıngayı iğneyle birleştirin ve şişe içeriğine batırmadan reaktif veya çözücü şişe septumuna yerleştirin. Şırıngayı argon ile doldurun, iğneyi septumdan çekin ve argonu dışarı atın. Şırıngayı argon ile doldurun ve tekrar dışarı atın; Daha sonra, şırıngayı argon basıncı altında gerekli miktarda çözücü veya reaktif ile doldurun.
    3. Aparat üzerindeki durdurmayı, argon kaynağı kapalı olacak ve enjeksiyon portu açık olacak şekilde ayarlayın (Şekil 2B). Doldurulmuş şırıngayı ve iğneyi kaynak şişeden hızla çıkarın, iğnenin yanına veya ucuna yapışmış çözücüleri silin ve iğneyi enjeksiyon portuna yerleştirin. Reaktifi aparatın ön odasına atın, iğneyi çıkarın ve enjeksiyon portunu kapatın, aparatı argon kaynağına yeniden açın.
    4. Atık şırıngayı kullanarak sıvıyı ön odadan sentez sütunu boyunca yavaşça çekin, böylece tüm sıvı artık atık şırıngada tutulur. Şimdi, çözeltiyi yavaşça sentez sütununa geri iterek sütunda gaz kabarcığı olmadığından emin olun. Karıştırmak veya çalkalamak için, çözeltiyi atık şırınga ile sütunun üzerinde yavaşça yukarı ve aşağı çekin.
      NOT: Contaların kırılmadığından emin olmak için sıvıyı her zaman reaksiyon odasından yavaşça ve nazikçe hareket ettirin, bu da havanın aparata girmesine izin verir.
  4. Bir reaktifi veya çözücüyü sütundan çıkarmak için:
    1. Çözeltiyi yavaşça atık şırıngaya çekin. Çözeltinin büyük kısmı atık şırıngaya geçtikten sonra, kalan çözücüyü kolondan temizlemek için argon'u çekin.
    2. Atık şırınga ekleminin etrafındaki balmumu sızdırmazlık filmini çıkarın, ardından şırıngayı çıkarın ve atık çözeltisini atın. Atık şırıngayı yeni, kuru bir şırınga ile değiştirin ve eklemi balmumu sızdırmazlık filmi ile yeniden kapatın.

Figure 2
Resim 2: Trifosforilasyon aparatı. Karıştırma veya reaksiyonlar sırasında, cihaz (A) argon kaynağına (i) açıktır ve üç yönlü stopcock (ii) ayarlanarak havaya kapatılır. Reaktifler, ön odacıktan (iii) atık şırınga (v) vasıtasıyla sentez kolonuna (iv) çekilir. Reaktifler, tüm sıvıyı atık şırıngaya (v) çekerek ve atarak uzaklaştırılır. Reaktifleri (B) yüklerken, üç stopcock (ii) atmosfere açıktır ve reaktif bir şırınga ve iğne (vi) vasıtasıyla ön odaya (iii) yüklenir. (C) Reaktif karıştırma ve reaksiyona sokma için (A)'da olduğu gibi ayarlanmış monte edilmiş aparatın bir fotoğrafı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Sentetik 5'-hidroksil oligonükleotidin kolon üstü trifosforilasyonu

  1. SalPCl ve TBAP çözeltisini -20 ° C'de depolamadan çıkarın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına ısınmalarını bekleyin.
  2. 3.3.1-3.3.3 adımlarına göre ön odaya 200 μL piridin / dioksan ekleyin. Bununla birlikte, 4.4. adıma kadar çözücüyü sentez kolonuna yüklemeyin.
  3. 6-12 mg SalPCl'yi kuru bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne tartmak için kuru bir metal spatula kullanın ve çözücüyü mikrosantrifüj tüpü içinde yavaşça yukarı ve aşağı şırınga ederek 100 μL dioksan içinde çözün.
  4. Çözünmüş SalPCl'yi ön odaya ekleyin ve adım 3.3'ü izleyerek sentez sütununa yükleyin. 15 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin, çözeltiyi her 5 dakikada bir çalkalayın. SalPCl çözümünü adım 3.4'e göre çıkarın ve atın.
    NOT: SalPCl büyük miktarda eklenir ve reaksiyon odasına hazırlık ve yükleme sırasında emilen suyu temizler. Bununla birlikte, 4.5 ve 4.6. adımlar sırasında herhangi bir nemin sokulması, nihai oligonükleotid 5'-trifosfat verimini tehlikeye atacaktır.
  5. Ön odaya 250 μL TBAP çözeltisi ekleyin ve adım 3.3'ü izleyerek sentez sütununa yükleyin. Her 5 dakikada bir çalkalayarak 20 dakika boyunca tepki vermesine izin verin. TBAP çözümünü adım 3.4'e göre çıkarın ve atın.
  6. Kolonu 0,5 mL DMF, ardından 0,5 mL ACN ile yıkayın, her eklemeden sonra çözücüyü adım 3.3 ve 3.4'e göre çıkarın.
  7. Ön odaya 250 μL oksitleyici çözelti (tetrahidrofuran (THF) / piridin / su içinde 0.1 M iyot, 88: 10: 2) ekleyin ve adım 3.3'ü izleyerek sentez sütununa yükleyin. Her 10 dakikada bir çalkalayarak 30 dakika boyunca tepki vermesine izin verin. Oksitleyici çözeltiyi adım 3.4'e göre çıkarın ve atın.
  8. Kolonu 0,5 mL ACN ile yıkayın ve 3.3 ve 3.4 numaralı adımlara göre çıkarın.
  9. Reaksiyon aparatını sökün. Sentez kolonunu 5 mL ACN ile yıkayın ve kolonu kurutun.

