Summary
Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.
Abstract
O papel das vesículas extracelulares (EVs) no contexto da infecção bacteriana surgiu como um novo caminho para a compreensão da fisiologia microbiana. Especificamente, os EVs Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempenham um papel na interação hospedeiro-patógeno e na resposta ao estresse ambiental. Os EVs Mtb também são altamente antigênicos e mostram potencial como componentes de vacinas. O método mais comum para purificar EVs Mtb é a ultracentrifugação gradiente de densidade. Esse processo tem várias limitações, incluindo baixo rendimento, baixo rendimento, dependência de equipamentos caros, desafios técnicos, podendo impactar negativamente a preparação resultante. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é um método alternativo mais suave que combate muitas das limitações da ultracentrifugação. Este protocolo demonstra que a SEC é eficaz para o enriquecimento de EV Mtb e produz preparações de EV Mtb de alta qualidade de maior rendimento de forma rápida e escalável. Além disso, uma comparação com a ultracentrifugação de gradiente de densidade por procedimentos de quantificação e qualificação demonstra os benefícios da SEC. Enquanto a avaliação da quantidade de EV (análise de rastreamento de nanopartículas), fenótipo (microscopia eletrônica de transmissão) e conteúdo (mancha ocidental) é adaptado para EVs Mtb, o fluxo de trabalho fornecido pode ser aplicado a outras micobactérias.
Introduction
A liberação de vesícula extracelular (EV) por patógenos pode ser a chave para desbloquear novas tecnologias para controlar doenças infecciosas1. A micobacterium tuberculosis (Mtb) é um patógeno de alta consequência, infectando aproximadamente um terço da população mundial e reivindicando a vida de milhões de pessoas a cada ano2. A produção de EV por Mtb é bem documentada, mas evasiva nos papéis biogêneses e variados (ou seja, imunoestimulatório, imunossupressor, aquisição de ferro e nutrientes) desses EVs no contexto da infecção 3,4,5. Os esforços para entender a composição dos EVs Mtb revelaram esferas lipídicas de 50-150 nm de membrana lipídica derivadas da membrana plasmática contendo lipídios e proteínas de significância imunológica 3,6. A investigação do papel dos EVs de Mtb na fisiologia bacteriana revelou a importância da modulação bacteriana de EV em resposta ao estresse ambiental para a sobrevivência5. Estudos de interação hospedeiro-patógeno têm sido mais complicados de interpretar, mas evidências indicam que os EVs Mtb podem influenciar a resposta imune do hospedeiro e podem potencialmente servir como um componente de vacinação eficaz 3,4,7.
A maioria dos estudos de EVs Mtb até agora tem se apoiado na ultracentrifugação gradiente de densidade para o enriquecimento vesícula8. Isso tem sido eficaz para estudos de pequena escala; no entanto, essa técnica tem diversos desafios técnicos e logísticos. Fluxos de trabalho alternativos casam centrifugação multistep, para a remoção de células inteiras e detritos grandes, com um passo final de ultracentrifugação para eVs de pelotização. Essa metodologia pode variar em eficiência, e muitas vezes resulta em baixo rendimento e co-purificação de biomoléculas não vesículas solúveis associadas, ao mesmo tempo em que impacta a integridade vesícula9. Além disso, esse processo é demorado, manualmente intensivo e muito limitado em rendimento devido a restrições de equipamentos.
O presente protocolo descreve uma técnica alternativa à ultracentrifugação gradiente de densidade: cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Este método tem sido demonstrado para micobactérias ambientais, e no trabalho atual, foi extrapolado para Mtb10. Uma coluna comercialmente disponível e coletor de frações automática pode melhorar a consistência na preparação vesical e reduzir a necessidade de equipamentos específicos e caros. Também é possível completar este protocolo em uma fração do tempo em comparação com a ultracentrifugação gradiente de densidade, aumentando o throughput. Esta técnica é menos tecnicamente desafiadora, facilitando o domínio, e pode aumentar a reprodutibilidade inter/intra-laboratorial. Finalmente, a SEC tem alta eficiência de separação e é gentil, preservando a integridade das vesículas.
