Summary
Questo protocollo descrive la cromatografia di esclusione dimensionale, una tecnica facile e riproducibile per arricchire le vescicole extracellulari del Mycobacterium tuberculosis dai supernatanti di coltura.
Abstract
Il ruolo delle vescicole extracellulari (EV) nel contesto dell'infezione batterica è emerso come una nuova strada per comprendere la fisiologia microbica. In particolare, i veicoli elettrici Mycobacterium tuberculosis (Mtb) svolgono un ruolo nell'interazione ospite-patogeno e nella risposta allo stress ambientale. I veicoli elettrici Mtb sono anche altamente antigenici e mostrano un potenziale come componenti del vaccino. Il metodo più comune per purificare i veicoli elettrici Mtb è l'ultracentrifugazione del gradiente di densità. Questo processo presenta diverse limitazioni, tra cui bassa produttività, bassa resa, dipendenza da attrezzature costose, sfide tecniche e può avere un impatto negativo sulla preparazione risultante. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è un metodo alternativo più delicato che combatte molte delle limitazioni dell'ultracentrifugazione. Questo protocollo dimostra che SEC è efficace per l'arricchimento Mtb EV e produce preparazioni Mtb EV di alta qualità di maggiore resa in modo rapido e scalabile. Inoltre, un confronto con l'ultracentrifugazione del gradiente di densità mediante procedure di quantificazione e qualificazione dimostra i vantaggi della SEC. Mentre la valutazione della quantità ev (analisi del tracciamento delle nanoparticelle), del fenotipo (microscopia elettronica a trasmissione) e del contenuto (Western blotting) è adattata ai veicoli elettrici Mtb, il flusso di lavoro fornito può essere applicato ad altri micobatteri.
Introduction
Il rilascio di vescicole extracellulari (EV) da parte di agenti patogeni può essere la chiave per sbloccare nuove tecnologie per controllare le malattie infettive1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è un agente patogeno di alta conseguenza, che infetta circa un terzo della popolazione mondiale e reclama la vita di milioni di persone ogni anno2. La produzione di VEICOLI ELETTRICI da parte di Mtb è ben documentata ma sfuggente nella biogenesi e nei vari ruoli (cioè immunostimolante, immunosoppressiva, ferro e acquisizione di nutrienti) di questi veicoli elettrici nel contesto dell'infezione 3,4,5. Gli sforzi per comprendere la composizione dei veicoli elettrici Mtb hanno rivelato sfere chiuse con membrana lipidica a 50-150 nm derivate dalla membrana plasmatica contenenti lipidi e proteine di significato immunologico 3,6. Lo studio del ruolo dei veicoli elettrici Mtb nella fisiologia batterica ha rivelato l'importanza della modulazione batterica ev in risposta allo stress ambientale per la sopravvivenza5. Gli studi di interazione ospite-patogeno sono stati più complicati da interpretare, ma le prove indicano che i veicoli elettrici Mtb possono influenzare la risposta immunitaria dell'ospite e possono potenzialmente servire come componente di vaccinazione efficace 3,4,7.
La maggior parte degli studi sui veicoli elettrici Mtb finora si sono basati sull'ultracentrifugazione del gradiente di densità per l'arricchimento dellevescicole 8. Questo è stato efficace per studi su piccola scala; tuttavia, questa tecnica presenta diverse sfide tecniche e logistiche. Flussi di lavoro alternativi accoppiano la centrifugazione multistep, per la rimozione di intere celle e detriti di grandi dimensioni, con una fase finale di ultracentrifugazione ai veicoli elettrici a pellet. Questa metodologia può variare in termini di efficienza e spesso si traduce in una bassa resa e co-purificazione di biomolecole solubili non associate alle vescicole, influenzando anche l'integrità dellevescicole 9. Inoltre, questo processo richiede molto tempo, richiede un uso manuale e un throughput molto limitato a causa dei vincoli delle apparecchiature.