5. Katı destek, korumasızlık ve saflaştırmadan ayrılma

  1. Kurutulmuş katı destek reçinesini sentez kolonundan çıkarın ve silikon o-ringli 1,5 mL polipropilen vidalı kapaklı sızdırmaz bir tüpe aktarın.
  2. Reçineyi% 28-30% sulu amonyak ve% 40 sulu metilamin (AMA) 1: 1 karışımının 1 mL'sinde askıya alın ve tüpü sıkıca kapatın. Nazik inversiyon39 ile aralıklı karıştırma ile 10 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin. 40 nt'den daha uzun oligonükleotidler için oda sıcaklığında 2 saat daha hafif bir tedavi kullanın.
    DİKKAT: AMA çözeltisinin ısıtılması, tüpü yüksek basınç altına sokacaktır. Tüp sıkıca kapatılmazsa veya amonyak uyumlu (silikon) bir o-ring kullanmazsa, tüp gazı tahliye edebilir veya çözücü sızdırabilir, bu da potansiyel olarak güvenliği veya nihai ürün verimini tehlikeye atabilir. Sıcak AMA çözümü gazı şiddetli bir şekilde evrimleştirebileceğinden, tüpü ortam sıcaklığının üzerindeyken asla açmayın.
  3. Tüpü buz üzerinde soğutun ve kısaca santrifüj yapın (10 s için 6.000-12.000 × g). Süpernatantı reçineden çıkarın, 0,2 μm filtre ile donatılmış bir şırıngadan süzün ve yeni, steril bir polipropilen tüpe aktarın. Amonyak nötrleştirici kimyasal tuzak ile donatılmış bir vakum santrifüjü kullanarak çözeltiyi kuruluğa buharlaştırın.
    NOT: Sentetik oligonükleotid, 2′-silil koruma gruplarına sahip herhangi bir RNA nükleotidi içermiyorsa, adım 5.8'e atlayın.
  4. Kurutulmuş malzemeyi THF'de 1 mL 1 M tetrabütilamonyum florür (TBAF) içinde çözerek, 55 ° C'ye ısıtarak, oligonükleotidi tamamen çözmek için gerekirse çalkalayarak ve oda sıcaklığında 16-24 saat40,41 saat inkübe ederek silil koruma gruplarını çıkarın.
  5. TBAF çözeltisini 1 mL 1 M Tris tamponu, pH 7,5 ile söndürün ve bir vakum santrifüjü kullanarak THF'yi çıkarın.
  6. TBAF tuzlarını, üreticinin talimatlarını izleyerek tek kullanımlık bir boyut hariç tutma sütunu kullanarak çıkarın. 15 nt'den kısa oligonükleotidler için, elüatı fraksiyonlar halinde toplayarak ve ana ürün fraksiyonlarını bir UV-Vis spektrofotometresinde 260 nm'de absorbans ile tanımlayarak ürünün elüsyonunu onaylayın.
  7. Korumasız RNA oligonükleotidi, 15 nt'den azsa liyofilizasyon veya vakum santrifüjü veya 15 nt'den büyükse etanol çökeltisi ile konsantre edin.
  8. Oligonükleotid boyutu, jel plakası ve standı için uygun protokollere göre, 19:1 mono:bis akrilamid stoğu kullanarak% 10-20% poliakrilamid / 8 M üre / 1x TBE jel hazırlayın. Jel plakasını rezervuarlarda 1x TBE ile jel standına monte edin ve en az 30 dakika boyunca 35 W'ta (veya jel plaka formatına uygun olarak) ön çalıştırma yapın.
  9. Katı oligonükleotidi üre jeli yükleme tamponunda (8 M üre,% 10 sakaroz, 50 mM Tris, pH 8, bromofenol ve ksilen siyanol çalışan boyalarla 1 mM EDTA) çözün ve 80 ° C'ye ısıtın. Poliakrilamid jeli üzerine yükleyin ve 25-35 W'ta 1-2 saat boyunca çalıştırın (veya jel plaka formatı ve oligonükleotid boyutu için uygun olduğu şekilde).
    NOT: Bromofenol mavisi veya ksilen siyanol, ürünle birlikte göç ederse, 15 nt'den kısa oligonükleotidler için jel yükleme tamponundan çıkarılmalıdır, çünkü bu boyaların etanol çökeltmesi olmadan salınan oligonükleotidden çıkarılması zordur.
  10. Jel elektroforezi tamamlandığında, jel plakasını jel standından çıkarın, jel plakasını sökün ve jeli polivinilklorür filmine sarın. 254 nm UV ışığı ile arka gölgeleme yaparak ürün bantlarını tanımlayın ve bir tıraş bıçağı kullanarak ana ürün bandını tüketin.
  11. Oligonükleotidi eksize edilmiş jelden ezme ve ıslatma yöntemi42 ile ekstrakte edin.
    1. Eksize edilmiş jeli plastik bir şırıngadan veya mekanik olarak ekstrüzyon yaparak ezin.
    2. 15 nt'den uzun oligonükleotidler için:
      1. 3x hacimli ezilme ve ıslatma tamponunda (300 mM NaCl; 10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) ajitasyon veya sallama ile en az 12 saat boyunca süzün.
      2. Çözeltiyi 0,2 μm filtre ile donatılmış bir şırıngadan geçirerek katı jel parçalarını çıkarın ve oligonükleotidi etanol çökeltisi ile konsantre edin.
    3. 15 nt'den kısa oligonükleotid için:
      1. 3x hacim nükleaz içermeyen suda ajitasyon veya sallama ile en az 12 saat boyunca süzün.
      2. Çözeltiyi 0,2 μm filtre ile donatılmış bir şırıngadan geçirerek katı jel parçalarını çıkarın ve liyofilizasyon ile konsantre edin.
      3. Adım 5.6'da olduğu gibi tek kullanımlık boyut hariç tutma sütunu kullanarak artık tuzları ve çözünürleri çıkarın. Liyofilizasyon ile konsantre olun.
  12. Saflaştırılmış trifosforile oligonükleotidleri -20 °C'de TE tamponunda (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) veya benzer bir oligonükleotid depolama tamponunda saklayın.
    1. Bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak absorbansı 260 nm'de ölçerek oligonükleotidin konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Oligonükleotidin tahmini yok olma katsayısı, 5′-fosforilasyon durumundan etkilenmemelidir ve bir oligonükleotid yok olma katsayısı hesaplayıcısı kullanılarak dizisinden hesaplanabilir.
    2. Trifosforilasyonu kütle spektrometrisi ile doğrulayın. 5'-hidroksil oligonükleotidinkine göre +239.94 Da'lık beklenen bir kütle arayın.
      NOT: Matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu veya elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (sırasıyla MALDI-MS veya ESI-MS), nükleik asitler için optimize edilmiş protokolleri kullanırken oligonükleotidin trifosforilasyon durumunu tanımlamak için uygundur. Bununla birlikte, ESI-MS, daha düşük iyon parçalanma oranları nedeniyle daha tutarlı sonuçlar sağlar; Malzeme Tablosunda temsili bir ticari hizmet verilmektedir.

6. Ribozimin kendi kendini kopyalaması için substratlar olarak trifosforile oligonükleotidler

DİKKAT: 32P radyoaktif bir izotoptur ve aşağıdaki adımlar, bir laboratuvarda radyoaktif malzemelerle çalışmak için standart güvenlik protokolleri kullanılarak ve ilgili Çevre Sağlığı ve Güvenliği departmanları tarafından radyoaktif malzemelerin kullanımı için onaylanmış bir araştırmacı tarafından gerçekleştirilmelidir. Alternatif olarak, kendi kendini kopyalayan ribozim substratı A, 5'-floresein etiketi14 ile sentetik olarak hazırlanabilir ve adım 7.9'da olduğu gibi floresan olarak görüntülenebilir.