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Protocol
O Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade estadual do Colorado aprovou o presente estudo (19-046B). O cultivo de Mycobacterium tuberculosis e a colheita de supernacantes culturais ricos em EV foram realizados por pessoal treinado em um laboratório de alta contenção. Os materiais foram retirados da área de alta contenção após a realização de um método de inativação válido, confirmado e aprovado por políticas institucionais de biossegurança. Ao replicar o protocolo, se a inativação validada ou o método de filtragem estéril não forem viáveis, os seguintes procedimentos precisam ser realizados em laboratório de alta contenção.
1. Preparação do concentrado de EV de Mtb bruto
NOTA: Para procedimentos detalhados sobre o cultivo de Mtb e preparação da proteína filtrada de cultura (PCC), consulte Referências11,12. Recomenda-se que a mídia de cultura bacteriana esteja livre de suplementos de crescimento com componentes contendo EV ou proteináceos, como o Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC), e detergentes como o Tween. Recomenda-se também que a qualidade da cultura bacteriana e o PCP colhido sejam rastreados para garantir a morte celular limitada ea lise 13,14.
- Prepare um filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kDa (MWCO) (ver Tabela de Materiais) adicionando a capacidade total de volume de soro fisiológico tamponado com fosfato (1x PBS). Centrifugar por 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
NOTA: Se usar um filtro sem volume de dead stop, deve-se tomar cuidado para garantir que o volume da amostra não reduza abaixo do nível do filtro, resultando em secagem completa do filtro durante a centrifugação. - Descarte o fluxo e qualquer PBS restante antes de encher a câmara de amostra com CFP de Mtb à sua capacidade máxima. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C até que o volume seja reduzido ao volume mínimo do dispositivo de ultrafiltração. Repita conforme necessário, adicionando mais CFP à unidade até que toda a amostra tenha sido reduzida o suficiente.
NOTA: Retenha uma parte do material de fluxo de 100 kDa (100F) para qualificação a jusante, se desejar. Armazenar a 4 °C. - Adicione 1x PBS à unidade do filtro que contenha o concentrado até a capacidade total do dispositivo. Reduza o volume conforme descrito em 1.2. Repita esta etapa cinco vezes para garantir a lavagem completa e a troca de buffer.
- Recupere o retentato CFP concentrado de 100 kDa (100R) de acordo com as especificações do dispositivo de ultrafiltração (ver Tabela de Materiais). Uma vez recuperado o 100R, lave o filtro com um volume mínimo de 1x PBS pelo menos três vezes e acumule a lavagem com o 100R para maximizar a recuperação.
- Quantita o material 100R com um ensaio bicinchonínico (BCA) seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Para realizar o ensaio, utilize várias diluições das amostras 1:2, 1:5 e 1:10 em PBS. Teste a amostra em triplicado.
NOTA: Retenha uma parte do material 100R para qualificação a jusante, se desejar. Armazenar a 4 °C.
2. Cromatografia de exclusão de tamanho para o enriquecimento de EVs de Mtb de CFP
NOTA: O procedimento a seguir é específico para o uso de 3 mg de CFP de 100R Mtb com coluna SEC e coletor automático de frações (AFC, ver Tabela de Materiais). Pode ser adaptado para outras concentrações iniciais e tipos de colunas seguindo as especificações do fabricante. Além disso, recomenda-se que os usuários leiam e entendam o manual automático do usuário coletor de frações.
- Permita que a coluna SEC se equilibre à temperatura ambiente.
- Ligue a AFC usando o interruptor de alimentação na parte de trás da unidade da torre e ajuste as configurações para a célula de carga, se necessário, pressionando A CONFIGURAÇÃO na tela sensível ao toque do menu principal. A célula de carga só deve ser calibrada após o primeiro uso, após cada atualização de software, e se a inconsistência nos volumes de coleta de frações for notada.
- Na tela SETUP , alinhe o carrossel selecionando carrossel > CALIBRATE. Insira o carrossel com os 13 pequenos orifícios voltados para a torre AFC e ajuste o carrossel para que o bocal de fluido esteja diretamente acima da posição de descarga pressionando os botões - e/ou + .
- Remova as tampas da coluna SEC equilibrada. Deslize a coluna SEC para o suporte de coluna apropriado e instale-a cuidadosamente na torre AFC. Certifique-se de que a etiqueta de identificação de radiofrequência (RFID) na coluna está em frente à AFC e verifique se a conexão entre a coluna e a válvula está segura. Coloque a tubulação de saída de resíduos em um recipiente de coleta.
