Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Größenausschlusschromatographie, eine einfache und reproduzierbare Technik zur Anreicherung von Mycobacterium tuberculosis extrazellulären Vesikeln aus Kulturüberständen.
Abstract
Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EVs) im Zusammenhang mit bakteriellen Infektionen hat sich als neuer Weg zum Verständnis der mikrobiellen Physiologie herauskristallisiert. Insbesondere Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EVs spielen eine Rolle bei der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserregern und der Reaktion auf Umweltstress. Mtb EVs sind auch stark antigen und zeigen Potenzial als Impfstoffkomponenten. Die gebräuchlichste Methode zur Reinigung von Mtb-EVs ist die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Dieser Prozess hat mehrere Einschränkungen, einschließlich geringem Durchsatz, geringer Ausbeute, Abhängigkeit von teurer Ausrüstung, technischen Herausforderungen und kann sich negativ auf die resultierende Vorbereitung auswirken. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist eine sanftere alternative Methode, die viele der Einschränkungen der Ultrazentrifugation bekämpft. Dieses Protokoll zeigt, dass SEC für die Mtb EV-Anreicherung wirksam ist und qualitativ hochwertige Mtb EV-Präparate mit erhöhtem Ertrag auf schnelle und skalierbare Weise produziert. Darüber hinaus zeigt ein Vergleich mit der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation durch Quantifizierungs- und Qualifizierungsverfahren die Vorteile von SEC. Während die Bewertung der EV-Menge (Nanopartikel-Tracking-Analyse), des Phänotyps (Transmissionselektronenmikroskopie) und des Inhalts (Western Blotting) auf Mtb-EVs zugeschnitten ist, kann der bereitgestellte Workflow auf andere Mykobakterien angewendet werden.
Introduction
Die Freisetzung extrazellulärer Vesikel (EV) durch Krankheitserreger kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Technologien zur Bekämpfung von Infektionskrankheitensein 1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist ein Erreger von hoher Tragweite, der etwa ein Drittel der Weltbevölkerung infiziert und jedes Jahr Millionen von Menschen das Leben fordert2. Die EV-Produktion durch Mtb ist gut dokumentiert, aber schwer fassbar in der Biogenese und den verschiedenen Rollen (d.h. immunstimulierend, immunsuppressiv, Eisen- und Nährstoffakquisition) dieser EVs im Zusammenhang mit der Infektion 3,4,5. Bemühungen, die Zusammensetzung von Mtb-EVs zu verstehen, zeigten 50-150 nm Lipidmembran-umschlossene Kugeln, die aus der Plasmamembran stammen, die Lipide und Proteine von immunologischer Bedeutung enthält 3,6. Die Untersuchung der Rolle von Mtb-EVs in der bakteriellen Physiologie hat die Bedeutung der bakteriellen EV-Modulation als Reaktion auf Umweltstress für das Überlebengezeigt 5. Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien waren komplizierter zu interpretieren, aber es gibt Hinweise darauf, dass Mtb-EVs die Immunantwort des Wirts beeinflussen können und möglicherweise als wirksame Impfkomponentedienen können 3,4,7.
Die meisten Studien an Mtb-EVs haben sich bisher auf die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation für die Vesikelanreicherungverlassen 8. Dies hat sich für kleine Studien als wirksam erwiesen; Diese Technik hat jedoch mehrere technische und logistische Herausforderungen. Alternative Workflows koppeln die mehrstufige Zentrifugation zur Entfernung ganzer Zellen und großer Ablagerungen mit einem abschließenden Ultrazentrifugationsschritt zur Pelletierung von Elektrofahrzeugen. Diese Methodik kann in ihrer Effizienz variieren und führt oft zu einer geringen Ausbeute und Mitreinigung löslicher nicht-vesikelassoziierter Biomoleküle und beeinflusst gleichzeitig die Vesikelintegrität9. Darüber hinaus ist dieser Prozess zeitaufwändig, manuell intensiv und aufgrund von Gerätebeschränkungen sehr begrenzt im Durchsatz.