  1. A çözeltisini, kendi kendini çoğaltan ribozim E ve 5′-32 P etiketli RNA substratı A14'ün bir karışımı olarak sırasıyla 0.30μM ve 30 μM konsantrasyonlarına hazırlayın. Sırasıyla 75 mM EPPS tamponunda, pH 8.5 ve 37.5 MgCl 2'de in vitro transkripsiyon 14 veya yukarıdaki gibi kimyasal trifosforilasyon ile hazırlanan15 μM trifosforile RNA substratı B ile B transkriptlenmiş ve B-sentetik çözeltiler hazırlayın. Her iki çözümü de 42 °C'ye getirin.
    NOT: Tüm RNA bileşenleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
  2. Kendi kendini çoğaltmayı başlatmak için, 5 μL A çözeltisini 10 μL B transkribe edilmiş veya B-sentetik çözeltisi ile 0,1 μM E, 10 μM A, 10 μM B, 25 mM MgCl2 ve 50 mM EPPS tamponu, pH 8,5 nihai konsantrasyonuna hızla karıştırın. Reaksiyon karışımını 42 °C'de inkübe edin.
  3. Düzenli aralıklarla, 0.5 μL alikot alın ve 9.5 μL formamid jel yükleme tamponunda (% 95 formamid; 10 mM EDTA, pH 8) söndürün.
  4. Jel plakası ve standı için uygun protokollere göre analitik bir poliakrilamid / 8 M üre / 1x TBE jel hazırlayın. Dökme jeli ve plakayı bir jel standına monte edin, rezervuarları 1x TBE ile doldurun ve 30 dakika boyunca 40 W'ta (veya farklı jel plakalar ve standlar için uygun şekilde) ön çalıştırma yapın.
  5. Söndürülmüş reaksiyon numunelerini 80 °C'ye ısıtın, numunenin 5 μL'sini her bir kuyucuğa yükleyin ve jeli yaklaşık 40 dakika boyunca 40 W'ta çalıştırın (veya farklı jel plakaları ve standları için uygun olduğu şekilde).
  6. Jel plakasını jel standından çıkarın, sökün ve jeli polivinilklorür filmine sarın. Jeli bir fosfor perdesi ile örtün ve 1 saat boyunca maruz bırakın (veya 32P cpm için uygun şekilde); floresan/fosforesan jel tarayıcı kullanarak ekranı tarayın.
  7. Jel görüntü ölçme yazılımını kullanarak reaksiyon verimini ölçün.
    1. Analiz Araç Kutusu'nu kullanarak jel görüntüyü açın, Analiz | Şekil Tanımı, dikdörtgen şekli | Alanlar'ı seçin ve her seferinde ve her iki reaksiyonda da reaksiyona girmemiş A ve ürün E'ye karşılık gelen bantların etrafına aynı boyutta dikdörtgenler çizin.
    2. Analiz |'ni seçin Arka Plan Çıkarma, dikdörtgen şekli | Alanlar'ı seçin ve jel görüntüsünün boş bir bölümüne aynı boyutta bir dikdörtgen çizin. Tüm dikdörtgenler için arka plan çıkarma yöntemini Görüntü Dikdörtgeni olarak değiştirin.
    3. Pencere | 2 Alan Penceresi'ni ve ardından | Düzenle'yi seçin Niceliklendirilmiş bant piksel birimlerini bir elektronik tablo dosyasına aktarmak için Excel'e dışa aktar.
  8. E ürününün zamana karşı konsantrasyonunu çizin ve istatistiksel veri sığdırma yazılımı kullanarak verileri lojistik büyüme Eq (1) değerine sığdırın:
    [E] = Equation 1 (1)
    A'nın reaksiyonun maksimum derecesi olduğu yerde, b sigmoidisite derecesidir ve c üstel büyüme oranıdır.
    1. Dışa aktarılan elektronik tabloda, her seferinde ve her iki reaksiyonda ürünün fraksiyonel verimini belirlemek için ürün E hacmini A substratı ve ürün E hacimlerinin toplamına bölün. Zamanın bir fonksiyonu olarak E ürününün verimini belirlemek için A substratının (10 μM) başlangıç konsantrasyonu ile çarpın.
    2. İstatistiksel veri sığdırma yazılımında Dosya |'ni seçin Yeni | Yeni Proje Dosyası, Yeni Tablo ve Grafik altında XY'yi seçin ve Oluştur'a tıklayın. Bitişik sütunlarda hem reaksiyonların reaksiyon sürelerini hem de ürün E verimlerini girin ve sütunları buna uygun şekilde etiketleyin (örneğin; "zaman", "transkripte edilmiş B", "sentetik B").
    3. | Ekle'yi seçin Yeni Analiz, XY analizlerini seçin | Doğrusal olmayan regresyon (eğriye sığma) ve ardından Tamam'ı tıklatın. Büyüme eğrileri | seçin Lojistik büyüme ve Tamam'a tıklayın; diğer parametreleri ayarlamayın. Sonuçlar altındaki sığdırma parametrelerini ve güven aralıklarını ve Grafikler altındaki veri noktalarının ve takılı eğrilerin grafiğini gözlemleyin.

7. L-RNA'nın çapraz kiral kopyalanması

  1. 20 μM D-RNA 27.3t çapraz kiral polimeraz, 2 μM 5′-floresein etiketli L-RNA primer, 4 μM biyotinile L-RNA çekiç kafası şablonu ve L-RNA pppCUG, pppAUG, pppAGG ve pppCGC'nin her biri 20 μM içeren 10 μL RNA çözeltisini, 50 mM Tris, pH 8.3'te hazırlayın. RNA'yı 1 dakika boyunca 90 ° C'ye ısıtarak ve bir PCR termosiklusunda 0.2 ° C / s'de 23 ° C'ye soğutarak tavlayın. Polimeraz, astar ve şablon hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
  2. RNA çözeltisini 17 °C'de inkübe edin ve 10 μL 2x başlangıç tamponu (400 mM MgCl2, 500 mM NaCl ve 50 mM Tris, pH 8.3) ekleyerek reaksiyona başlayın. Reaksiyonun tüm bileşenlerinin nihai konsantrasyonlarının 10 μM polimeraz, 1 μM astar, 2 μM şablon, her trinükleotid 5′-trifosfat, 200 mM MgCl2, 250 mM NaCl ve 50 mM Tris, pH 8.3 olduğundan emin olun.
  3. Reaksiyon ilerledikçe, 10 μL alikot alın ve 5 μL 0.5 M EDTA, pH 8 ile söndürün.
  4. Her söndürülmüş reaksiyon numunesine, biyotinillenmiş şablon aracılığıyla trimer uzatılmış primerleri yakalamak için TE tamponunda 10 μL 1 M NaCl'de asılı duran 0,1 mg streptavidin kaplı manyetik boncuk (20 pmol biyotin-oligonükleotid bağlama kapasitesi) ekleyin ve çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  5. Boncukları bir boncuk yakalama mıknatısı üzerinde yakalayın, sıvıyı çıkarın ve atın ve 50 μL yıkama çözeltisi ekleyin (% 0,05 nötr deterjanla TE'de 250 mM NaCl). Boncukları karıştırın, tekrar yakalayın ve yıkama solüsyonunu çıkarın. Bir kez daha tekrarlayın.
  6. Uzatılmış astarı boncuklardan çıkarmak için, 50 μL elüsyon çözeltisi (% 0,05 nötr deterjanla 25 mM NaOH) ekleyin ve boncukları karıştırın. Boncukları yeniden yakalayın, elüsyon çözeltisini çıkarın, 100 mM Tris (pH 7.5) ile söndürün ve etanol ile çökeltin.
  7. Jel plakası ve standı için uygun protokollere göre analitik bir poliakrilamid / 8 M üre / 1x TBE jel hazırlayın. Dökme jeli ve plakayı bir jel standına monte edin, rezervuarları 1x TBE ile doldurun ve 30 dakika boyunca 40 W'ta (veya farklı jel plakalar ve standlar için uygun şekilde) ön çalıştırma yapın.
  8. Çökeltilmiş RNA'yı 10 μL formamid jel yükleme tamponunda çözün ve formamid jel yükleme tamponunda 0,5 μM'de reaksiyona girmemiş son etiketli astar hazırlayın. Numuneleri 80 °C'ye ısıtın, numunenin 5 μL'sini her bir kuyucuğa yükleyin ve jeli yaklaşık 40 dakika boyunca 40 W'ta çalıştırın (veya farklı jel plakaları ve standları için uygun olduğu şekilde).
  9. Jel plakasını standdan çıkarın ve çapraz kiral L-RNA uzatma ürünlerini görselleştirmek için floresan/fosforesan jel tarayıcı kullanarak tarayın.