Il presente protocollo descrive una tecnica alternativa all'ultracentrifugazione a gradiente di densità: la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). Questo metodo è stato dimostrato per i micobatteri ambientali e nel lavoro attuale è stato estrapolato a Mtb10. Una colonna disponibile in commercio e un collettore automatico di frazioni possono migliorare la coerenza nella preparazione vescicale e ridurre la necessità di attrezzature specifiche e costose. È anche possibile completare questo protocollo in una frazione del tempo rispetto all'ultracentrifugazione del gradiente di densità, aumentando la produttività. Questa tecnica è meno impegnativa dal punto di vista tecnico, rendendola più facile da padroneggiare e può aumentare la riproducibilità inter/intra-laboratorio. Infine, SEC ha un'elevata efficienza di separazione ed è delicato, preservando l'integrità delle vescicole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il Comitato istituzionale per la biosicurezza della Colorado State University ha approvato il presente studio (19-046B). La coltivazione del Mycobacterium tuberculosis e la raccolta di supernatanti di coltura ricchi di EV sono state eseguite da personale addestrato in un laboratorio ad alto contenimento. I materiali sono stati spostati fuori dall'area ad alto contenimento dopo che è stato eseguito, confermato e approvato dalle politiche di biosicurezza istituzionali un valido metodo di inattivazione. Durante la replica del protocollo, se l'inattivazione convalidata o il metodo di filtrazione sterile non sono fattibili, le seguenti procedure devono essere eseguite in un laboratorio ad alto contenimento.
1. Preparazione del concentrato grezzo di Mtb EV
NOTA: Per le procedure dettagliate sulla coltivazione di Mtb e la preparazione di proteine filtrate di coltura (CFP), vedere Riferimenti11,12. Si raccomanda che i terreni di coltura batterica siano esenti da integratori di crescita con componenti contenenti EV o proteinacei, come l'albumina oleica destrosi catalasi (OADC) e detergenti come Tween. Si raccomanda inoltre che la qualità della coltura batterica e la CFP raccolta siano sottoposte a screening per garantire una morte cellulare limitata e la lisi13,14.
- Preparare un filtro centrifugo da 100 kDa a peso molecolare (MWCO) (vedere Tabella dei materiali) aggiungendo l'intera capacità volumetrica della soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS). Centrifugare per 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
NOTA: se si utilizza un filtro senza volume dead stop, è necessario prestare attenzione per garantire che il volume del campione non si riduca al di sotto del livello del filtro, con conseguente completa asciugatura del filtro durante la centrifugazione. - Scartare il flusso passante e l'eventuale PBS rimanente prima di riempire la camera del campione con Mtb CFP alla sua massima capacità. Centrifugare a 2.800 x g a 4 °C fino a quando il volume non si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione. Ripetere se necessario, aggiungendo più CFP all'unità fino a quando l'intero campione non è stato sufficientemente ridotto.
NOTA: Conservare una parte del materiale a flusso continuo (100F) da 100 kDa per la qualificazione a valle, se lo si desidera. Conservare a 4 °C. - Aggiungere 1x PBS all'unità filtrante contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto al punto 1.2. Ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e lo scambio del tampone.
- Recuperare il retentato CFP concentrato da 100 kDa (100R) secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione (vedi Tabella dei materiali). Una volta recuperato il 100R, lavare il filtro con un volume minimo di 1x PBS almeno tre volte e raggruppare il lavaggio con il 100R per massimizzare il recupero.
- Quantificare il materiale 100R con un saggio bicinchoninico (BCA) seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Per eseguire il test, utilizzare diverse diluizioni di campioni 1:2, 1:5 e 1:10 in PBS. Testare il campione in triplice copia.
NOTA: conservare una parte del materiale 100R per la qualificazione a valle, se lo si desidera. Conservare a 4 °C.