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine alternative Technik zur Dichtegradienten-Ultrazentrifugation: die Größenausschlusschromatographie (SEC). Diese Methode wurde für Umweltmykobakterien demonstriert und in der aktuellen Arbeit auf Mtb10 extrapoliert. Eine handelsübliche Säule und ein automatischer Fraktionssammler können die Konsistenz bei der vesikalen Vorbereitung verbessern und die Notwendigkeit für spezifische, teure Geräte reduzieren. Es ist auch möglich, dieses Protokoll in einem Bruchteil der Zeit im Vergleich zur Dichtegradienten-Ultrazentrifugation abzuschließen, wodurch der Durchsatz erhöht wird. Diese Technik ist technisch weniger anspruchsvoll, was die Beherrschung erleichtert und die Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb des Labors erhöhen kann. Schließlich hat SEC eine hohe Abscheideeffizienz und ist schonend, wobei die Integrität der Vesikel erhalten bleibt.
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Protocol
Das Institutional Biosafety Committee der Colorado State University genehmigte die vorliegende Studie (19-046B). Die Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis und die Ernte von EV-reichen Kulturüberständen wurden von geschultem Personal in einem High-Containment-Labor durchgeführt. Die Materialien wurden aus dem High-Containment-Bereich entfernt, nachdem eine gültige Inaktivierungsmethode durchgeführt, bestätigt und durch institutionelle Biosicherheitsrichtlinien genehmigt wurde. Während der Replikation des Protokolls, wenn eine validierte Inaktivierungs- oder Sterilfiltrationsmethode nicht möglich ist, müssen die folgenden Verfahren in einem High-Containment-Labor durchgeführt werden.
1. Herstellung von rohem Mtb EV-Konzentrat
HINWEIS: Für detaillierte Verfahren zum Anbau von Mtb und zur Herstellung von Kulturfiltratprotein (CFP) siehe Referenzen11,12. Es wird empfohlen, dass bakterielle Kulturmedien frei von Wachstumspräparaten mit EV-haltigen oder proteinhaltigen Komponenten wie Öl-Albumin-Dextrose-Katase (OADC) und Reinigungsmitteln wie Tween sind. Es wird auch empfohlen, die Qualität der Bakterienkultur und die geerntete CFP zu untersuchen, um einen begrenzten Zelltod und eine begrenzte Lyse zu gewährleisten13,14.
- Bereiten Sie einen 100 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Zentrifugalfilter (MWCO) vor (siehe Materialtabelle), indem Sie die volle Volumenkapazität von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) hinzufügen. Zentrifuge für 5 min bei 2.800 x g bei 4 °C.
HINWEIS: Wenn Sie einen Filter ohne Totstoppvolumen verwenden, muss darauf geachtet werden, dass das Probenvolumen nicht unter den Filterpegel sinkt, was zu einer vollständigen Filtertrocknung während der Zentrifugation führt. - Verwerfen Sie den Durchfluss und alle verbleibenden PBS, bevor Sie die Probenkammer mit Mtb CFP bis zu ihrer maximalen Kapazität füllen. Zentrifen Sie bei 2.800 x g bei 4 °C, bis sich das Volumen auf das Mindestvolumen der Ultrafiltrationsvorrichtung reduziert hat. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, und fügen Sie der Einheit mehr CFP hinzu, bis die gesamte Probe ausreichend reduziert wurde.
HINWEIS: Behalten Sie bei Bedarf einen Teil des 100-kDa-Durchflussmaterials (100 F) für die nachgelagerte Qualifizierung bei. Bei 4 °C lagern. - Geben Sie 1x PBS zu der Filtereinheit, die das Konzentrat enthält, bis zur Gesamtkapazität des Geräts. Verringern Sie die Lautstärke wie in 1.2 beschrieben. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal, um eine vollständige Wäsche und einen vollständigen Pufferaustausch sicherzustellen.