Representative Results

Oligonükleotidler, fosforamiditlere ve otomatik DNA / RNA sentezleyicisine uygun standart protokoller kullanılarak sentezlenmeli, ürün oligonükleotidi orijinal plastik sentez kolonundaki katı destekten ayrılarak, serbest 5ʹ-hidroksil üretmek için 5ʹ-terminal dimetoksitritil grubu çıkarılmalıdır (bölüm 1). Bu gösterimde kullanılan tüm oligonükleotidler, katı destek olarak 1.000 şkontrollü gözenek camı (CPG) reçinesi kullanılarak hazırlandı ve 0.2 veya 1 μmole ölçeğinde gerçekleştirildi. Sentezleyici kolonların, reçinelerin, reaktiflerin ve fosforamiditlerin temsili örnekleri Malzeme Tablosunda verilmiştir. Daha büyük ölçekli reaksiyonlar için, sonraki adımlarda kullanılan hacimlerin ve sürelerin ayarlanması gerekebilir.

Trifosforilasyon reaksiyonu, Malzeme Tablosunda listelenen standart, ticari olarak temin edilebilen bileşenler kullanılarak özel yapım bir reaksiyon odasında (Şekil 2, bölüm 3) kolon üzerinde gerçekleştirilir ve Şekil 1 (bölüm 4) 28'de gösterilen şemayı izler. Trifosforilasyon sırasında koşulların kesinlikle susuzca tutulması ve tüm çözücülerin ve reaktiflerin moleküler elekler üzerinde önceden hazırlanması ve kullanımdan önce tamamen kurumasına izin verilmesi esastır (bölüm 2). Trifosforilasyonun gerçekleşmesi tipik olarak 2 saat sürer ve daha sonra, yıkanmış ve kurutulmuş kolon standart oligonükleotid deproteksiyon ve saflaştırma prosedürlerine göre muamele edilebilir (bölüm 5).

Deproteksiyondan sonra, oligonükleotid trifosfatlar, poliakrilamid jel elektroforezini (PAGE) denatüre ederek saflaştırılır ve UV geri gölgeleme ile jelden eksize edilebilen ve salınabilen tek bir ana ürün bandı gösterilir. 5′-trifosfat ürünü, DNA trinükleotid 5ʹ-trifosfatlar, pppAAA ve pppCCC ve L-RNA trinükleotid 5ʹ-trifosfat pppGAA için Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi, kısa oligonükleotidler için reaksiyon tarafı ürünlerinden kolayca ayrılır. AAA ve CCC DNA trimerleri için hem 5'-hidroksil hem de 5'-trifosfat ürünleri eksize edildi ve kütle spektrometresi ile tanımlandı ve buna uygun olarak Şekil 3A'da etiketlendi. AAA DNA trimeri için görülebildiği gibi ek bantlar genellikle iyileşmek ve tanımlamak için yeterli materyal içermez. Bununla birlikte, bu bantların varlığı, aşağıda tartışıldığı gibi, tipik olarak 5'-difosfat, monofosfat ve H-fosfonat yan ürünlerini temsil eden saflaştırılmamış reaksiyon ürünlerindeki (Şekil 3C) ek ürün kütleleri ile ilişkilidir.

PAGE saflaştırmasından sonra, daha büyük oligonükleotidler, ezilme ve ıslatma yöntemi42 ve ardından etanol çökeltmesi kullanılarak salınabilir. Bununla birlikte, 15 nt'den küçük oligonükleotidler etanol verimli bir şekilde çökeltilemez ve bu nedenle jel elüsyonu için modifiye edilmiş bir prosedür gerektirir (adım 5.11.3). Malzeme Tablosunda listelenen tek kullanımlık boyut hariç tutma sütunu, yalnızca 10 nt'den daha uzun oligonükleotidlerle kullanım için derecelendirilmiştir. Bununla birlikte, düzelticiler kadar kısa oligonükleotidlerin, üreticinin önerdiği protokol kullanılarak etkili bir şekilde tuzdan arındırılabileceğini bulduk. Bununla birlikte, kısa oligonükleotidlerin tuzu alınırken (adım 5.6 ve 5.11.3'te olduğu gibi) kolon elüatının fraksiyonlar halinde toplanması ve ürün fraksiyonlarının bir UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak 260 nm'de absorbans ile tanımlanması önerilir. Daha kısa oligonükleotidler için optimize edilmiş bir boyut hariç tutma sütunu, alternatif bir seçenek olarak Malzeme Tablosunda sağlanmıştır. Saflaştırmadan sonra 1 μmol ölçekli oligonükleotid sentezinden elde edilen nihai verim 50-300 nmol'dür.

Trifosforilasyon, trifosforile edilmiş ürünün 5′-hidroksil oligonükleotidden +239.94 Da daha büyük bir kütleye sahip olduğu kütle spektrometrisi ile doğrulanabilir, ancak 5'-di- ve monofosfata karşılık gelen malzemelerin varlığı (+159.96 ve +79.98 Da) sıklıkla gözlenir. 5′-OH kütlesinden +63.98 Da kütleye sahip bir 5′-H-fosfonat yan ürünü de gözlenebilir ve bu ürünün yüksek seviyeleri, trifosforilasyon sırasındaki koşulların yeterince susuz olmadığını gösterir. Saflaştırmadan önce, korumasız oligonükleotidler tipik olarak tüm bu ürünleri gösterecektir (Şekil 3C), saflaştırılmış malzeme ise 5'-di- ve monofosfatlarla birlikte 5'-trifosfat ürününe karşılık gelen bir tepe gösterecektir (Şekil 3D, E).

Tek başına kütle spektrometresi, iyonizasyon sırasında farklı iyonlaşma oranları ve trifosfatın parçalanması nedeniyle tipik olarak 5′-trifosfat saflığının titiz bir ölçüsünü vermeyecektir. Nihai ürün saflığını ölçmek için, özellikle daha uzun oligonükleotidler için ters fazlı sıvı kromatografisi ve tandem ESI-MS (RP-LC / ESI-MS) önerilir. D-RNA 5ʹ-trifosfatlar pppACGAGG ve pppGAGACCGCAACUUA'nın RP-LC/ESI-MS ile analizi (sırasıyla Şekil 4A,B), bu iki türün daha uzun oligonükleotidlerde bulunduğunda ayrılması zor olduğundan,% 20 5ʹ-difosfat içeren tipik nihai ürün saflığını göstermektedir.