2. Cromatografia di esclusione dimensionale per l'arricchimento di MTB EV da CFP
NOTA: La seguente procedura è specifica per l'utilizzo di 3 mg di 100R Mtb CFP con colonna SEC e collettore automatico di frazioni (AFC, vedi Tabella dei materiali). Può essere adattato per altre concentrazioni di partenza e tipi di colonne seguendo le specifiche del produttore. Inoltre, si consiglia agli utenti di leggere e comprendere il manuale utente del raccoglitore automatico di frazioni.
- Consentire alla colonna SEC di equilibrarsi a temperatura ambiente.
- Accendere l'AFC utilizzando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità tower e regolare le impostazioni per la cella di carico, se necessario, premendo SETUP sul touchscreen del menu principale. La cella di carico deve essere calibrata solo al primo utilizzo, dopo ogni aggiornamento del software e se si nota un'incoerenza nei volumi di raccolta delle frazioni.
- Dalla schermata SETUP , allineare il carosello selezionando CAROSELLO > CALIBRA. Inserire la giostra con i 13 piccoli fori rivolti verso l'alto nella torre AFC e regolare la giostra in modo che l'ugello del fluido sia direttamente sopra la posizione di scarico premendo i pulsanti - e/ o + .
- Rimuovere i tappi dalla colonna SEC bilanciata. Far scorrere la colonna SEC nel supporto a colonna appropriato e installarla con attenzione sulla torre AFC. Assicurarsi che il tag di identificazione a radiofrequenza (RFID) sulla colonna sia rivolto verso l'AFC e verificare che la connessione tra la colonna e la valvola sia sicura. Posizionare il tubo di uscita dei rifiuti in un contenitore di raccolta.
- Dalla schermata SETUP , selezionare Collection Schedule e impostare il conteggio su 13 e la dimensione su 0,5 mL premendo i pulsanti - e/o + . Lasciare l'impostazione "Volume buffer" come valore predefinito di 2,7 ml, quindi chiudere la finestra "Pianificazione raccolta" premendo X.
- Selezionare START COLLECTION dalla schermata iniziale e confermare i parametri di raccolta selezionando YES. Caricare 13 tubi microcentrifuga etichettati da 1,7 mL con i coperchi aperti e rivolti verso il centro della giostra.
- Avanzate l'AFC selezionando OK, quindi montate il serbatoio della colonna e avanzate di nuovo premendo OK. Selezionare l'opzione per svuotare la colonna premendo YES e aggiungere un volume di colonna di PBS filtrato da 0,2 μm per rimuovere qualsiasi buffer di archiviazione. Una volta completato il lavaggio, far avanzare l'AFC premendo OK.
- Posizionare il coperchio della giostra sull'AFC e premere OK. Preparare un volume di colonna di PBS filtrato da 0,2 μm. Utilizzare una pipetta per rimuovere il buffer in eccesso dalla colonna.
- Portare 3 mg di campione 100R come quantificato nei passaggi da 1,5 a 500 μL con 1x PBS. Aggiungere il campione da 3 mg nella parte superiore della colonna. Fate avanzare l'AFC e lasciate che il campione si imbatta nella fritta. Una volta che il campione è entrato completamente nella colonna, aggiungere il PBS preparato nel passaggio 2.6 al serbatoio.
- Monitorare l'esecuzione dell'AFC mentre raccoglie prima il volume del vuoto e poi le frazioni specificate. Dopo che la corsa è stata completata e la giostra ritorna in posizione di scarico, rimuovere il coperchio e rimuovere i tubi di frazione dalla giostra. Conservare le frazioni a 4 °C prima della quantificazione (fase 3) e della qualifica (fase 4).
- Se la colonna deve essere riutilizzata, selezionare l'opzione per pulire la colonna premendo SÌ; in caso contrario, premere NO. Seguire le istruzioni sull'AFC.
NOTA: una volta che la colonna è stata lavata e il buffer di stoccaggio è stato attraversato, può essere rimosso, tappato e conservato a 4 °C.
3. Quantificazione dei veicoli elettrici Mtb
- Misurare la concentrazione proteica per ogni frazione utilizzando BCA e micro BCA12.
