Summary
Этот протокол описывает размерную эксклюзионную хроматографию, легкий и воспроизводимый метод обогащения внеклеточных везикул Mycobacterium tuberculosis из супернатантов культуры.
Abstract
Роль внеклеточных везикул (EV) в контексте бактериальной инфекции стала новым способом понимания микробной физиологии. В частности, mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV играют роль во взаимодействии хозяина и патогена и реакции на стресс окружающей среды. Mtb EV также очень антигенны и демонстрируют потенциал в качестве компонентов вакцины. Наиболее распространенным методом очистки Mtb EV является ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Этот процесс имеет несколько ограничений, включая низкую пропускную способность, низкую производительность, зависимость от дорогостоящего оборудования, технические проблемы, и это может негативно повлиять на полученную подготовку. Хроматография с исключением размеров (SEC) является более мягким альтернативным методом, который борется со многими ограничениями ультрацентрифугирования. Этот протокол демонстрирует, что SEC эффективен для обогащения Mtb EV и производит высококачественные препараты Mtb EV повышенной производительности быстрым и масштабируемым способом. Кроме того, сравнение с ультрацентрифугированием градиента плотности с помощью количественных и квалификационных процедур демонстрирует преимущества SEC. В то время как оценка количества EV (анализ отслеживания наночастиц), фенотипа (просвечивающая электронная микроскопия) и содержания (вестерн-блоттинг) адаптирована к Mtb EV, предоставленный рабочий процесс может быть применен к другим микобактериям.
Introduction
Высвобождение внеклеточных везикул (EV) патогенами может быть ключом к раскрытию новых технологий для борьбы с инфекционными заболеваниями1. Микобактерии туберкулеза (Mtb) являются возбудителем с высокими последствиями, заражая примерно одну треть населения мира и ежегодно унося жизни миллионов людей2. Производство EV Mtb хорошо документировано, но неуловимо в биогенезе и различных ролях (т.е. иммуностимулирующих, иммуносупрессивных, железо и питательных веществ) этих EV в контексте инфекции 3,4,5. Попытки понять состав Mtb EV выявили 50-150 нм липидных мембранно-замкнутых сфер, полученных из плазматической мембраны, содержащей липиды и белки иммунологического значения 3,6. Исследование роли Mtb EV в бактериальной физиологии выявило важность бактериальной модуляции EV в ответ на стресс окружающей среды для выживания5. Исследования взаимодействия хозяина и патогена были более сложными для интерпретации, но данные указывают на то, что Mtb EV могут влиять на иммунный ответ хозяина и потенциально могут служить эффективным компонентом вакцинации 3,4,7.
Большинство исследований Mtb EV до сих пор основывались на ультрацентрифугировании градиента плотности для обогащенияпузырьков 8. Это было эффективно для мелкомасштабных исследований; однако этот метод сопряжен с рядом технических и логистических проблем. Альтернативные рабочие процессы сочетают многоступенчатое центрифугирование для удаления целых клеток и крупного мусора с заключительным этапом ультрацентрифугирования для пеллетных электромобилей. Эта методология может варьироваться по эффективности и часто приводит к низкому выходу и совместной очистке растворимых биомолекул, не связанных с везикулами, а также влияет на целостностьпузырьков 9. Кроме того, этот процесс занимает много времени, интенсивно используется вручную и очень ограничен по пропускной способности из-за ограничений оборудования.
Настоящий протокол описывает альтернативный метод ультрацентрифугирования градиента плотности: хроматография с исключением размеров (SEC). Этот метод был продемонстрирован для экологических микобактерий, и в текущей работе он был экстраполирован на Mtb10. Коммерчески доступная колонна и автоматический коллектор фракций могут улучшить консистенцию в пузырной подготовке и уменьшить потребность в специальном, дорогостоящем оборудовании. Также можно завершить этот протокол за долю времени по сравнению с ультрацентрифугированием градиента плотности, увеличивая пропускную способность. Этот метод является менее технически сложным, что облегчает его освоение и может повысить межлабораторную воспроизводимость. Наконец, SEC обладает высокой эффективностью разделения и является щадящим, сохраняя целостность везикул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональный комитет по биобезопасности Университета штата Колорадо одобрил настоящее исследование (19-046B). Культивирование микобактерий туберкулеза и сбор богатых EV супернатантов культуры выполнялись обученным персоналом в лаборатории с высокой степенью локализации. Материалы были вывезены из зоны с высоким уровнем локализации после того, как был выполнен, подтвержден и одобрен институциональной политикой в области биобезопасности действительный метод инактивации. При воспроизведении протокола, если валидированный метод инактивации или стерильной фильтрации невозможен, в лаборатории с высокой степенью локализации необходимо выполнить следующие процедуры.