Sentetik 5'-trifosfat oligonükleotidler tipik olarak biyokimyasal çalışmalarda enzimatik olarak hazırlanan malzemelerden daha iyi veya daha iyi işlev görür. Bölüm 6'da, örnek olarak, sentetik olarak veya in vitro transkripsiyon ile hazırlanan 5'-trifosfat 14 nt RNA substratları, RNA katalizörlü bir kendi kendine replikasyon reaksiyonu14,15,43,44,45 ile karşılaştırılmıştır. Ribozime E, üstel büyüme yeteneğine sahip otokatalitik bir reaksiyonda E'nin yeni bir kopyasını vermek için A ve B substratlarının birleştirilmesini katalize eder (Şekil 5A). E ve 32P-etiketli A bileşenleri in vitro transkripsiyon ile hazırlandı ve trifosforile substrat B, yukarıda tarif edildiği gibi sentetik olarak veya in vitro transkripsiyon14 ile hazırlandı. Kendi kendini kopyalama reaksiyonu ilerlemesi, PAGE'yi denatüre ederek analiz edilen ve bir floresan / fosforesan jel tarayıcı ile ölçülen periyodik numuneler alınarak izlendi. Lojistik bir büyüme fonksiyonuna uyan elde edilen veriler, transkribe edilmiş veya sentetik B substratının üstel büyümeyi desteklediğini, ancak sentetik B'nin biraz daha fazla miktarda ürün verdiğini ortaya koymuştur (Şekil 5B). Bu sonuç, in vitro transkripsiyon23,24 tarafından hazırlanan RNA'nın 5′-ucundaki bileşimsel heterojenliği yansıtabilir.

Kimyasal trifosforilasyon ayrıca in vitro veya in hücrelerde biyolojik olarak hazırlanamayan oligonükleotid trifosfatların sentezini sağlar. Bölüm 7'de, bölüm 1-5'te olduğu gibi hazırlanan doğal D-RNA'nın enantiyomeri L-RNA'dan oluşan biyolojik olmayan oligonükleotid trifosfatlar, kısa L-RNA oligonükleotid 5′-trifosfatlardan daha uzun bir L-RNA ürününün şablona yönlendirilmiş polimerizasyonunu genel bir sırayla katalize eden D-RNA "çapraz-kiral" polimeraz ribozim 27.3t (Şekil 6A) için substrat olarak kullanılmıştır. Örnek olarak, ribozim, çekiç kafalı kendiliğinden bölünme motifinin bir L-RNA versiyonunu sentezleyebilir (Şekil 6B)18. Saflaştırılmış L-RNA trinükleotid trifosfatları, floresein etiketli L-RNA primer ve L-RNA şablonu (Şekil 6C) ile birleştirildi ve çapraz kiral ligaz ile reaksiyona sokuldu. Reaksiyon boyunca örnekler PAGE tarafından analiz edildi ve şablon tarafından kodlanan çekiç kafalı ribozimin L-RNA versiyonunun sentezini göstermek için bir floresan / fosforesan jel tarayıcı kullanılarak görüntülendi (Şekil 6D).

Figure 3
Şekil 3: Trinükleotid 5ʹ-trifosfatların saflaştırılması. (A) DNA trinükleotidleri tri-deoksiadenozin (AAA, mavi) ve tri-deoksisitidin (CCC, kırmızı) trifosforilasyonunun PAGE analizi (UV geri gölgeleme ile görselleştirilmiş), minör yan ürünleri görselleştirmek için kasıtlı olarak aşırı yüklenmiştir. Hem 5ʹ-trifosfat ürünü (ppp) hem de 5ʹ-hidroksil (OH) başlangıç malzemesi MALDI-MS tarafından eksize edildi ve tanımlandı. (B) L-RNA TRINÜKLEOTID GAA'nın trifosforilasyonunun hazırlık PAGE'i, ana ürün bandı eksize edilmiş ve ESI-MS tarafından 5ʹ-trifosfat (ppp) olarak tanımlanmıştır. (C) Korumadan arındırma sonrası ham reaksiyon ürünlerinin MALDI-MS'si ve (D) (A)'dan saflaştırılmış ürünler. 5ʹ-trifosfat (ppp; pppAAA 1,119 Da, gözlenen 1,118 Da; pppCCC 1,047 Da, gözlenen 1,046); 5ʹ-difosfat (pp), 5ʹ-monofosfat (p), 5ʹ-hidroksil (OH) ve 5ʹ-H-fosfonat (Hp) etiketlenmiştir. (E) (B)'den izole edilmiş 5ʹ-trifosfat ürününün doğrudan enjeksiyonu ESI-MS'den dekonvolüne kütle spektrumu, tanımlanmış pikler etiketlenmiş (beklenen 1,181.6 Da, gözlemlenen 1,181.0 Da). 5ʹ-difosfat (pp) ürünleri, hem tri- hem de di-fosfat ürünleri (+22 Da) için sodyum iyon zirveleri gibi gözlenir. Yaygın kirletici pikleri yıldız işareti ile etiketlenir. Karşılaştırma kolaylığı için, kütle spektrumları her spektrumda ölçülen en yüksek yoğunluğa normalleştirildi ve bu değere göre yüzde olarak rapor edildi. Kısaltmalar: PAGE = poliakrilamid jel elektroforezi; MALDI-MS = matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu; ESI-MS = elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: 6 nt ve 14 nt D-RNA oligonükleotid trifosfatlarının analitik RP-LC'si . (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ ve (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS, her ikisinin de (~% 70) majör zirvesini 5ʹ-trifosfat (ppp) olarak tanımladı ve daha az miktarda 5ʹ-difosfat (pp) elde etti. Kısaltmalar: RP-LC = ters fazlı sıvı kromatografisi; nt = nükleotidler; ESI-MS = elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Kimyasal sentez veya in vitro transkripsiyon ile hazırlanan oligonükleotid 5ʹ-trifosfat substratlarının karşılaştırılması. (A) Kendiliğinden çoğalan ribozim E, RNA A ve 5′-trifosforile RNA B'yi bağlar. (B) 10 μM A ve 10 μM B kullanılarak, sentetik (açık daireler) veya in vitro transkribe edilmiş (doldurulmuş daireler) kullanılarak kendi kendine replikasyon reaksiyonlarının karşılaştırılması. (B) Veriler lojistik büyüme denklemine uygundu: [E] = a / (1 + b e-ct), burada a nihai verim, bsigmoidisite derecesi ve c üstel büyüme oranıdır. İki reaksiyon için büyüme oranları 1.14 h-1'de aynıyken, sentetik B ile reaksiyonlar için son derece %10 daha yüksekti.