- Per frazioni da 0,5 mL raccolte da 3 mg di 100R Mtb CFP, utilizzare il micro BCA con diluizione 1:3 per frazioni numerate 1-7 di ciascun campione in triplice copia.
- Per frazioni di 0,5 ml numerate 5-13, utilizzare il BCA senza diluizione per ciascun campione in triplice copia.
NOTA: la sovrapposizione dei saggi per le frazioni 5-7 contribuirà a garantire che tutte le frazioni abbiano un output leggibile.
- Quantitare la concentrazione di particelle per ogni frazione utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA).
- Diluire i campioni in 1 mL di 1x PBS utilizzando i seguenti rapporti di partenza suggeriti; per le frazioni 1-3, utilizzare 1:100, quindi per le frazioni rimanenti, utilizzare una diluizione 1:10.
- Vorticolare le soluzioni diluite e quindi prelevare il campione in una siringa monouso da 1 mL. Impostare la siringa in una pompa automatica a siringa, se disponibile.
- Impostare la pompa della siringa su 30 μL/min e utilizzare le impostazioni di acquisizione video con un guadagno dello schermo di 10-12 e un livello della fotocamera di 10-12. Regolare la messa a fuoco per ogni campione.
- Raccogli un minimo di tre video a 30 s ciascuno utilizzando un flusso costante.
- Eseguire l'analisi con la soglia di rilevamento del software impostata su cinque.
NOTA: potrebbe non essere possibile ottenere dati NTA per le frazioni più recenti (>7) senza sacrificare un volume significativo del campione.
4. Qualificazione dei veicoli elettrici Mtb
- Visualizza il profilo proteico generale di ogni frazione utilizzando un gel proteico macchiato d'argento.
NOTA: Le procedure dettagliate per SDS-PAGE e la macchia d'argento sono disponibili nel riferimento15.- Aggiungere il buffer del campione SDS a 10 μL di ciascuna frazione e 5 μg di CFP, 100R e 100F. Far bollire per 5 minuti a 100 °C, quindi caricare su un gel Bis-Tris al 4%-12% con una scala a peso molecolare per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) (vedi Tabella dei materiali).
- Eseguire il gel utilizzando 1x 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid (MES) running buffer (vedi Tabella dei materiali) e una corrente di 200 V per 35 min.
- Rimuovere il gel dalla cassetta e procedere con la colorazione dell'argento15.
- Valutare la presenza o l'assenza di marcatori EV in ogni frazione per Western blot.
NOTA: le procedure dettagliate per il Western blotting sono disponibili nel riferimento15.- Eseguire un gel SDS-PAGE come descritto nei passaggi 4.1.1-4.1.2.
- Rimuovere il gel dalla cassetta e trasferire le proteine risolte su una membrana di nitrocellulosa da 0,2 μm (vedere Tabella dei materiali) applicando una corrente di 50 V per un minimo di 1 ora.
- Eseguire analisi Western blot per valutare le proteine di interesse. Si raccomandano anticorpi primari contro LpqH, lipoarabinomannan (LAM) e GroES (vedere Tabella dei materiali).
- Frazioni del pool basate sulla presenza o l'assenza di marcatori come applicabile per l'applicazione a valle.
- Confermare la presenza di vescicole intatte mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
- Fissare 15 μL del campione di vescicola aggiungendo 15 μL di paraformaldeide di grado EM al 4% e conservare a 4 °C durante la notte.
- Preparare una griglia TEM in rame rivestito in carbonio a 200 maglie pulendo la superficie e creando un substrato idrofilo.
NOTA: si consiglia la pulizia al plasma con il 95% di argon, il 5% di ossigeno e il 30% di potenza al plasma per 1 minuto. - Rilasciare 10 μL del campione fisso sulla griglia e lasciare che il campione aderisca per 10 minuti, quindi asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro.
- Far galleggiare la griglia su una goccia di acqua ultrapura per 30 s, quindi eliminare il liquido in eccesso.
- Far galleggiare la griglia su una goccia di acetato di uranile di grado EM d% per 2 minuti, quindi eliminare il liquido in eccesso.
- Lasciare asciugare completamente la griglia all'aria.
- Immagine utilizzando un TEM (vedi Tabella dei materiali) a 100 kV o simile.
NOTA: altri metodi di quantificazione e caratterizzazione dei veicoli elettrici devono essere utilizzati in base alle applicazioni a valle. Le informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari18 devono essere consultate per le linee guida per garantire il rigore e la riproducibilità di tutti gli studi EV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La proteina filtrata di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è stata concentrata, quantificata e quindi 3 mg di materiale sono stati applicati a una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Le concentrazioni di proteine e particelle sono state enumerate rispettivamente da BCA e NTA. Gli intervalli previsti per il recupero di proteine e particelle più i valori esatti ottenuti per questi risultati sono riportati nella Tabella 1. Valori molto più alti di questi intervalli possono indicare problemi di contaminazione o integrità della colonna. Valori significativamente più bassi indicano problemi nelle fasi di ultrafiltrazione, e quindi il flusso deve essere confrontato con la CFP iniziale e 100R per determinare se si è verificata una concentrazione riuscita. Una macchia d'argento proteica non specifica mostra che le frazioni successive contengono più proteine e assomigliano al materiale 100R (Figura 1).
Le macchie occidentali delle frazioni dimostrano che il lipoarabinomannano (LAM) è presente in tutte le frazioni, con frazioni successive che mostrano bande di intensità inferiore (Figura 2A, Figura supplementare 1). La lipoproteina 19 kDa LpqH, nota per essere presente in Mtb EV 3,19, è arricchita nelle prime frazioni della SEC (Figura 2B, Figura supplementare 1). La proteina 10 kDa chaperonina GroES è assente nelle prime frazioni della SEC (Figura 2C, Figura supplementare 1); questa scoperta si allinea con gli studi precedentemente pubblicati riguardanti GroES come contaminante durante l'arricchimento mtb EV12 e funge da controllo negativo per la presenza di Mtb EV. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) conferma la presenza di vescicole chiuse legate alla membrana (Figura 3A). Un confronto tra i veicoli elettrici Mtb separati dall'ultrafiltrazione del gradiente di densità e questo metodo SEC è riportato nella Tabella 2. SEC fornisce un maggiore recupero di proteine e particelle per tre repliche tecniche dalla stessa CFP. Questi risultati sono stati coerenti tra più lotti di CFP (dati non mostrati). Entrambi i metodi si traducono in vescicole chiuse legate alla membrana nell'intervallo di dimensioni previsto, come dimostrato da TEM (Figura 3) e NTA (Figura 4).
Complessivamente, questi dati dimostrano l'arricchimento dei veicoli elettrici Mtb nelle prime frazioni SEC. I valori di NTA più alti si verificano nelle frazioni 1-3 e il contenuto proteico aumenta all'aumentare del numero di frazioni, indicando la separazione delle proteine solubili dagli EV (Tabella 1). Poiché la frazione 4 contiene prove di GroES (Figura 2C, Figura supplementare 1), questa frazione non è stata inclusa nel materiale aggregato per TEM. A seconda dell'applicazione a valle, deve essere presa in considerazione l'inclusione o l'esclusione di frazioni specifiche per la strategia di pooling.
Figura 1: Macchia d'argento per frazione. Un gel SDS-PAGE colorato con argento dimostra il profilo proteico complessivo per ogni frazione. CFP = 5 μg di Mtb CFP, 100R = 5 μg di 100R, 100F = 5 μg di 100F, 1-11 = 10 μL di frazioni SEC 1-11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Western blots per frazione. Western blots che rilevano (A) LAM, (B) LpqH e (C) GroES, dimostrando i cambiamenti dei marcatori proteici attraverso le frazioni. CFP = 5 μg di Mtb CFP, 100R = 5 μg di 100R, 100F = 5 μg di 100F, 1-11 = 10 μL di frazioni SEC 1-11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini TEM (Transmission Electron Microscopy). (A) Frazioni SEC 1-3 raggruppate prima della fissazione. (B) L'ultracentrifugazione del gradiente di densità dei veicoli elettrici Mtb è stata macchiata negativamente per l'imaging TEM. Barre della scala = 200 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Distribuzione dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). (A) Frazioni SEC 1-3. (B) L'ultracentrifugazione del gradiente di densità Mtb EV è stata analizzata con l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Viene visualizzata la distribuzione delle dimensioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Frazione | Intervallo di recupero delle proteine (μg/μL) | Intervallo di recupero delle particelle (per μL) | Risultato Recupero Proteico (μg/μL) | Risultato recupero particelle (per μL) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1E8 - 3E8 | 0.013 | 1,60E+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2E8 - 4E8 | 0.026 | 2,10E+08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2E7 - 6E7 | 0.024 | 5,20E+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7E6 - 2E7 | 0.032 | 1,30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1E6 - 5E6 | 0.053 | 4,20E+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1E6 - 5E6 | 0.099 | 5,20E+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1E6 - 3E6 | 0.234 | 2,70E+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1E6 - 4E6 | 0.398 | 4,20E+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1E6 - 3E6 | 0.543 | 4,10E+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1E6 - 3E6 | 0.661 | 1,70E+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1E6 - 3E6 | 0.736 | 1,40E+06 |
Tabella 1: Recupero di proteine e particelle per frazione. Intervallo di recupero di proteine e particelle previsto per frazione basato su 3 mg di materiale di partenza. I valori esatti per ottenere il materiale utilizzato in questo studio sono inclusi nelle due colonne più a destra.
| Metodo di arricchimento | Proteine totali recuperate (μg) | Particelle totali recuperate |
| Ultracentrifugazione del gradiente di densità | 3.14 | 1,82E+10 |
| 3.88 | 1,93E+10 | |
| 3.20 | 1,65E+10 | |
| Cromatografia ad esclusione dimensionale F1-3 | 12.96 | 4,05E+10 |
| 14.14 | 4,15E+10 | |
| 14.74 | 4,35E+10 |
Tabella 2: Metodo di confronto del recupero di proteine e particelle. Resa proteica misurata con BCA e conta totale delle particelle misurata da NTA per EV Mtb originati da 3 mg dello stesso materiale di partenza 100R, arricchito utilizzando il metodo di ultracentrifugazione del gradiente di densità di riferimento8 o questo metodo SEC (triplicato).
Figura 1 supplementare: Macchie occidentali originali (non ritagliate) dalla Figura 2. Fare clic qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le vescicole extracellulari di Mycobacterium tuberculosis sono serbatoi altamente antigenici, che li presentano come una strada attraente per lo sviluppo di strumenti diagnostici e futuri vaccini 4,19,20. Storicamente, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata utilizzata per separare i veicoli elettrici Mtb da altri materiali solubili e secreti8. Sebbene questo processo sia efficace, è anche dispendioso in termini di tempo, tecnicamente impegnativo e può influire sull'integrità dei preparati EV risultanti 9,10. Il protocollo presentato offre un metodo alternativo per i preparati Mtb EV attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale (SEC).
Ci sono diversi punti critici per il successo in questo metodo. La preparazione iniziale di Mtb CFP influenzerà la qualità e la resa delle vescicole dopo SEC. Si raccomanda di raccogliere la CFP prima della fase intermedia di crescita per limitare il livello di lisi cellulare al momento del raccolto. Le colture in fase di crescita tardiva e stazionaria possono contenere livelli più elevati di lisi cellulare e possono portare all'identificazione di proteine intracellulari e strutture artefattuali simili a EV, generate spontaneamente dai frammenti di membrana delle cellule lisate, come contributo significativo alla CFPraccolta 12,13,14 . Questo dovrebbe essere valutato prima di iniziare questo protocollo poiché le vescicole di membrana delle cellule lisate si co-purificano con i veicoli elettrici Mtb secreti e le potenziali analisi a valle inclinate. Durante l'ultrafiltrazione è necessario prestare attenzione per garantire che la membrana del filtro rimanga intatta e bagnata. Danni al filtro possono causare il passaggio del materiale desiderato. Includere la CFP originale, 100R e 100F nelle valutazioni di qualità a valle aiuterà nella valutazione dell'integrità dell'ultrafiltrazione.
La corretta configurazione e il lavaggio della colonna SEC sono necessari per la preparazione EV di altissima qualità. Seguire sempre i manuali dell'utente per l'installazione e la rimozione. Mentre le frazioni vengono raccolte, assicurarsi che l'AFC non venga urtato o spostato in quanto ciò può interrompere il processo e portare a frazioni saltate o incoerenti. Gli anticorpi utilizzati per la qualificazione dipenderanno dall'applicazione a valle delle vescicole arricchite e dovrebbero includere un marcatore che dovrebbe essere nei veicoli elettrici Mtb (LpqH) e un marcatore trovato nella CFP ma non arricchito nei veicoli elettrici Mtb (GroES). Una limitazione ai metodi qui presentati è la potenziale variazione nei controlli proteici appropriati. Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando metodi di coltivazione standard. Il lavoro svolto con Mycobacterium avium ha suggerito che i livelli di chaperonins come GroES cambiano in CFP e EV in base al mezzo utilizzato per la crescita21. Man mano che emergono ulteriori informazioni sulla composizione micobatterica ev, potrebbe essere necessario regolare lo specifico marcatore di controllo negativo.
Infine, tutte le procedure di quantificazione e qualificazione e le applicazioni a valle dovrebbero essere eseguite rapidamente. Se è necessario lo stoccaggio del materiale, si consiglia un congelamento di 4 °C per evitare che l'integrità delle vescicole si interrompa durante il processo di congelamento-scongelamento. Se viene eseguito il congelamento, aliquotare il materiale per evitare ripetuti cicli di congelamento-disgelo. I veicoli elettrici arricchiti dovrebbero essere rivalutati sia quantitativamente che qualitativamente se passa una quantità significativa di tempo tra la valutazione iniziale e l'uso.
Questo metodo arricchisce efficacemente i veicoli elettrici Mtb e c'è flessibilità per l'adattamento ad altri micobatteri. Quando si adatta questa procedura ad altri organismi, assicurarsi che la coltura iniziale abbia una lisi cellulare limitata. La quantità di materiale caricato sulla colonna deve essere regolata, poiché la cinetica del rilascio di EV varierà. Non superare una concentrazione massima di proteine di 7 g per 100 ml in base alle specifiche del produttore. È inoltre necessario valutare ogni frazione individualmente per la presenza di marcatori e contaminanti associati all'EV. La concentrazione proteica e i dati NTA possono essere fuorvianti nell'ottimizzazione del metodo: una concentrazione proteica molto bassa non significa l'assenza di vescicole in quelle frazioni. Inoltre, la modifica delle colonne SEC e dei parametri di raccolta delle frazioni consente all'utente di ridimensionare il protocollo in base alle applicazioni di input e downstream. I limiti di questo metodo includono il costo dell'AFC e dei materiali di consumo, l'output diluito e, come accennato in precedenza, lo sviluppo e l'ottimizzazione dello schema di pooling delle fazioni. Mentre l'ultracentrifugazione del gradiente di densità ha i suoi vantaggi e forse più applicabile per alcuni esperimenti, l'arricchimento dei veicoli elettrici Mtb da parte della SEC è paragonabile in termini di qualità e superiore in termini di accesso e facilità d'uso, come presentato qui.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere il sostegno del College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award e del College Research Council Shared Research Program a NKG e il finanziamento da parte di ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. Vorremmo anche ringraziare Anne Simpson per il supporto tecnico e BEI Resources, NIAID, NIH per i seguenti reagenti: Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (prodotto in vitro), NR-13792, Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (prodotto in vitro), NR-49223 e Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (prodotto in vitro), NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization.
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al.
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