- Rückgewinnung des 100 kDa konzentrierten CFP-Retentats (100R) gemäß den Spezifikationen der Ultrafiltrationsgeräte (siehe Materialtabelle). Sobald der 100R wiederhergestellt ist, waschen Sie den Filter mit einem minimalen Volumen von 1x PBS mindestens dreimal und legen Sie die Wäsche mit dem 100R zusammen, um die Ausbeute zu maximieren.
- Quantifizieren Sie das 100R-Material mit einem bicinchoninischen Assay (BCA) gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Um den Assay durchzuführen, verwenden Sie mehrere Verdünnungen der Proben 1:2, 1:5 und 1:10 in PBS. Testen Sie die Probe in dreifacher Ausfertigung.
HINWEIS: Bewahren Sie bei Bedarf einen Teil des 100R-Materials für die nachgelagerte Qualifizierung auf. Bei 4 °C lagern.
2. Größenausschlusschromatographie zur Anreicherung von Mtb EVs aus CFP
HINWEIS: Das folgende Verfahren ist spezifisch für die Verwendung von 3 mg 100R Mtb CFP mit SEC-Säule und automatischem Fraktionssammler (AFC, siehe Materialtabelle). Es kann für andere Startkonzentrationen und Säulentypen angepasst werden, indem es den Herstellerangaben folgt. Darüber hinaus wird den Benutzern empfohlen, das Benutzerhandbuch für den automatischen Fraktionssammler zu lesen und zu verstehen.
- Lassen Sie die SEC-Spalte auf Raumtemperatur ausgleichen.
- Schalten Sie den AFC über den Netzschalter auf der Rückseite der Tower-Einheit ein und passen Sie die Einstellungen für die Wägezelle bei Bedarf an, indem Sie SETUP auf dem Touchscreen des Hauptmenüs drücken. Die Wägezelle muss nur bei der ersten Verwendung, nach jedem Software-Update und wenn Inkonsistenzen in den Bruchstückzahlen festgestellt werden, kalibriert werden.
- Richten Sie das Karussell im Bildschirm SETUP aus, indem Sie KARUSSELL > CALIBRATE auswählen. Setzen Sie das Karussell mit den 13 kleinen Löchern nach oben in den AFC-Turm ein und stellen Sie das Karussell so ein, dass sich die Flüssigkeitsdüse direkt über der bündigen Position befindet, indem Sie die Tasten - und/oder + drücken.
- Entfernen Sie die Kappen aus der gleichgewichteten SEC-Spalte. Schieben Sie die SEC-Säule in die entsprechende Säulenhalterung und installieren Sie sie vorsichtig auf dem AFC-Tower. Stellen Sie sicher, dass das RFID-Tag (Radio Frequency Identification) auf der Säule dem AFC zugewandt ist, und überprüfen Sie, ob die Verbindung zwischen der Säule und dem Ventil sicher ist. Legen Sie den Abfallauslassschlauch in einen Sammelbehälter.
- Wählen Sie auf dem Bildschirm SETUP die Option Abholzeitplan aus, und legen Sie die Anzahl auf 13 und die Größe auf 0,5 ml fest, indem Sie die Tasten - und/oder + drücken. Lassen Sie die Einstellung "Puffervolumen" als Standard von 2,7 ml und schließen Sie dann das Fenster "Sammlungszeitplan" durch Drücken von X.
- Wählen Sie auf dem Startbildschirm SAMMLUNG starten und bestätigen Sie die Sammlungsparameter durch Auswahl von JA. Laden Sie 13 beschriftete 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geöffneten Deckeln und zeigen Sie auf die Karussellmitte.
- Bewegen Sie den AFC vor, indem Sie OK auswählen, montieren Sie dann das Säulenreservoir und fahren Sie erneut vor, indem Sie OK drücken. Wählen Sie die Option zum Leeren der Spalte durch Drücken von JA und fügen Sie ein Spaltenvolumen von 0,2 μm gefiltertem PBS hinzu, um Speicherpuffer zu entfernen. Sobald die Spülung abgeschlossen ist, bewegen Sie den AFC voran, indem Sie OK drücken.
- Legen Sie die Karussellabdeckung über den AFC und drücken Sie OK. Bereiten Sie ein Spaltenvolumen von 0,2 μm gefiltertem PBS vor. Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssigen Puffer aus der Spalte zu entfernen.
- Bringen Sie 3 mg 100R-Probe, wie in Schritt 1,5 bis 500 μL mit 1x PBS quantifiziert. Fügen Sie die 3-mg-Probe oben in der Spalte hinzu. Bewegen Sie den AFC vor, und lassen Sie die Probe in die Fritte laufen. Sobald die Probe vollständig in die Spalte eingedrungen ist, fügen Sie den in Schritt 2.6 vorbereiteten PBS dem Reservoir hinzu.
- Überwachen Sie den Lauf des AFC, während er zuerst das Void-Volume und dann die angegebenen Brüche sammelt. Nachdem der Lauf beendet ist und das Karussell in die Abfallposition zurückkehrt, entfernen Sie die Abdeckung und entfernen Sie die Fraktionsrohre vom Karussell. Lagern Sie die Fraktionen vor der Quantifizierung (Schritt 3) und Qualifizierung (Schritt 4) bei 4 °C.
- Wenn die Spalte wiederverwendet werden soll, wählen Sie die Option zum Bereinigen der Spalte aus, indem Sie JA drücken. Andernfalls drücken Sie NO. Folgen Sie den Anweisungen auf der AFC.
HINWEIS: Sobald die Säule gewaschen ist und der Speicherpuffer durchgelaufen ist, kann sie entfernt, gekappt und bei 4 °C gelagert werden.
3. Quantifizierung der MTB EVs
- Messen Sie die Proteinkonzentration für jede Fraktion mit BCA und Mikro-BCA12.
- Für 0,5 ml Fraktionen, die aus 3 mg 100R Mtb CFP gewonnen wurden, verwenden Sie den Mikro-BCA mit einer 1:3-Verdünnung für Fraktionen, die 1-7 jeder Probe dreifach nummeriert sind.
- Verwenden Sie für 0,5 ml-Fraktionen mit den Nummern 5-13 den BCA ohne Verdünnung für jede Probe in dreifacher Ausfertigung.
HINWEIS: Die Überlappung der Assays für die Fraktionen 5-7 trägt dazu bei, dass alle Fraktionen eine lesbare Ausgabe haben.
- Quantifizieren Sie die Partikelkonzentration für jede Fraktion mithilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA).
- Verdünnen Sie die Proben in 1 ml von 1x PBS unter Verwendung der folgenden vorgeschlagenen Startverhältnisse; Verwenden Sie für die Brüche 1-3 1:100 und dann für die restlichen Brüche eine 1:10-Verdünnung.
- Wirbeln Sie die verdünnten Lösungen vor und ziehen Sie dann die Probe in eine 1-ml-Einwegspritze. Stellen Sie die Spritze in einer automatischen Spritzenpumpe ein, falls verfügbar.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe auf 30 μL/min ein und verwenden Sie die Videoaufnahmeeinstellungen mit einer Bildschirmverstärkung von 10-12 und einem Kamerapegel von 10-12. Passen Sie den Fokus für jede Probe an.
- Sammeln Sie mindestens drei Videos zu je 30 s mit einem konstanten Fluss.
- Führen Sie die Analyse durch, wenn der Softwareerkennungsschwellenwert auf fünf festgelegt ist.
HINWEIS: Es ist möglicherweise nicht möglich, NTA-Daten für die neuesten Fraktionen (>7) zu erhalten, ohne ein signifikantes Probenvolumen zu opfern.
4. Qualifizierung von Mtb EVs
- Visualisieren Sie das allgemeine Proteinprofil jeder Fraktion mit einem silbergefärbten Proteingel.
HINWEIS: Detaillierte Verfahren für SDS-PAGE und Silberflecken finden Sie in Referenz15.- Fügen Sie SDS-Probenpuffer zu 10 μL jeder Fraktion und 5 μg CFP, 100R und 100F hinzu. 5 min bei 100 °C kochen, dann auf ein 4%-12% Bis-Tris Gel mit einer Molekulargewichtsleiter für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) (siehe Materialtabelle) laden.
- Lassen Sie das Gel mit 1x 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES) laufendem Puffer (siehe Materialtabelle) und einem 200 V Strom für 35 min laufen.
- Entfernen Sie das Gel von der Kassette und fahren Sie mit der Silberfärbung15 fort.
- Bewerten Sie das Vorhandensein oder Fehlen von EV-Markern in jedem Bruchteil durch Western Blot.
HINWEIS: Detaillierte Verfahren für Western Blotting finden Sie in Referenz15.- Führen Sie ein SDS-PAGE-Gel wie in den Schritten 4.1.1-4.1.2 beschrieben aus.
- Entfernen Sie das Gel von der Kassette und übertragen Sie die aufgelösten Proteine auf eine 0,2 μm Nitrocellulosemembran (siehe Materialtabelle), indem Sie einen 50-V-Strom für mindestens 1 h anlegen.
- Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um Proteine von Interesse zu bewerten. Primäre Antikörper gegen LpqH, Lipoarabinomannan (LAM) und GroES (siehe Materialtabelle) werden empfohlen.
- Pool-Fraktionen basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen von Markern, die für die nachgeschaltete Anwendung anwendbar sind.
- Bestätigen Sie das Vorhandensein intakter Vesikel durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
- Fixieren Sie 15 μL der Vesikelprobe durch Zugabe von 15 μL Paraformaldehyd in EM-Qualität und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C.
- Bereiten Sie ein 200-Mesh-Formvar-Carbon-beschichtetes Kupfer-TEM-Gitter vor, indem Sie die Oberfläche reinigen und ein hydrophiles Substrat herstellen.
HINWEIS: Eine Plasmareinigung mit 95% Argon, 5% Sauerstoff und 30% Plasmaleistung für 1 min wird empfohlen. - Lassen Sie 10 μL der festen Probe auf das Gitter fallen und lassen Sie die Probe 10 Minuten anhaften, dann tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier ab.
- Schwimmen Sie das Gitter 30 s lang auf einem Tropfen Reinstwasser und tupfen Sie dann überschüssige Flüssigkeit ab.
- Lassen Sie das Gitter auf einem d% EM-Uranylacetat-Tropfen für 2 Minuten schweben und tupfen Sie dann die überschüssige Flüssigkeit ab.
- Lassen Sie das Gitter vollständig an der Luft trocknen.
- Bild mit einem TEM (siehe Materialverzeichnis) bei 100 kV oder ähnlichem.
HINWEIS: Andere EV-Quantifizierungs- und Charakterisierungsmethoden sollten basierend auf nachgelagerten Anwendungen verwendet werden. Die Minimalinformationen für Studien an extrazellulären Vesikeln18 sollten als Leitlinien konsultiert werden, um die Strenge und Reproduzierbarkeit aller EV-Studien zu gewährleisten.
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Representative Results
Kulturfiltratprotein (CFP) aus Mycobacterium tuberculosis (Mtb) wurde konzentriert, quantifiziert und dann 3 mg Material auf eine SEC-Säule (Size Exclusion Chromatography) aufgetragen. Die Protein- und Partikelkonzentrationen wurden von BCA bzw. NTA aufgezählt. Die erwarteten Bereiche für die Protein- und Partikelrückgewinnung sowie die genauen Werte, die für diese Ergebnisse erhalten wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Werte, die viel höher als diese Bereiche sind, können auf Verunreinigungen oder Spaltenintegritätsprobleme hinweisen. Deutlich niedrigere Werte weisen auf Probleme in den Ultrafiltrationsschritten hin, und daher muss der Durchfluss mit dem startenden CFP und 100R verglichen werden, um festzustellen, ob eine erfolgreiche Konzentration aufgetreten ist. Ein unspezifischer Proteinsilberfleck zeigt, dass spätere Fraktionen mehr Protein enthalten und dem 100R-Material ähneln (Abbildung 1).
Westliche Flecken der Fraktionen zeigen, dass Lipoarabinomannan (LAM) in den Fraktionen vorhanden ist, wobei spätere Fraktionen eine Bandenbildung mit geringerer Intensität zeigen (Abbildung 2A, ergänzende Abbildung 1). Das 19-kDa-Lipoprotein LpqH, von dem bekannt ist, dass es in Mtb-EVs 3,19 vorhanden ist, ist in den frühesten Fraktionen aus der SEC angereichert (Abbildung 2B, ergänzende Abbildung 1). Das 10-kDa-Chaperonin-Protein GroES fehlt in den frühesten Fraktionen der SEC (Abbildung 2C, ergänzende Abbildung 1); Dieser Befund stimmt mit zuvor veröffentlichten Studien über GroES als Verunreinigung während der Mtb EV-Anreicherung12 überein und dient als Negativkontrolle für die Anwesenheit von Mtb EV. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt das Vorhandensein geschlossener, membrangebundener Vesikel (Abbildung 3A). Ein Vergleich der durch Dichtegradientenultrafiltration getrennten Mtb-EVs und dieser SEC-Methode ist in Tabelle 2 dargestellt. SEC bietet eine höhere Protein- und Partikelrückgewinnung für drei technische Replikate aus derselben CFP. Diese Ergebnisse waren über mehrere CFP-Chargen hinweg konsistent (Daten nicht gezeigt). Beide Methoden führen zu geschlossenen, membrangebundenen Vesikeln im erwarteten Größenbereich, wie TEM (Abbildung 3) und NTA (Abbildung 4) zeigen.
Insgesamt zeigen diese Daten eine Anreicherung von Mtb-EVs in den frühen SEC-Fraktionen. Die höchsten NTA-Werte treten in den Fraktionen 1-3 auf, und der Proteingehalt steigt mit steigender Fraktionszahl, was auf die Trennung von löslichen Proteinen von den EVs hinweist (Tabelle 1). Da Fraktion 4 Hinweise auf GroES enthält (Abbildung 2C, ergänzende Abbildung 1), wurde diese Fraktion nicht in das gepoolte Material für TEM aufgenommen. Je nach nachgelagerter Anwendung muss die Aufnahme oder der Ausschluss bestimmter Fraktionen für die Pooling-Strategie berücksichtigt werden.
Abbildung 1: Silberfleck nach Bruchteil. Ein mit Silber angefärbtes SDS-PAGE-Gel zeigt das Gesamtproteinprofil für jede Fraktion. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg von 100R, 100F = 5 μg von 100F, 1-11 = 10 μL von SEC Fraktionen 1-11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Western Blots nach Bruchteil Western Blots erkennen (A) LAM, (B) LpqH und (C) GroES und zeigen Proteinmarkerveränderungen in den Fraktionen. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg von 100R, 100F = 5 μg von 100F, 1-11 = 10 μL von SEC Fraktionen 1-11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Bilder der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). (A) SEC-Fraktionen 1-3, die vor der Fixierung gepoolt wurden. (B) Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation von Mtb-EVs wurde für die TEM-Bildgebung negativ gefärbt. Maßstabsstäbe = 200 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Verteilung der Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). (A) SEC-Fraktionen 1-3. (B) Die Mtb-EVs der Dichtegradientenultrazentrifugation wurden mit einer Nanopartikel-Tracking-Analyse analysiert. Die Größenverteilung wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Bruch | Protein-Recovery-Bereich (μg/μL) | Partikelrückgewinnungsbereich (pro μL) | Ergebnis Proteinrückgewinnung (μg/μL) | Ergebnis Partikelrückgewinnung (pro μL) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1E8 bis 3E8 | 0.013 | 1,60E+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2E8 - 4E8 | 0.026 | 2,10E+08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2E7 bis 6E7 | 0.024 | 5,20E+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7E6 bis 2E7 | 0.032 | 1,30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1E6 bis 5E6 | 0.053 | 4.20E+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1E6 bis 5E6 | 0.099 | 5.20E+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1E6 - 3E6 | 0.234 | 2,70E+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1E6 bis 4E6 | 0.398 | 4.20E+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1E6 - 3E6 | 0.543 | 4.10E+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1E6 - 3E6 | 0.661 | 1,70E+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1E6 - 3E6 | 0.736 | 1,40E+06 |
Tabelle 1: Protein- und Partikelrückgewinnung nach Fraktionen. Erwarteter Protein- und Partikelrückgewinnungsbereich pro Fraktion basierend auf 3 mg Ausgangsmaterial. Die genauen Werte für die Beschaffung des in dieser Studie verwendeten Materials sind in den beiden Spalten ganz rechts aufgeführt.
| Anreicherungsmethode | Gesamtes zurückgewonnenes Protein (μg) | Insgesamt zurückgewonnene Partikel |
| Dichtegradienten-Ultrazentrifugation | 3.14 | 1,82E+10 |
| 3.88 | 1,93E+10 | |
| 3.20 | 1,65E+10 | |
| Größenausschlusschromatographie F1-3 | 12.96 | 4,05E+10 |
| 14.14 | 4,15E+10 | |
| 14.74 | 4,35E+10 |
Tabelle 2: Methodenvergleich der Protein- und Partikelrückgewinnung. Proteinausbeute gemessen mit BCA und Gesamtpartikelzahl, gemessen durch NTA für Mtb EVs, die aus 3 mg desselben 100R-Ausgangsmaterials stammen, angereichert mit der referenzierten Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsmethode 8 oder dieserSEC-Methode (dreifach).
Ergänzende Abbildung 1: Original Western Blots (unbeschnitten) aus Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Mycobacterium tuberculosis extrazelluläre Vesikel sind stark antigene Reservoirs, die sie als attraktiven Weg für die Entwicklung von Diagnosewerkzeugen und zukünftigen Impfstoffendarstellen 4,19,20. In der Vergangenheit wurde die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet, um Mtb-EVs von anderem löslichen, sezernierten Materialzu trennen 8. Während dieser Prozess effektiv ist, ist er auch zeitaufwendig, technisch anspruchsvoll und kann die Integrität der resultierenden EV-Präparate beeinträchtigen 9,10. Das vorgestellte Protokoll bietet eine alternative Methode für Mtb EV-Präparate durch Größenausschlusschromatographie (SEC).
Es gibt mehrere kritische Punkte für den Erfolg dieser Methode. Die anfängliche Mtb CFP-Vorbereitung wird die Qualität und Ausbeute der Vesikel nach der SEC beeinflussen. Es wird empfohlen, CFP in oder vor der Mid-Log-Phase des Wachstums zu ernten, um das Niveau der zellulären Lyse zum Zeitpunkt der Ernte zu begrenzen. Late-Log- und stationäre Wachstumsphasenkulturen können höhere Zelllysegrade enthalten und zur Identifizierung von intrazellulären Proteinen und künstlichen EV-ähnlichen Strukturen, die spontan aus den Membranfragmenten der lysierten Zellen erzeugt werden, als signifikanter Beitrag zum gesammelten CFPführen 12,13,14 . Dies sollte vor Beginn dieses Protokolls bewertet werden, da Membranvesikel aus lysierten Zellen mit sezernierten Mtb-EVs und potenziellen nachgelagerten Analysen mitreinigen. Bei der Ultrafiltration muss darauf geachtet werden, dass die Filtermembran intakt und nass bleibt. Schäden am Filter können dazu führen, dass gewünschtes Material durchfließt. Die Einbeziehung der ursprünglichen CFP, 100R und 100F bei nachgelagerten Qualitätsbewertungen wird bei der Bewertung der Integrität der Ultrafiltration helfen.
Die richtige Einrichtung und das Waschen der SEC-Säule sind für die hochwertigste EV-Vorbereitung erforderlich. Befolgen Sie immer die Benutzerhandbücher für Setup und Takedown. Während Brüche gesammelt werden, stellen Sie sicher, dass der AFC nicht gestoßen oder bewegt wird, da dies den Prozess unterbrechen und zu übersprungenen oder inkonsistenten Brüchen führen kann. Die für die Qualifizierung verwendeten Antikörper hängen von der nachgeschalteten Anwendung der angereicherten Vesikel ab und sollten einen Marker enthalten, der voraussichtlich in Mtb EVs (LpqH) enthalten ist, und einen Marker, der in CFP gefunden, aber nicht in Mtb EVs (GroES) angereichert ist. Eine Einschränkung der hier vorgestellten Methoden ist die potenzielle Variation geeigneter Proteinkontrollen. Dieses Protokoll wurde unter Verwendung von Standard-Anbaumethoden entwickelt. Arbeiten, die mit Mycobacterium avium durchgeführt wurden, deuteten darauf hin, dass sich der Gehalt an Chaperoninen wie GroES in CFP und EVs basierend auf dem für das Wachstum verwendeten Medium ändert21. Wenn mehr Informationen über die Zusammensetzung der mykobakteriellen EV auftauchen, kann eine Anpassung des spezifischen Negativkontrollmarkers erforderlich sein.
Schließlich sollten alle Quantifizierungs- und Qualifizierungsverfahren und nachgelagerten Anwendungen schnell durchgeführt werden. Wenn eine Materiallagerung erforderlich ist, werden 4 °C über dem Einfrieren empfohlen, um eine Störung der Vesikelintegrität während des Gefrier-Tau-Prozesses zu vermeiden. Wenn das Einfrieren durchgeführt wird, aliquotieren Sie das Material, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Angereicherte Elektrofahrzeuge sollten sowohl quantitativ als auch qualitativ neu bewertet werden, wenn zwischen der ersten Bewertung und der Verwendung eine erhebliche Zeit vergeht.
Diese Methode bereichert Mtb EVs effektiv und es besteht Flexibilität für die Anpassung an andere Mykobakterien. Wenn Sie dieses Verfahren für andere Organismen anpassen, stellen Sie sicher, dass die Ausgangskultur eine begrenzte zelluläre Lyse aufweist. Die Menge an Material, die auf die Säule geladen wird, sollte angepasst werden, da die Kinetik der EV-Freigabe variiert. Überschreiten Sie nicht eine maximale Proteinkonzentration von 7 g pro 100 ml basierend auf den Angaben des Herstellers. Es ist auch notwendig, jede Fraktion einzeln auf das Vorhandensein von EV-assoziierten Markern und Verunreinigungen zu bewerten. Proteinkonzentrations- und NTA-Daten können bei der Methodenoptimierung irreführend sein: Eine sehr niedrige Proteinkonzentration bedeutet nicht, dass in diesen Fraktionen keine Vesikel vorhanden sind. Darüber hinaus ermöglicht das Ändern von SEC-Spalten und Bruchsammlungsparametern dem Benutzer, das Protokoll basierend auf Eingabe- und Downstream-Anwendungen zu skalieren. Zu den Einschränkungen dieser Methode gehören die Kosten für den AFC und die Verbrauchsmaterialien, die verdünnte Leistung und, wie bereits erwähnt, die Entwicklung und Optimierung des Fraktionspooling-Schemas. Während die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ihre Vorteile hat und vielleicht für bestimmte Experimente besser anwendbar ist, ist die Anreicherung von Mtb-EVs durch SEC in der Qualität vergleichbar und überlegen in Zugang und Benutzerfreundlichkeit, wie hier dargestellt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir möchten uns für die Unterstützung des College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award und des College Research Council Shared Research Program für NKG und die Finanzierung durch ATCC (Award # 2016-0550-0002) für KMD bedanken. Wir möchten auch Anne Simpson für die technische Unterstützung und BEI Resources, NIAID, NIH für die folgenden Reagenzien danken: Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gen Rv3763), IT-54 (produziert in vitro), NR-13792, Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produziert in vitro), NR-49223 und Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produziert in vitro), NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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