Figure 6
Şekil 6: Bir ribozim ile çapraz kiral L-RNA polimerizasyonu. (A) L-RNA'nın şablona bağımlı ligasyonunu katalize eden D-RNA 27.3t polimeraz ribozim. (B) 27.3t ile sentezlenen L-RNA ürünü, çekiç kafalı endonükleaz motifinin bir parçasını oluşturur. (C) Sentetik olarak hazırlanan biyotinile edilmiş bir L-RNA şablonu (kahverengi), bir son etiketli L-RNA primer (macenta) ve dört L-RNA trinükleotid trifosfat (camgöbeği) kullanılarak 27.3t ile katalize edilen L-RNA polimerizasyonu. (D) (B)'nin uzatma ürünlerinin 4 saat ve 24 saat hızlarında, her trinükleotid birleşmesini tam uzunluktaki ürüne (siyah nokta) kadar gösteren PAGE analizi. Reaksiyona girmemiş L-RNA primer referans belirteci olarak dahil edilir. Kısaltmalar: PAGE = poliakrilamid jel elektroforezi; M = referans işaretleyici. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada açıklanan trifosforilasyon prosedürü, standart fosforamid kimyası kullanılarak oligonükleotid sentezi ile geniş ölçüde uyumludur. Nükleozid fosforamiditler, fosfit üzerindeki standart β-siyanoetil ve nükleobazların ekzosiklik aminleri üzerindeki izobütiril, dimetilformamidil, asetil, fenoksiasetil veya 4-izopropilfenoksiasetil grupları dahil olmak üzere AMA39'da hızlı deproteksiyonla uyumlu baz-kararsız koruma gruplarına sahip olmalıdır. Riboz 2'-hidroksil grupları, t-bütildimetilsilil (TBDMS) veya tri-izo-propilsililoksimetil (TOM)40,41 silil koruyucu gruplar tarafından korunmalıdır. Baz kararsız pivaloyloxymethyl (PivOM) grubunun da kimyasal trifosforilasyon30 ile uyumlu olduğu bildirilmiştir.

Sentetik oligonükleotidlerin kimyasal trifosforilasyonu için birçok yöntem tanımlanmıştır 28,29,30,31,32,33,34,35. Ludwig-Eckstein reaktifi37'yi kullanan trifosforilasyonun, reaktiflerin özel sentezi ve özel ekipman gerektirmeyen, en erişilebilir olanlardan biri olduğunu bulduk. Bu yöntemle hazırlanan oligonükleotid 5′-trifosfatlar, bu "ayna görüntüsü" nükleik asidinin şablona bağımlı sentezini ve replikasyonunu elde etmek için enzimatik olarak erişilemeyen L-RNA oligonükleotid trifosfatlarının kullanımı da dahil olmak üzere, RNA ligaz ribozimleri için substratlar olarak rutin olarak kullanılmıştır 14,16,17,18 . Yöntem ayrıca, omurgalılarda doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin güçlü aktivatörleri olan küçük 5'-trifosforile kök döngü RNA'larının hazırlanması için de uygundur 6,7.

Ludwig-Eckstein reaktifi, salisil fosforokloridit37, suya karşı oldukça reaktiftir ve oligonükleotid kolonuna yüklenmeden önce reaktifi çözerken ortaya çıkan suyu etkili bir şekilde temizler. Bununla birlikte, bu noktadan sonra, 5'-fosfitylatlı oligonükleotid, pirofosfat üzerinden sisteme sokulan herhangi bir su ile tercihen reaksiyona girecek ve 28,37,38 çalışmasından sonra 5'-H-fosfonat yan ürünü oluşturacaktır. Trifosforilasyon reaktiflerinin ve trifosforilasyon reaksiyon odasının dikkatli bir şekilde hazırlanması, bu yan ürünün oluşmamasını sağlar. Solvent kurutma için, tip 4 şmoleküler elekler, çoğu oligonükleotid sentez reaktif şirketi tarafından çeşitli marka adları altında çoğu organik çözücüyle uyumlu Teflon torbalarda önceden paketlenmiş olarak satılmaktadır. Susuz bir atmosfer altında bir torpido gözünde trifosforilasyon yapmak gibi ek önlemler genellikle gerekli değildir.

5'-fosfitlenmiş oligonükleotidin TBAP ile reaksiyonu, siklik bir 5'-trimetafosfit ara maddesi oluşturur ve daha sonra oligonükleotid sentez oksitleyici çözeltisi (su / piridin / THF'deki iyot) kullanılarak siklik 5'-trimetafosfata oksitlenir. Ticari oksitleyici çözeltilerin değişen miktarlarda iyot kullandığı ve trifosfata tam oksidasyon sağlamak için yüksek 0.1 M iyot konsantrasyonunun kullanılması esastır. Döngüsel ürün, aynı çözelti37'deki nihai lineer 5′-trifosfata hidrolize edilir ve su dışındaki nükleofiller ile doğrusallaştırma isteniyorsa alternatif susuz oksitleyici çözeltiler kullanılmalıdır (uygulamalar için aşağıya bakınız)33. Bununla birlikte, herhangi bir kalıntı siklik trimetafosfat, oligonükleotidin müteakip alkali deproteksiyonu sırasında doğrusallaştırılacaktır. Döngüsel 5′-trimetafosfatın hidrolizi, dallanmış trifosfat37,46 yerine sadece doğrusal olanı verir.

Oligonükleotid deproteksiyonunun tipik olarak 5'-trifosforilasyonu barındıracak şekilde değiştirilmesi gerekmez, ancak birkaç önlem alınmalıdır. Trifosfat, alkali koşullara kısa süre maruz kalmak için nispeten kararlıdır, ancak trifosfatın AMA'ya gerekenden daha uzun süre maruz kalmamasına dikkat edilmelidir. Amonyak veya AMA'da 65 ° C'de 10 dakikadan fazla uzun süreli tedavi gerektiren grupların korunmasından kaçınılmalıdır. Oda sıcaklığında amonyakta 2 saat gibi daha nazik tedaviler, diğer fosforamid koruma gruplarıyla uyumlu olduğunda kabul edilebilir. Silil korumalı sentetik RNA oligonükleotidler için yaygın, hızlı bir deproteksiyon yöntemi, trietilamin trihidroflorür ve yüksek sıcaklık47 kullanır; Bununla birlikte, RNA 5′-trifosfatları hazırlarken bundan kaçınılmalıdır, çünkü uzun süreli asidik koşulların trifosfat hidrolizini hızlandırdığı bulunmuştur31,32.

Preparatif PAGE'in 5′-trifosforile oligonükleotidlerin postdeproteksiyonu için en basit ve en güvenilir yöntem olduğu kanıtlanmıştır (Şekil 3 ve Şekil 4). Bununla birlikte, hazırlayıcı ters fazlı HPLC, trifosforile edilmiş ürünleri saflaştırmak için de kullanılabilir. 5′-difosfat ve daha az ölçüde 5′-monofosfat ürünlerinin varlığı, kütle spektrometrisi ile trifosforilasyonu doğrularken rutin olarak gözlenir. Kütle spektrometresi sırasında, özellikle cihaz oligonükleotidlerin analizi için optimize edilmemişse, kimyasal sentez veya transkripsiyon ile hazırlanan oldukça saf malzemeden 5'-trifosfat parçalanmasını gözlemledik. Bununla birlikte, RP-LC analizi genellikle 5'-difosfat yan ürünün% 10-20'sinin daha uzun 5'-trifosforile oligonükleotidlerde bulunduğunu göstermektedir (Şekil 4). Tributylammonium pirofosfatın ticari preparatları,% 20'ye kadar monofosfat ile kontamine olabilir, bu da trifosforilasyon sırasında bir yan ürün olarak 5'-difosfat verir30,31. Bu reaktifin şirket içinde dikkatli bir şekilde hazırlanması, çok daha saf TBAP stokları sağlayabilir31. Bununla birlikte, ticari TBAP kaynakları kullanılarak trifosforile edilen oligonükleotidlerin, enzimatik reaksiyonlarda substrat olarak kullanıldığında hala karşılaştırılabilir veya daha fazla reaktivite gösterdiğini bulmuştuk (Şekil 5B), in vitro transkripsiyon ile hazırlanan materyale kıyasla.