1. Приготовление сырого концентрата Mtb EV
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры по выращиванию Mtb и получению культурального фильтратного белка (CFP) см. в ссылках11,12. Рекомендуется, чтобы бактериальные питательные среды не содержали добавок для роста с EV-содержащими или белковыми компонентами, такими как каталаза олеинового альбумина декстрозы (OADC), и моющих средств, таких как Tween. Также рекомендуется, чтобы качество бактериальной культуры и собранный CFP были проверены, чтобы обеспечить ограниченную гибель клеток и лизис13,14.
- Подготовьте центробежный фильтр с молекулярной массой 100 кДа (MWCO) (см. Таблицу материалов), добавив полную объемную емкость фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS). Центрифуга в течение 5 мин при 2,800 х г при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании фильтра без мертвого уровня необходимо позаботиться о том, чтобы объем образца не уменьшался ниже уровня фильтра, что приводит к полной высыханию фильтра во время центрифугирования. - Отбросьте проточную и любую оставшуюся PBS перед заполнением пробной камеры Mtb CFP до максимальной емкости. Центрифуга при 2 800 х г при 4 °C до тех пор, пока объем не уменьшится до минимального объема ультрафильтрационного устройства. Повторяйте по мере необходимости, добавляя больше CFP в устройство до тех пор, пока весь образец не будет достаточно уменьшен.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании сохранить часть проточного материала мощностью 100 кДа (100F) для последующей квалификации. Хранить при температуре 4 °C. - Добавьте 1x PBS к фильтрующему блоку, содержащему концентрат, до общей емкости устройства. Уменьшите громкость, как описано в 1.2. Повторите этот шаг пять раз, чтобы обеспечить полную промывку и буферную замену.
- Восстановите концентрированный ретентат CFP (100R) емкостью 100 кДа в соответствии со спецификациями ультрафильтрационного устройства (см. Таблицу материалов). После восстановления 100R промывайте фильтр с минимальным объемом 1x PBS не менее трех раз и объединяйте промывку с 100R, чтобы максимизировать восстановление.
- Количественно оцените материал 100R с помощью бицинхонинового анализа (BCA) в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Для выполнения анализа используйте несколько разведений образцов 1:2, 1:5 и 1:10 в PBS. Протестируйте образец в трех экземплярах.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании сохранить часть материала 100R для последующей квалификации. Хранить при температуре 4 °C.
2. Хроматография исключения размеров для обогащения Mtb EV из CFP
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура специфична для использования 3 мг 100R Mtb CFP с колонкой SEC и автоматическим сборщиком фракций (AFC, см. Таблицу материалов). Он может быть адаптирован для других начальных концентраций и типов колонок, следуя спецификациям производителя. Кроме того, пользователям рекомендуется прочитать и понять руководство пользователя автоматического сборщика дробей.
- Позвольте столбцу SEC уравновеситься до комнатной температуры.
- Включите AFC с помощью выключателя питания на задней панели башенного блока и при необходимости отрегулируйте настройки тензодатчика, нажав SETUP на сенсорном экране главного меню. Тензодатчик должен быть откалиброван только при первом использовании, после каждого обновления программного обеспечения и при обнаружении несоответствия в объемах сбора фракций.
- На экране SETUP выровняйте карусель, выбрав CAROUSEL > CALIBRATE. Вставьте карусель с 13 небольшими отверстиями, обращенными вверх, в башню AFC и отрегулируйте карусель так, чтобы сопло жидкости находилось непосредственно над заподлицо, нажав кнопки - и/или + .
- Снимите колпачки из уравновешенного столбца SEC. Сдвиньте колонну SEC в соответствующее крепление колонны и аккуратно установите ее на башню AFC. Убедитесь, что метка радиочастотной идентификации (RFID) на колонне обращена к AFC и убедитесь, что соединение между колонной и клапаном надежно. Поместите выпускную трубку для отходов в контейнер для сбора.
- На экране SETUP выберите Расписание сбора и установите значение 13, а размер — 0,5 мл, нажав кнопки - и/или + . Оставьте значение "Объем буфера" по умолчанию равным 2,7 мл, а затем закройте окно "Расписание сбора", нажав клавишу X.