- Na tela SETUP , selecione O Cronograma de Coleta e defina a contagem para 13 e o tamanho para 0,5 mL pressionando os botões - e/ou + . Deixe a configuração "Volume de buffer" como padrão de 2,7 mL e, em seguida, feche a janela "Agenda de coleta" pressionando X.
- Selecione START COLLECTION na tela inicial e confirme os parâmetros de coleta selecionando SIM. Carga 13 rotulados tubos de microcentrifuus de 1,7 mL com as tampas abertas e apontando para o centro do carrossel.
- Avance a AFC selecionando OK, em seguida, monte o reservatório da coluna e avance novamente pressionando OK. Selecione a opção de lavar a coluna pressionando SIM e adicione um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 μm para remover qualquer buffer de armazenamento. Uma vez que a descarga esteja completa, avance a AFC pressionando OK.
- Coloque a tampa do carrossel sobre a AFC e pressione OK. Prepare um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 μm. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de buffer da coluna.
- Leve 3 mg de amostra de 100R quantificada na etapa 1,5 a 500 μL com 1x PBS. Adicione a amostra de 3 mgs à parte superior da coluna. Avance a AFC e deixe a amostra correr para o frit. Uma vez que a amostra tenha entrado totalmente na coluna, adicione o PBS preparado na etapa 2.6 ao reservatório.
- Monitore a execução da AFC enquanto ela coleta primeiro o volume vazio e, em seguida, as frações especificadas. Após a execução completa e o carrossel retorna à posição de resíduo, remova a tampa e remova os tubos de fração do carrossel. Armazene as frações a 4 °C antes da quantificação (etapa 3) e qualificação (etapa 4).
- Se a coluna for reutilizada, selecione a opção de limpar a coluna pressionando SIM; caso contrário, pressione NÃO. Siga as instruções da AFC.
NOTA: Uma vez que a coluna é lavada e o buffer de armazenamento é executado, ele pode ser removido, tampado e armazenado a 4 °C.
3. Quantificação dos EVs Mtb
- Meça a concentração proteica para cada fração utilizando BCA e micro BCA12.
- Para frações de 0,5 mL coletadas de 3 mg de CFP de 100R Mtb, utilize o micro BCA com diluição de 1:3 para frações numeradas de 1 a 7 de cada amostra em triplicado.
- Para frações de 0,5 mL numeradas 5-13, use o BCA sem diluição para cada amostra em triplicado.
NOTA: Sobrepor os ensaios para frações 5-7 ajudará a garantir que todas as frações tenham uma saída legível.
- Quantita a concentração de partículas para cada fração usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA).
- Diluir as amostras em 1 mL de 1x PBS utilizando as seguintes razões de partida sugeridas; para frações 1-3, use 1:100 e, em seguida, para as frações restantes, use uma diluição de 1:10.
- Vortex as soluções diluídas e, em seguida, desenhe a amostra em uma seringa descartável de 1 mL. Coloque a seringa em uma bomba de seringa automática se estiver disponível.
- Defina a bomba de seringa para 30 μL/min e use as configurações de captura de vídeo com um ganho de tela de 10-12 e um nível de câmera de 10-12. Ajuste o foco para cada amostra.
- Colete um mínimo de três vídeos a 30 s cada usando um fluxo constante.
- Realize a análise com o limiar de detecção de software definido para cinco.
NOTA: Pode não ser possível obter dados NTA para as frações mais recentes (>7) sem sacrificar um volume amostral significativo.
4. Qualificação de EVs Mtb
- Visualize o perfil geral de proteína de cada fração usando um gel de proteína manchado de prata.
NOTA: Procedimentos detalhados para SDS-PAGE e mancha de prata podem ser encontrados na Referência15.- Adicione o buffer de amostra SDS a 10 μL de cada fração e 5 μg de CFP, 100R e 100F. Ferva por 5 min a 100 °C, depois carregue em um Gel Bis-Tris de 4%-12% com uma escada de peso molecular para eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) (ver Tabela de Materiais).
- Execute o gel usando 1x 2-[N-morpholino]ácido esulfônico (MES) que executa o buffer (ver Tabela de Materiais) e uma corrente de 200 V por 35 min.
- Retire o gel do e prossiga com a coloração de prata15.
- Avalie a presença ou ausência de marcadores EV em cada fração por mancha ocidental.
NOTA: Procedimentos detalhados para manchas ocidentais podem ser encontrados na Referência15.- Execute um gel SDS-PAGE descrito nas etapas 4.1.1-4.1.2.
- Remova o gel do e transfira as proteínas resolvidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 μm (ver Tabela de Materiais) aplicando uma corrente de 50 V por um mínimo de 1h.
- Realize a análise de manchas ocidentais para avaliar proteínas de interesse. Anticorpos primários contra LpqH, lipoarabinomannan (LAM) e GroES (ver Tabela de Materiais) são recomendados.
- Frações de pool com base na presença ou ausência de marcadores, conforme aplicável para a aplicação a jusante.
- Confirme a presença de vesículas intactas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
- Fixar 15 μL da amostra de vesícula adicionando 15 μL de paraformaldeído de grau EM de 4% e armazenar a 4 °C durante a noite.
- Prepare uma grade TEM de cobre revestida de 200 malhas formvar-carbono limpando a superfície e fazendo um substrato hidrofílico.
NOTA: Recomenda-se a limpeza plasmática com 95% de argônio, 5% de oxigênio e 30% de plasma por 1 min. - Solte 10 μL da amostra fixa na rede e deixe a amostra aderir por 10 minutos, depois limpe o excesso de líquido com papel filtro.
- Flutue a rede em uma gota de água ultrauso por 30 s, em seguida, limpe o excesso de líquido.
- Flutue a rede em uma queda de acetato de urânl de grau D% EM por 2 minutos, depois limpe o excesso de líquido.
- Deixe a rede secar completamente.
- Imagem usando um TEM (ver Tabela de Materiais) a 100 kV ou similar.
NOTA: Outros métodos de quantitação e caracterização do EV devem ser usados com base em aplicações a jusante. As Informações Mínimas para Estudos de VesículasExtracelulares 18 devem ser consultadas para orientações para garantir o rigor e a reprodutibilidade de todos os estudos de EV.
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Representative Results
A proteína filtrada de cultura (PCC) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi concentrada, quantificada e, em seguida, 3 mg de material foi aplicado a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). As concentrações de proteínas e partículas foram enumeradas por BCA e NTA, respectivamente. As faixas esperadas para recuperação de proteínas e partículas mais os valores exatos obtidos para esses resultados são relatados na Tabela 1. Valores muito superiores a essas faixas podem indicar problemas de contaminação ou integridade da coluna. Valores significativamente mais baixos apontam para problemas nas etapas de ultrafiltração e, portanto, o fluxo-through precisa ser comparado com o CFP inicial e 100R para determinar se ocorreu uma concentração bem sucedida. Uma proteína não específica de mancha de prata mostra que frações posteriores contêm mais proteína e se assemelham ao material 100R (Figura 1).
Manchas ocidentais das frações demonstram que lipoarabinomannan (LAM) está presente em todas as frações, com frações posteriores mostrando faixas de menor intensidade (Figura 2A, Figura Suplementar 1). A lipoproteína LpqH de 19 kDa, conhecida por estar presente em Mtb EVs 3,19, é enriquecida nas primeiras frações da SEC (Figura 2B, Figura Suplementar 1). A proteína de 10 kDa chaperonin GroES está ausente nas primeiras frações da SEC (Figura 2C, Figura Suplementar 1); este achado se alinha com estudos publicados anteriormente sobre o GroES como um contaminante durante o enriquecimento Mtb EV12 e serve como um controle negativo para a presença de EV Mtb. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) confirma a presença de vesículas fechadas, ligadas à membrana (Figura 3A). Uma comparação de EVs Mtb separados por ultrafiltração gradiente de densidade e este método SEC é relatado na Tabela 2. A SEC fornece maior recuperação de proteínas e partículas para três réplicas técnicas do mesmo PCP. Esses resultados têm sido consistentes em vários lotes de CFP (dados não mostrados). Ambos os métodos resultam em vesículas fechadas e ligadas à membrana na faixa de tamanho esperada, como demonstrado por TEM (Figura 3) e NTA (Figura 4).
Ao todo, esses dados demonstram o enriquecimento dos EVs Mtb nas primeiras frações da SEC. Os maiores valores de NTA ocorrem nas frações 1-3, e o teor de proteína aumenta à medida que o número de frações aumenta, indicando a separação de proteínas solúveis dos EVs (Tabela 1). Como a fração 4 contém evidência de GroES (Figura 2C, Figura Suplementar 1), esta fração não foi incluída no material agrupado para TEM. Dependendo da aplicação a jusante, deve-se considerar a inclusão ou exclusão de frações específicas para a estratégia de pooling.
Figura 1: Mancha de prata por fração. Um gel SDS-PAGE manchado de prata demonstra o perfil geral de proteína para cada fração. CFP = 5 μg de Mtb CFP, 100R = 5 μg de 100R, 100F = 5 μg de 100F, 1-11 = 10 μL de frações SEC 1-11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Manchas ocidentais por fração. Manchas ocidentais detectando (A) LAM, (B) LpqH e (C) GroES, demonstrando alterações no marcador de proteínas através das frações. CFP = 5 μg de Mtb CFP, 100R = 5 μg de 100R, 100F = 5 μg de 100F, 1-11 = 10 μL de frações SEC 1-11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens de Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) imagens. (A) Frações SEC 1-3 agrupadas antes da fixação. (B) A ultracentrifugação de gradiente de densidade de EVs Mtb foi manchada negativamente para imagens TEM. Barras de escala = 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Distribuição de rastreamento de nanopartículas (NTA). (B) Os EVs Mtb de ultracentrifugação de gradiente de densidade foram analisados com análise de rastreamento de nanopartículas. A distribuição de tamanho é exibida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Fração | Faixa de recuperação de proteínas (μg/μL) | Faixa de recuperação de partículas (por μL) | Recuperação de proteína de resultado (μg/μL) | Recuperação de partículas de resultado (por μL) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1E8 - 3E8 | 0.013 | 1.60E+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2E8 - 4E8 | 0.026 | 2.10E+08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2E7 - 6E7 | 0.024 | 5.20E+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7E6 - 2E7 | 0.032 | 1.30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1E6 - 5E6 | 0.053 | 4.20E+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1E6 - 5E6 | 0.099 | 5.20E+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1E6 - 3E6 | 0.234 | 2.70E+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1E6 - 4E6 | 0.398 | 4.20E+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1E6 - 3E6 | 0.543 | 4.10E+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1E6 - 3E6 | 0.661 | 1.70E+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1E6 - 3E6 | 0.736 | 1.40E+06 |
Tabela 1: Recuperação de proteínas e partículas por fração. Faixa de recuperação de proteínas e partículas esperadas por fração com base em 3 mg de material inicial. Os valores exatos para a obtenção do material utilizado neste estudo estão incluídos nas duas colunas mais certas.
| Método de enriquecimento | Proteína total recuperada (μg) | Partículas Totais Recuperadas |
| Ultracentrifugação de gradiente de densidade | 3.14 | 1.82E+10 |
| 3.88 | 1.93E+10 | |
| 3.20 | 1.65E+10 | |
| Cromatografia de exclusão de tamanho F1-3 | 12.96 | 4.05E+10 |
| 14.14 | 4.15E+10 | |
| 14.74 | 4.35E+10 |
Tabela 2: Comparação de métodos de recuperação de proteínas e partículas. Rendimento proteico medido com BCA e contagem total de partículas medida pela NTA para EVs Mtb originários de 3 mg do mesmo material inicial de 100R, enriquecido usando o método de ultracentrifugação de gradiente de densidade referenciada8 ou este método SEC (triplicado).
Figura suplementar 1: Manchas ocidentais originais (não derrubadas) da Figura 2. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
As vesículas extracelulares de micobacterium tuberculosis são reservatórios altamente antigênicos, que os apresentam como um caminho atraente para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e vacinas futuras 4,19,20. Historicamente, a ultracentrifugação de gradiente de densidade tem sido usada para separar EVs Mtb de outros materiais solúveis e secretos8. Embora esse processo seja eficaz, também é demorado, tecnicamente desafiador, e pode impactar a integridade das preparações de EVresultantes 9,10. O protocolo apresentado oferece um método alternativo para as preparações de EV de Mtb através da cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).
Existem vários pontos críticos para o sucesso neste método. A preparação inicial do CFP do Mtb influenciará a qualidade e o rendimento das vesículas após a SEC. Recomenda-se que o PCP seja colhido em ou antes da fase intermediária de crescimento para limitar o nível de lise celular no momento da colheita. Culturas de fase de crescimento tardio e estacionária podem conter níveis mais elevados de lise celular e podem resultar na identificação de proteínas intracelulares e estruturas artefatosas semelhantes a EV, geradas espontaneamente a partir dos fragmentos de membrana das células líssedas, como contribuinte significativo para o PCPcoletado 12,13,14 . Isso deve ser avaliado antes do início deste protocolo, pois as vesículas de membrana de células lised irão co-purificar com EVs Mtb secretados e possíveis análises a jusante. Deve-se tomar cuidado durante a ultrafiltração para garantir que a membrana do filtro permaneça intacta e úmida. Danos no filtro podem fazer com que o material desejado flua. Incluindo o CFP original, 100R e 100F em avaliações de qualidade a jusante auxiliarão na avaliação da integridade da ultrafiltração.
A configuração e lavagem adequadas da coluna SEC são necessárias para a preparação de EV da mais alta qualidade. Siga sempre os manuais do usuário para configuração e retirada. Enquanto as frações estão sendo coletadas, certifique-se de que a AFC não seja deslocada ou movida, pois isso pode interromper o processo e levar a frações ignoradas ou inconsistentes. Os anticorpos utilizados para a qualificação dependerão da aplicação a jusante das vesículas enriquecidas, e devem incluir um marcador esperado para estar em EVs Mtb (LpqH) e um marcador encontrado em CFP, mas não enriquecido em EVs Mtb (GroES). Uma limitação aos métodos aqui apresentados é a variação potencial nos controles proteicos adequados. Este protocolo foi desenvolvido usando métodos de cultivo padrão. O trabalho realizado com mycobacterium avium sugeriu que níveis de acompanhantes como GroES mudam em CFP e EVs com base no meio utilizado para o crescimento21. À medida que mais informações surgem sobre a composição do EV micobacteriano, pode ser necessário ajustar o marcador de controle negativo específico.
Finalmente, todos os procedimentos de quantificação e qualificação e aplicações a jusante devem ser realizados rapidamente. Se for necessário o armazenamento do material, recomenda-se 4 °C de congelamento para evitar interrupção da integridade da vesícula durante o processo de congelamento. Se for realizado o congelamento, aliquotar o material para evitar ciclos repetidos de congelamento. Os EVs enriquecidos devem ser reavaliados quantitativamente e qualitativamente se uma quantidade significativa de tempo passar entre a avaliação inicial e o uso.
Este método enriquece efetivamente os EVs Mtb, e há flexibilidade para adaptação a outras micobactérias. Ao adaptar este procedimento para outros organismos, certifique-se de que a cultura inicial tenha lise celular limitada. A quantidade de material carregado na coluna deve ser ajustada, pois a cinética da liberação de EV vai variar. Não exceda uma concentração máxima de proteína de 7 g por 100 mL com base nas especificações do fabricante. Também é necessário avaliar cada fração individualmente para a presença de marcadores e contaminantes associados ao EV. A concentração de proteínas e os dados da NTA podem ser enganosos na otimização do método: a baixa concentração proteica não significa a ausência de vesículas nessas frações. Além disso, a alteração das colunas SEC e dos parâmetros de coleta de frações permitem que o usuário dimensione o protocolo com base em aplicativos de entrada e downstream. As limitações deste método incluem o custo da AFC e os consumíveis, a saída diluída e, como mencionado anteriormente, o desenvolvimento e otimização do esquema de agrupamento de facções. Embora a ultracentrifugação de gradiente de densidade tenha suas vantagens e talvez mais aplicáveis para certos experimentos, o enriquecimento de EVs Mtb pela SEC é comparável em qualidade e superior no acesso e facilidade de uso, como apresentado aqui.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer o apoio do Prêmio Experiencial de Medicina Veterinária e Ciências Biomédicas e do Conselho de Pesquisa Universitária ao NKG e financiamento da ATCC (prêmio nº 2016-0550-0002) ao KMD. Também gostaríamos de reconhecer Anne Simpson por suporte técnico e recursos BEI, NIAID, NIH para os seguintes reagentes: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produzido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produzido in vitro), NR-49223, e Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produzido in vitro), NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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