Ludwig-Eckstein reaktifi ile oligonükleotid trifosforilasyonunun dikkate değer bir başka kullanımı, siklik trimetafosfit aramaddesi 33'ten yararlanır. Sonraki oksidasyon adımı, genellikle susuz koşullar altında oligonükleotid oksidasyonu için kullanılan hekzanlarda 1 M t-bütil peroksit ile gerçekleştirilirse, fosfitin oksidasyonu, halka açma hidrolizi olmadan gerçekleşir ve siklik trimetafosfat verir. Bu ara ürün daha sonra primer amin veya alkol nükleofilleri ile reaksiyona sokularak γ-fosfatta modifikasyonlarla 5'-trifosfat elde edilebilir. Bu modifikasyonlar, RP-LC ile hızlı trifosfata özgü saflaştırmayı kolaylaştıran bir fosforamid bağı ile bağlanmış bir lipofilik etiketin eklenmesini ve ardından etiketin trifosfat33'ten asidik hidrolizini içerir. γ-fosfat pozisyonundaki floresan modifikasyonları, ribozim-katalizörlü ligasyon reaksiyonları için gerçek zamanlı floresan muhabirleri olarak kullanılmak üzere de tanıtılabilir15,33.

Disclosures

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski ve Katrina Tjhung'a kimyasal trifosforilasyon reaksiyonları için en iyi uygulamalar hakkında yararlı tartışmalar için ve Gerald Joyce'a yararlı yorumlar için minnettardır. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı'ndan MCB 2114588 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm polyethersulfone syringe filter MilliporeSigma SLMP025SS Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5)
0.22 µm PTFE syringe filter MilliporeSigma SLLG013SL Syringe filter for removing CPG resin (Section 5)
1 mL plastic syringes ThermoFisher Scientific 14-823-434 (BD 309659) Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
1,4-Dioxane, anhydrous MilliporeSigma 296309 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) MilliporeSigma 324124 Triphosphorylation reagent (sections 2–4)
30 mL glass bottles MilliporeSigma 23232 Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2)
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene Bio-Rad Laboratories 7328103 Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 Bio-Rad Laboratories 1610144 For PAGE (sections 5–7)
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL Glen Research 40-4050-50 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
Ammonia-neutralizing Trap ThermoFisher Scientific ANT100 and ANS121 For use with Speedvac DNA130 (section 5)
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad Laboratories 1610700 For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7)
Aqueous ammonia, 28% MilliporeSigma 338818 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Aqueous methylamine, 40% TCI America TCI-M0137 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer any column-based synthesizer is acceptable (section 1)
Bead-capture magnet ThermoFisher Scientific 12320D For streptavidin bead capture (section 7)
Bromophenol blue Bio-Rad Laboratories 1610404 For PAGE urea loading buffer (section 5)
Deep vacuum oil pump ThermoFisher Scientific VLP200-115 For use with lyophilizer (section 5)
Drierite dessicant, 10-20 mesh MilliporeSigma 737828 Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2)
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase prepared in house18 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns Glen Research 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
D-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes ANP-3201, 3202, 3203, 3205 representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm Glen Research 20-0021-01 Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1)
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid MilliporeSigma E1894 Ribozyme reaction buffer component (section 6)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid MilliporeSigma EDS Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7)
Filters for Expedite synthesis columns Glen Research 20-0021-0F Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1)
Fluorescent/phosphorescent gel scanner Cytiva Amersham Typhoon RGB, 29187193 For visualizing analytical PAGE (sections 6–7)
Formamide, deionized VWR Life Science 97062 For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7)
Gel image quantitation software Cytiva ImageQuant TL For quantifying scanned gel images (section 6)
Glass desiccator MilliporeSigma CLS3121150 Triphosphorylation solvent storage (section 2)
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk ChemGenes N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
L-RNA hammerhead template prepared in house18 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA primer prepared in house18 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Lyophilizer/Freeze Dryer VirTis Benchtop K For concentrating oligonucleotides (section 5)
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid MilliporeSigma M2670 For ribozyme reactions (sections 6–7)
N,N-Dimethylformamide, anhydrous MilliporeSigma 227056 Triphosphorylation solvent (section 2)
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) ThermoFisher Scientific 45000150 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5)
Non-coring stainless steel needle, 20 G ThermoFisher Scientific 14-815-410 Needles for piercing rubber septa (sections 2–4)
Oligonucleotide extinction coefficient calculator Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5)
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water ChemGenes RN-1456 Triphosphorylation reagent (section 4)
PAGE plates Timberrock/CBS NGP-250-BO and NO For PAGE (sections 5–7)
PAGE power supply Bio-Rad Laboratories PowerPac HV 1645056 For PAGE (sections 5–7)
PAGE spacers and combs (analytical) Timberrock/CBS VGS-0725 and VGC-0714 For PAGE (sections 6–7)
PAGE spacers and combs (preparative) Timberrock/CBS VGS-3025R and VGC-3001 For PAGE (section 5)
PAGE stand Timberrock/CBS ASG-250 For PAGE (sections 5–7)
Parafilm M ThermoFisher Scientific 13-374-12 (Bemis PM999) Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
PCR thermocycler Bio-Rad Laboratories C1000 Touch Thermalcycler For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) MilliporeSigma GE17-0010-01 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5)
Phosphor screens Cytiva 28956480 For visualizing 32P-labeled RNA (section 6)
Phosphoramidite synthesis reagents Glen Research 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1)
Polypropylene screw-cap sealable tube MilliporeSigma BR780752 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5)
Pyridine, anhydrous MilliporeSigma 270970 Triphosphorylation solvent (section 2)
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) Novatia n/a Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5)
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white MilliporeSigma Z564702 Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2)
Self-replicator ribozyme E prepared in house14 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate A prepared in house14 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate B, transcribed prepared in house14 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves ChemGenes DMT-1975 Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2)
Sodium Chloride (NaCl), solid MilliporeSigma S7653 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Sodium Hydroxide (NaOH), solid MilliporeSigma S8045 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Statistical data-fitting software GraphPad Prism For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6)
Streptavidin-coated magnetic beads ThermoFisher Scientific 65002 For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
Sucrose MilliporeSigma 84097 For PAGE urea loading buffer (section 5)
TBE running buffer, 10x ThermoFisher Scientific AAJ62788K3 For PAGE (sections 5–7)
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran Aldrich 216143 For removing 2′-silyl protecting groups (section 5)
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad Laboratories 1610801 For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7)
Tributylamine MilliporeSigma 90781 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) MilliporeSigma P8533 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tris base MilliporeSigma T6666 Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7)