- Выберите НАЧАТЬ КОЛЛЕКЦИЮ на начальном экране и подтвердите параметры коллекции, выбрав ДА. Нагрузка 13 маркированных микроцентрифужных трубок объемом 1,7 мл с открытыми крышками, направленными в сторону центра карусели.
- Переместите AFC, выбрав OK, затем смонтируйте резервуар колонны и снова нажмите OK. Выберите параметр для очистки столбца, нажав клавишу ДА, и добавьте один том столбца PBS с фильтрацией 0,2 мкм, чтобы удалить любой буфер хранения. Как только промывка будет завершена, переместите AFC, нажав OK.
- Поместите крышку карусели на AFC и нажмите OK. Подготовьте один столбец объемом 0,2 мкм с фильтрованной PBS. Используйте пипетку, чтобы удалить лишний буфер из столбца.
- Принесите 3 мг образца 100R, как количественно определено на этапе от 1,5 до 500 мкл с 1x PBS. Добавьте образец 3 мг в верхнюю часть колонки. Переместите AFC и позвольте образцу столкнуться с фритом. После того как образец полностью войдет в столбец, добавьте pBS, подготовленный на этапе 2.6, в резервуар.
- Следите за выполнением AFC, пока он собирает сначала объем пустоты, а затем указанные фракции. После того, как пробег завершится и карусель вернется в исходное положение, снимите крышку и снимите трубки фракции с карусели. Храните фракции при температуре 4 °C до количественной оценки (этап 3) и квалификации (этап 4).
- Если столбец необходимо использовать повторно, выберите параметр очистки столбца, нажав клавишу ДА; в противном случае нажмите клавишу NO. Следуйте инструкциям на AFC.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как колонна вымыта и буфер хранения пропущен, его можно снять, закрыть и сохранить при 4 °C.
3. Количественная оценка электромобилей Mtb
- Измерьте концентрацию белка для каждой фракции, используя BCA и micro BCA12.
- Для фракций 0,5 мл, собранных из 3 мг 100R Mtb CFP, используйте микро BCA с разбавлением 1:3 для фракций, пронумерованных 1-7 каждого образца в трех экземплярах.
- Для фракций 0,5 мл, пронумерованных 5-13, используйте БЦА без разбавления для каждого образца в трех экземплярах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перекрытие анализов для фракций 5-7 поможет обеспечить, чтобы все фракции имели читаемый выход.
- Количественно оцените концентрацию частиц для каждой фракции с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA).
- Разбавить образцы в 1 мл 1x PBS, используя следующие рекомендуемые начальные соотношения; для фракций 1-3 используйте 1:100, а затем для остальных фракций используйте разведение 1:10.
- Вращайте разбавленные растворы, а затем втягивайте образец в одноразовый шприц объемом 1 мл. Установите шприц в автоматический шприцевой насос, если таковой имеется.
- Установите шприцевую накачку на 30 мкл/мин и используйте настройки видеозахвата с коэффициентом усиления экрана 10-12 и уровнем камеры 10-12. Настройте фокус для каждого образца.
- Соберите не менее трех видео по 30 с каждое, используя постоянный поток.
- Выполните анализ с пороговым значением обнаружения программного обеспечения, равным пяти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, не удастся получить данные NTA для последних фракций (>7) без ущерба для значительного объема выборки.
4. Квалификация электромобилей Mtb
- Визуализируйте общий профиль белка каждой фракции с помощью окрашенного серебром белкового геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры для SDS-PAGE и серебряного окрашивания можно найти в Ссылке15.- Добавьте буфер образцов SDS к 10 мкл каждой фракции и 5 мкг CFP, 100R и 100F. Кипятить в течение 5 мин при 100 °C, затем нагружать 4%-12% гелем Bis-Tris с лестницей молекулярной массы для электрофореза полиакриламидного геля (PAGE) (см. Таблицу материалов).
- Запустите гель, используя 1x 2-[N-морфолино]этанесульфоновую кислоту (MES) рабочий буфер (см. Таблицу материалов) и ток 200 В в течение 35 минут.
- Извлеките гель из кассеты и приступайте к окрашиванию серебром15.
- Оцените наличие или отсутствие маркеров EV в каждой фракции с помощью вестерн-блоттинга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры для вестерн-блоттинга можно найти в Ссылке15.- Запустите гель SDS-PAGE, как описано в шагах 4.1.1-4.1.2.
- Извлеките гель из кассеты и перенесите разрешенные белки на нитроцеллюлозную мембрану 0,2 мкм (см. Таблицу материалов), применяя ток 50 В в течение как минимум 1 ч.
- Выполните анализ вестерн-блоттинга для оценки интересующих белков. Рекомендуются первичные антитела против LpqH, липоарабиноманнана (LAM) и GroES (см. Таблицу материалов).
- Фракции пула основаны на наличии или отсутствии маркеров, применимых к нижестоящему приложению.
- Подтвердить наличие интактных везикул можно с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ).
- Зафиксируйте 15 мкл образца везикулы, добавив 15 мкл 4% параформальдегида ЭМ-класса, и храните при 4 °C в течение ночи.
- Подготовьте медную сетку с 200-сетчатым формвар-углеродным покрытием, очистив поверхность и сделав гидрофильную подложку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется плазменная очистка 95% аргона, 5% кислорода и 30% плазменной энергии в течение 1 мин. - Опустите 10 мкл неподвижного образца на сетку и дайте образцу прилипнуть в течение 10 минут, затем смойте лишнюю жидкость фильтровальной бумагой.
- Сплавьте сетку на капле сверхчистой воды в течение 30 с, затем смойте лишнюю жидкость.
- Поместите сетку на каплю уранилацетата d% ЭМ в течение 2 мин, затем смойте лишнюю жидкость.
- Дайте сетке полностью высохнуть на воздухе.
- Изображение с использованием ТЭМ (см. Таблицу материалов) при 100 кВ или аналогичном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие методы количественного определения и определения характеристик ЭЛЕКТРОМОБИЛей должны использоваться на основе последующих приложений. Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул18 должна быть рассмотрена для получения руководящих принципов для обеспечения строгости и воспроизводимости всех исследований EV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Культуральный фильтрат белка (CFP) из Mycobacterium tuberculosis (Mtb) концентрировали, количественно оценивали, а затем 3 мг материала наносили на колонку эксклюзионной хроматографии (SEC). Концентрации белка и частиц были перечислены BCA и NTA соответственно. Ожидаемые диапазоны восстановления белка и частиц плюс точные значения, полученные для этих результатов, приведены в таблице 1. Значения, намного превышающие эти диапазоны, могут указывать на загрязнение или проблемы с целостностью столбцов. Значения значительно ниже указывают на проблемы на этапах ультрафильтрации, и поэтому проточную способность необходимо сравнивать с исходнымИ CFP и 100R, чтобы определить, произошла ли успешная концентрация. Неспецифическое белковое серебряное пятно показывает, что более поздние фракции содержат больше белка и напоминают материал 100R (рисунок 1).
Западные пятна фракций демонстрируют, что липоарабиноманнан (LAM) присутствует во всех фракциях, а более поздние фракции показывают более низкую интенсивность полос (рисунок 2A, дополнительный рисунок 1). 19 кДа липопротеин LpqH, который, как известно, присутствует в Mtb EV 3,19, обогащается самыми ранними фракциями из SEC (рисунок 2B, дополнительный рисунок 1). Белок шаперонина GroES 10 кДа отсутствует в самых ранних фракциях SEC (рисунок 2C, дополнительный рисунок 1); этот вывод согласуется с ранее опубликованными исследованиями, касающимися GroES как загрязняющего вещества во время обогащения Mtb EV12, и служит отрицательным контролем присутствия Mtb EV. Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) подтверждает наличие закрытых, связанных с мембраной везикул (рисунок 3А). Сравнение Mtb EV, разделенных ультрафильтрацией градиента плотности, и этого метода SEC приведено в таблице 2. SEC обеспечивает более высокое восстановление белка и частиц для трех технических реплик из одного и того же CFP. Эти результаты были согласованы в нескольких партиях CFP (данные не показаны). Оба метода приводят к образованию закрытых, связанных с мембраной везикул в ожидаемом диапазоне размеров, как показано в TEM (рисунок 3) и NTA (рисунок 4).
В целом, эти данные демонстрируют обогащение Электромобилей Mtb в ранних фракциях SEC. Самые высокие значения NTA встречаются во фракциях 1-3, а содержание белка увеличивается по мере увеличения числа фракций, что указывает на отделение растворимых белков от EV (таблица 1). Поскольку фракция 4 содержит доказательства GroES (рисунок 2C, дополнительный рисунок 1), эта фракция не была включена в объединенный материал для ТЕА. В зависимости от последующего приложения необходимо рассмотреть вопрос о включении или исключении определенных фракций для стратегии объединения.
Рисунок 1: Серебряное пятно по фракциям. Гель SDS-PAGE, окрашенный серебром, демонстрирует общий профиль белка для каждой фракции. CFP = 5 мкг Mtb CFP, 100R = 5 мкг 100R, 100F = 5 мкг 100F, 1-11 = 10 мкл SEC фракций 1-11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Западные пятна по фракциям. Западные пятна, обнаруживающие (A) LAM, (B) LpqH и (C) GroES, демонстрируя изменения белковых маркеров во фракциях. CFP = 5 мкг Mtb CFP, 100R = 5 мкг 100R, 100F = 5 мкг 100F, 1-11 = 10 мкл SEC фракций 1-11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Изображения просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ). (A) SEC фракции 1-3 объединяются перед фиксацией. (B) Ультрацентрифугирование градиента плотности Mtb EV было отрицательно окрашено для визуализации ТЕА. Шкала стержней = 200 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Распределение анализа отслеживания наночастиц (NTA). (A) SEC фракции 1-3. (B) Ультрацентрифугирование градиента плотности Mtb EV было проанализировано с помощью анализа отслеживания наночастиц. Отобразится распределение размеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Дробь | Диапазон восстановления белка (мкг/мкл) | Диапазон рекуперации частиц (на мкл) | Результирующее восстановление белка (мкг/мкл) | Результирующее извлечение частиц (на мкл) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1Е8 - 3Е8 | 0.013 | 1.60Е+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2Е8 - 4Э8 | 0.026 | 2.10Е+08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2Е7 - 6Е7 | 0.024 | 5.20Е+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7Е6 - 2Е7 | 0.032 | 1.30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1Е6 - 5Е6 | 0.053 | 4.20Е+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1Е6 - 5Е6 | 0.099 | 5.20Е+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1Е6 - 3Е6 | 0.234 | 2.70Е+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1Е6 - 4Е6 | 0.398 | 4.20Е+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1Е6 - 3Е6 | 0.543 | 4.10Е+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1Е6 - 3Е6 | 0.661 | 1.70Е+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1Е6 - 3Е6 | 0.736 | 1.40Е+06 |
Таблица 1: Восстановление белка и частиц по фракциям. Ожидаемый диапазон восстановления белка и частиц на фракцию в зависимости от 3 мг исходного материала. Точные значения для получения материала, использованного в этом исследовании, включены в две крайние правые колонки.
| Метод обогащения | Общий восстановленный белок (мкг) | Общее количество извлеченных частиц |
| Ультрацентрифугирование градиента плотности | 3.14 | 1.82E+10 |
| 3.88 | 1.93E+10 | |
| 3.20 | 1.65E+10 | |
| Размерная эксклюзионная хроматография Ф1-3 | 12.96 | 4.05Е+10 |
| 14.14 | 4.15Е+10 | |
| 14.74 | 4.35Е+10 |
Таблица 2: Метод сравнения восстановления белка и частиц. Выход белка, измеренный с помощью BCA, и общее количество частиц, измеренное NTA для Mtb EV, происходящих из 3 мг того же исходного материала 100R, обогащенного с использованием метода ультрацентрифугирования с градиентом плотности8 или этого метода SEC (трипликат).
Дополнительный рисунок 1: Оригинальные вестерн-блоты (необрезанные) из рисунка 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Внеклеточные везикулы Микобактерии туберкулеза являются высокоантигенными резервуарами, что представляет их в качестве привлекательного направления для разработки диагностических инструментов и будущих вакцин 4,19,20. Исторически сложилось так, что ультрацентрифугирование градиента плотности использовалось для отделения mtb EV от другого растворимого, секретируемого материала8. Хотя этот процесс эффективен, он также занимает много времени, технически сложен и может повлиять на целостность полученных препаратов EV 9,10. Представленный протокол предлагает альтернативный метод для препаратов Mtb EV с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC).
Есть несколько критических моментов для успеха в этом методе. Первоначальная подготовка Mtb CFP будет влиять на качество и выход везикул после SEC. Рекомендуется собирать CFP в середине фазы роста или до нее, чтобы ограничить уровень клеточного лизиса во время сбора урожая. Поздние и стационарные культуры фазы роста могут содержать более высокие уровни лизиса клеток и могут привести к идентификации внутриклеточных белков и артефактных EV-подобных структур, спонтанно генерируемых из фрагментов мембраны лизированных клеток, как значительного вкладчика в собранный CFP 12,13,14 . Это должно быть оценено до начала этого протокола, поскольку мембранные везикулы из лизированных клеток будут совместно очищаться с секретируемыми Mtb EV и потенциальными искаженными последующими анализами. Во время ультрафильтрации необходимо соблюдать осторожность, чтобы гарантировать, что фильтрующая мембрана остается неповрежденной и влажной. Повреждение фильтра может привести к протеканию нужного материала. Включение оригинальных CFP, 100R и 100F на последующие оценки качества поможет в оценке целостности ультрафильтрации.
Правильная настройка и мойка колонны SEC необходимы для подготовки ev высочайшего качества. Всегда следуйте инструкциям пользователя для настройки и удаления. Во время сбора фракций убедитесь, что AFC не ударяется и не перемещается, так как это может прервать процесс и привести к пропущенным или непоследовательным фракциям. Антитела, используемые для квалификации, будут зависеть от последующего применения обогащенных везикул и должны включать маркер, который, как ожидается, будет в Mtb EV (LpqH) и маркер, обнаруженный в CFP, но не обогащенный Mtb EV (GroES). Одним из ограничений методов, представленных здесь, является потенциальная вариация в соответствующих белковых элементах управления. Этот протокол был разработан с использованием стандартных методов культивирования. Работа, выполненная с Mycobacterium avium , показала, что уровни шаперонинов, таких как GroES, изменяются в CFP и EV на основе среды, используемой для роста21. По мере появления дополнительной информации о микобактериальном составе EV может потребоваться корректировка конкретного отрицательного контрольного маркера.
Наконец, все процедуры количественной оценки и квалификации, а также последующие заявки должны выполняться быстро. Если требуется хранение материала, рекомендуется 4 °C над замораживанием, чтобы предотвратить нарушение целостности пузырьков во время процесса замораживания-оттаивания. Если замораживание выполняется, аликвотируйте материал, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. Обогащенные электромобили должны быть переоценены как количественно, так и качественно, если между первоначальной оценкой и использованием проходит значительное количество времени.
Этот метод эффективно обогащает Mtb EV, и существует гибкость для адаптации к другим микобактериям. При адаптации этой процедуры к другим организмам, убедитесь, что стартовая культура имеет ограниченный клеточный лизис. Количество материала, загруженного на колонну, должно быть отрегулировано, так как кинетика высвобождения EV будет варьироваться. Не превышать максимальную концентрацию белка 7 г на 100 мл исходя из спецификаций производителя. Также необходимо оценивать каждую фракцию индивидуально на наличие EV-ассоциированных маркеров и загрязняющих веществ. Концентрация белка и данные NTA могут вводить в заблуждение при оптимизации метода: очень низкая концентрация белка не означает отсутствие везикул в этих фракциях. Кроме того, изменение столбцов SEC и параметров коллекции дробей позволяет пользователю масштабировать протокол на основе входных и последующих приложений. Ограничения этого метода включают в себя стоимость АФК и расходных материалов, разбавленный выход и, как упоминалось ранее, разработку и оптимизацию схемы объединения фракций. В то время как ультрацентрифугирование с градиентом плотности имеет свои преимущества и, возможно, более применимо для определенных экспериментов, обогащение электромобилей Mtb с помощью SEC сопоставимо по качеству и превосходит по доступу и простоте использования, как представлено здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность NKG за поддержку со стороны Колледжа ветеринарной медицины и биомедицинских наук и Совместной исследовательской программы Исследовательского совета колледжа для NKG и финансирование ATCC (награда No 2016-0550-0002) KMD. Мы также хотели бы поблагодарить Энн Симпсон за техническую поддержку и BEI Resources, NIAID, NIH за следующие реагенты: Моноклональные антимикобактерии туберкулеза LpqH (ген Rv3763), IT-54 (производится in vitro), NR-13792, моноклональные антимикобактерии туберкулеза GroES (ген Rv3418c), клон IT-3 (SA-12) (производится in vitro), NR-49223 и моноклональные антимикобактерии туберкулеза LAM, клон CS-35 (производится в пробирке), NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