TWEEN20 polysorbate detergent MilliporeSigma P7949 Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7)
Urea MilliporeSigma U5378 For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7)
UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000, ND2000 For measuring oligonucleotide concentrations (section 5)
Vacuum centrifuge ThermoFisher Scientific Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator For removing AMA and THF (section 5)
Xylene cyanol Bio-Rad Laboratories 1610423 For PAGE urea loading buffer (section 5)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuman, S. What messenger RNA capping tells us about eukaryotic evolution. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (8), 619-625 (2002).
  2. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  3. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  4. Myong, S., et al. Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5'-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA. Science. 323 (5917), 1070-1074 (2009).
  5. Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 140, 805-820 (2010).
  6. Wang, Y., et al. Structural and functional insights into 5'-ppp RNA pattern recognition by the innate immune receptor RIG-I. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 781-787 (2010).
  7. Goubau, D., et al. Antiviral immunity via RIG-I-mediated recognition of RNA bearing 5'-diphosphates. Nature. 514 (7522), 372-375 (2014).
  8. Joyce, G. F. Forty years of in vitro evolution. Angewandte Chemie. 46 (34), 6420-6436 (2007).
  9. Robertson, M. P., Ellington, A. D. In vitro selection of an allosteric ribozyme that transduces analytes to amplicons. Nature Biotechnology. 17 (1), 62-66 (1999).
  10. Robertson, M. P., Hesselberth, J. R., Ellington, A. D. Optimization and optimality of a short ribozyme ligase that joins non-Watson-Crick base pairings. RNA. 7 (4), 513-523 (2001).
  11. Hesselberth, J. R., Robertson, M. P., Knudsen, S. M., Ellington, A. D. Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase array. Analytical Biochemistry. 312 (2), 106-112 (2003).
  12. Lam, B. J., Joyce, G. F. Autocatalytic aptazymes enable ligand-dependent exponential amplification of RNA. Nature Biotechnology. 27 (3), 288-292 (2009).
  13. Lam, B. J., Joyce, G. F. An isothermal system that couples ligand-dependent catalysis to ligand-independent exponential amplification. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 3191-3197 (2011).
  14. Olea, C., Horning, D. P., Joyce, G. F. Ligand-dependent exponential amplification of a self-replicating L-RNA enzyme. Journal of the American Chemical Society. 134 (19), 8050-8053 (2012).
  15. Olea, C., Joyce, G. F. Real-Time Detection of a Self-Replicating RNA Enzyme. Molecules. 21 (10), (2016).
  16. Sczepanski, J. T., Joyce, G. F. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme. Nature. 515 (7527), 440-442 (2014).
  17. Tjhung, K. F., Sczepanski, J. T., Murtfeldt, E. R., Joyce, G. F. RNA-catalyzed cross-chiral polymerization of RNA. Journal of the American Chemical Society. 142 (36), 15331-15339 (2020).
  18. Bare, G. A. L., Joyce, G. F. Cross-chiral, RNA-catalyzed exponential amplification of RNA. Journal of the American Chemical Society. 143 (45), 19160-19166 (2021).
  19. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15 (21), 8783-8798 (1987).
  20. Chelliserrykattil, J., Ellington, A. D. Evolution of a T7 RNA polymerase variant that transcribes 2'-O-methyl RNA. Nature Biotechnology. 22 (9), 1155-1160 (2004).
  21. Ibach, J., et al. Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2′-O-methyl-modified RNA. Journal of Biotechnology. 167 (3), 287-295 (2013).
  22. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  23. Pleiss, J. A., Derrick, M. L., Uhlenbeck, O. C. T7 RNA polymerase produces 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA. 4 (10), 1313-1317 (1998).
  24. Schenborn, E. T., Mierendorf, R. C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Research. 13 (17), 6223-6236 (1985).
  25. Martin, C. T., Muller, D. K., Coleman, J. E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry. 27 (11), 3966-3974 (1988).
  26. Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
  27. Vasilyev, N., Serganov, A. Preparation of short 5′-triphosphorylated oligoribonucleotides for crystallographic and biochemical studies. Nucleic Acid Crystallography: Methods and Protocols. , 11-20 (2016).
  28. Lebedev, A. V., Koukhareva, I. I., Beck, T., Vaghefi, M. M. Preparation of oligodeoxynucleotide 5'-triphosphates using solid support approach. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 20 (4-7), 1403-1409 (2001).
  29. Paul, N., Springsteen, G., Joyce, G. F. Conversion of a ribozyme to a deoxyribozyme through in vitro evolution. Chemistry & Biology. 13 (3), 329-338 (2006).
  30. Zlatev, I., et al. Efficient solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphates of DNA, RNA, and their analogues. Organic Letters. 12 (10), 2190-2193 (2010).
  31. Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J. -J., Morvan, F. Solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphate DNA, RNA, and chemically modified oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 1, Unit1.28 (2012).
  32. Zlatev, I., et al. Automated parallel synthesis of 5'-triphosphate oligonucleotides and preparation of chemically modified 5'-triphosphate small interfering RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (3), 722-732 (2013).
  33. Goldeck, M., Tuschl, T., Hartmann, G., Ludwig, J. Efficient solid-phase synthesis of pppRNA by using product-specific labeling. Angewandte Chemie. 53 (18), 4694-4698 (2014).
  34. Sarac, I., Meier, C. Efficient automated solid-phase synthesis of DNA and RNA 5′-triphosphates. Chemistry-A European Journal. 21 (46), 16421-16426 (2015).
  35. Sarac, I., Meier, C. Solid-phase synthesis of DNA and RNA 5'-O-triphosphates using cycloSal chemistry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 64 (1), 4-67 (2016).
  36. Perez, J. T., et al. Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch from transcription to replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11525-11530 (2010).
  37. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. The Journal of Organic Chemistry. 54 (3), 631-635 (1989).
  38. Gaur, R. K., Sproat, B. S., Krupp, G. Novel solid phase synthesis of 2'-o-methylribonucleoside 5'-triphosphates and their α-thio analogues. Tetrahedron Letters. 33 (23), 3301-3304 (1992).
  39. Reddy, M. P., Hanna, N. B., Farooqui, F. Fast cleavage and deprotection of oligonucleotides. Tetrahedron Letters. 35 (25), 4311-4314 (1994).
  40. Hogrefe, R. I., McCaffrey, A. P., Borozdina, L. U., McCampbell, E. S., Vaghefi, M. M. Effect of excess water on the desilylation of oligoribonucleotides using tetrabutylammonium fluoride. Nucleic Acids Research. 21 (20), 4739-4741 (1993).
  41. Pitsch, S., Weiss, P. A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X. Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2′-O-[(Triisopropylsilyl)oxy]methyl(2′-O-tom)-protected phosphoramidites. Helvetica Chimica Acta. 84 (12), 3773-3795 (2001).
  42. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), (2019).
  43. Paul, N., Joyce, G. F. A self-replicating ligase ribozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12733-12740 (2002).
  44. Lincoln, T. A., Joyce, G. F. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science. 323 (5918), 1229-1232 (2009).
  45. Robertson, M. P., Joyce, G. F. Highly efficient self-replicating RNA enzymes. Chemistry & Biology. 21 (2), 238-245 (2014).
  46. Singh, J., et al. Synthesis of modified nucleoside oligophosphates simplified: fast, pure, and protecting group free. Journal of the American Chemical Society. 141 (38), 15013-15017 (2019).
  47. Bellon, L. Oligoribonucleotides with 2'-O-(tert-butyldimethylsilyl) groups. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 3., Unit 3.6 (2001).

Tags

Biyomühendislik Sayı 184
Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bare, G. A. L., Horning, D. P.… More

Bare, G. A. L., Horning, D. P. Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (184), e63877, doi:10.3791/63877 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter