Summary
Detta protokoll beskriver storleksuteslutningskromatografi, en enkel och reproducerbar teknik för att berika Mycobacterium tuberculosis extracellulära vesiklar från kultursupnatanter.
Abstract
Rollen av extracellulära vesiklar (EV) i samband med bakteriell infektion har dykt upp som en ny väg för att förstå mikrobiell fysiologi. Specifikt spelar Mycobacterium tuberculosis (Mtb) elbilar en roll i värd-patogeninteraktionen och svaret på miljöstress. Mtb elbilar är också mycket antigena och visar potential som vaccinkomponenter. Den vanligaste metoden för att rena Mtb elbilar är densitetsgradient ultracentrifugering. Denna process har flera begränsningar, inklusive låg genomströmning, lågt utbyte, beroende av dyr utrustning, tekniska utmaningar och det kan påverka den resulterande förberedelsen negativt. Storleksuteslutningskromatografi (SEC) är en mildare alternativ metod som bekämpar många av begränsningarna för ultracentrifugering. Detta protokoll visar att SEC är effektivt för Mtb EV-anrikning och producerar högkvalitativa Mtb EV-preparat med ökat utbyte på ett snabbt och skalbart sätt. Dessutom visar en jämförelse med ultracentrifugering av densitetsgradient genom kvantifierings- och kvalificeringsförfaranden fördelarna med SEC. Medan utvärderingen av EV-kvantitet (nanopartikelspårningsanalys), fenotyp (transmissionselektronmikroskopi) och innehåll (Western blotting) är skräddarsydd för Mtb-elbilar, kan arbetsflödet som tillhandahålls tillämpas på andra mykobakterier.
Introduction
Extracellulär vesikel (EV) frisättning av patogener kan vara nyckeln till att låsa upp ny teknik för att kontrollera infektionssjukdomar1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) är en patogen med hög konsekvens, som infekterar ungefär en tredjedel av världens befolkning och kräver miljontals människors liv varje år2. EV-produktion av Mtb är väldokumenterad men ändå svårfångad i biogenesen och varierade roller (dvs. immunstimulerande, immunsuppressiv, järn- och näringsförvärv) för dessa elbilar i samband med infektion 3,4,5. Ansträngningar för att förstå sammansättningen av Mtb-elbilar avslöjade 50-150 nm lipidmembranslutna sfärer härledda från plasmamembranet innehållande lipider och proteiner av immunologisk betydelse 3,6. Undersökning av Mtb EV: s roll i bakteriell fysiologi har avslöjat vikten av bakteriell EV-modulering som svar på miljöstress för överlevnad5. Värd-patogeninteraktionsstudier har varit mer komplicerade att tolka, men bevis tyder på att Mtb-elbilar kan påverka värdens immunsvar och potentiellt kan fungera som en effektiv vaccinationskomponent 3,4,7.
De flesta studier av Mtb-elbilar hittills har förlitat sig på ultracentrifugering av densitetsgradient för vesikelanrikning8. Detta har varit effektivt för småskaliga studier; denna teknik har dock flera tekniska och logistiska utmaningar. Alternativa arbetsflöden kopplar samman flerstegscentrifugering, för avlägsnande av hela celler och stora skräp, med ett sista ultracentrifugeringssteg för att pellet-elbilar. Denna metod kan variera i effektivitet och resulterar ofta i lågt utbyte och samrening av lösliga icke-vesikelassocierade biomolekyler samtidigt som det påverkar vesikelintegriteten9. Dessutom är den här processen tidskrävande, manuellt intensiv och mycket begränsad i genomströmning på grund av utrustningsbegränsningar.
Det nuvarande protokollet beskriver en alternativ teknik till ultracentrifugering av densitetsgradient: storleksuteslutningskromatografi (SEC). Denna metod har demonstrerats för miljömykobakterier, och i det aktuella arbetet har den extrapolerats till Mtb10. En kommersiellt tillgänglig kolonn och automatisk fraktionsuppsamlare kan förbättra konsistensen vid vesikal beredning och minska behovet av specifik, dyr utrustning. Det är också möjligt att slutföra detta protokoll på en bråkdel av tiden jämfört med ultracentrifugering av densitetsgradient, vilket ökar genomströmningen. Denna teknik är mindre tekniskt utmanande, vilket gör det lättare att behärska och kan öka reproducerbarheten mellan / inom laboratorier. Slutligen har SEC hög separationseffektivitet och är skonsam, vilket bevarar vesiklarnas integritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Colorado State University Institutional Biosafety Committee godkände denna studie (19-046B). Odling av Mycobacterium tuberculosis och skörd av EV-rika kultursupnatanter utfördes av utbildad personal i ett laboratorium med hög inneslutning. Materialen flyttades ut från området med hög inneslutning efter att en giltig inaktiveringsmetod utfördes, bekräftades och godkändes av institutionella biosäkerhetspolicyer. Om validerad inaktivering eller steril filtreringsmetod inte är möjlig måste följande procedurer utföras i ett laboratorium med hög inneslutning, medan det inte är möjligt att replikera protokollet.
1. Beredning av obearbetat Mtb EV-koncentrat
ANMÄRKNING: För detaljerade förfaranden för odling av Mtb och beredning av odlingsfiltratprotein (CFP), sereferenserna 11,12. Det rekommenderas att bakterieodlingsmedier är fria från tillväxttillskott med EV-innehållande eller proteinhaltiga komponenter, såsom oljealbumindextroskatalas (OADC) och tvättmedel som Tween. Det rekommenderas också att bakteriekulturens kvalitet och skördade CFP screenas för att säkerställa begränsad celldöd och lys13,14.
- Förbered ett 100 kDa molekylviktsavgränsningscentrifugerfilter (MWCO) (se materialtabell) genom att lägga till hela volymkapaciteten för fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS). Centrifugera i 5 min vid 2 800 x g vid 4 °C.
OBS: Om du använder ett filter utan dödstoppsvolym måste du se till att provvolymen inte minskar under filternivån, vilket resulterar i fullständig filtertorkning under centrifugering. - Kassera genomströmningen och eventuella återstående PBS innan provkammaren fylls med Mtb CFP till sin maximala kapacitet. Centrifugera vid 2 800 x g vid 4 °C tills volymen har minskat till ultrafiltreringsanordningens minsta volym. Upprepa vid behov och tillsätt mer CFP till enheten tills hela provet har reducerats tillräckligt.
OBS: Behåll en del av 100 kDa-genomströmningsmaterialet (100F) för nedströmskvalificering om så önskas. Förvaras vid 4 °C. - Lägg till 1x PBS till filterenheten som innehåller koncentratet upp till den totala enhetskapaciteten. Minska volymen enligt beskrivningen i 1.2. Upprepa detta steg fem gånger för att säkerställa fullständig tvätt och buffertutbyte.
- Återvinn den koncentrerade CFP-retentaten på 100 kDa (100R) enligt specifikationerna för ultrafiltreringsanordningen (se materialtabell). När 100R har återvunnits, tvätta filtret med en minimal volym på 1x PBS minst tre gånger och slå ihop tvätten med 100R för att maximera återhämtningen.
- Kvantifiera 100R-materialet med en bicinchoninisk analys (BCA) enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell). För att utföra analysen, använd flera utspädningar av proverna 1:2, 1:5 och 1:10 i PBS. Testa provet i tre exemplar.
OBS: Behåll en del av 100R-materialet för nedströmskvalificering om så önskas. Förvaras vid 4 °C.
2. Storleksuteslutningskromatografi för anrikning av mtb-elfordon från CFP
OBS: Följande procedur är specifik för användning av 3 mg 100R Mtb CFP med SEC-kolonn och automatisk fraktionsuppsamlare (AFC, se materialtabell). Den kan anpassas för andra startkoncentrationer och kolonntyper genom att följa tillverkarens specifikationer. Dessutom rekommenderas användarna att läsa och förstå användarhandboken för automatisk fraktionssamlare.
- Låt SEC-kolumnen balansera till rumstemperatur.
- Slå på AFC med strömbrytaren på baksidan av tornenheten och justera inställningarna för lastcellen, om det behövs, genom att trycka på SETUP på huvudmenyns pekskärm. Lastcellen får endast kalibreras vid första användningen, efter varje programuppdatering och om inkonsekvens i fraktionssamlingsvolymer märks.
- På inställningsskärmen justerar du karusellen genom att välja CAROUSEL > KALIBRERA. Sätt i karusellen med de 13 små hålen uppåt i AFC-tornet och justera karusellen så att vätskemunstycket ligger direkt ovanför spolläget genom att trycka på knapparna - och/eller + .
- Ta bort versalerna från den utjämnade SEC-kolumnen. Skjut SEC-kolonnen i lämpligt kolumnfäste och installera den försiktigt på AFC-tornet. Se till att radiofrekvensidentifieringsetiketten (RFID) på kolonnen är vänd mot AFC och kontrollera att anslutningen mellan kolonnen och ventilen är säker. Placera avfallsutloppsslangen i en uppsamlingsbehållare.
- På SETUP-skärmen väljer du Collection Schedule och ställer in antalet till 13 och storleken till 0,5 ml genom att trycka på knapparna - och /eller + . Lämna inställningen "Buffertvolym" som standard på 2,7 ml och stäng sedan fönstret "Insamlingsschema" genom att trycka på X.
- Välj START COLLECTION på startskärmen och bekräfta insamlingsparametrarna genom att välja JA. Ladda 13 märkta 1,7 ml mikrocentrifugrör med locken öppna och pekande mot karusellens centrum.
- Avancera AFC genom att välja OK, montera sedan kolonnbehållaren och gå vidare igen genom att trycka på OK. Välj alternativet för att spola kolumnen genom att trycka på JA och lägg till en kolumnvolym på 0,2 μm filtrerad PBS för att ta bort eventuell lagringsbuffert. När spolningen är klar, avancera AFC genom att trycka på OK.
- Placera karusellluckan över AFC och tryck på OK. Förbered en kolonnvolym på 0,2 μm filtrerad PBS. Använd en pipett för att ta bort eventuell överskottsbuffert från kolonnen.
- Bringa 3 mg 100R-prov kvantifierat i steg 1,5 till 500 μl med 1x PBS. Tillsätt provet på 3 mg överst i kolonnen. Avancera AFC och låt provet springa in i friten. När provet har kommit in i kolonnen helt, lägg till PBS som bereddes i steg 2.6 till behållaren.
- Övervaka körningen av AFC medan den först samlar in tomrumsvolymen och sedan de angivna fraktionerna. När körningen är klar och karusellen återgår till avfallsläge, ta bort locket och ta bort fraktionsrören från karusellen. Lagra fraktionerna vid 4 °C före kvantifiering (steg 3) och bestämning (steg 4).
- Om kolumnen ska återanvändas väljer du alternativet att rengöra kolumnen genom att trycka på JA. annars trycker du på NEJ. Följ instruktionerna på AFC.
OBS: När kolonnen har tvättats och lagringsbufferten har runnit igenom kan den tas bort, täckas och förvaras vid 4 °C.
3. Kvantifiering av Mtb-elbilarna
- Mät proteinkoncentrationen för varje fraktion med BCA och mikro BCA12.
- För 0,5 ml fraktioner som samlats in från 3 mg 100R Mtb CFP, använd mikro BCA med en utspädning på 1:3 för fraktioner numrerade 1-7 av varje prov i tre exemplar.
- För 0,5 ml fraktioner numrerade 5-13, använd BCA utan utspädning för varje prov i tre exemplar.
Obs: Överlappning av analyserna för bråktal 5-7 hjälper till att säkerställa att alla bråk har en läsbar utgång.
- Kvantifiera partikelkoncentrationen för varje fraktion med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA).
- Späd proverna i 1 ml 1x PBS med hjälp av följande föreslagna utgångsförhållanden; för fraktioner 1-3, använd 1:100, och använd sedan en 1:10 utspädning för de återstående fraktionerna.
- Virvla de utspädda lösningarna och dra sedan provet i en 1 ml engångsspruta. Ställ sprutan i en automatisk sprutpump om sådan finns.
- Ställ in sprutpumpen på 30 μL/min och använd videoinspelningsinställningarna med en skärmförstärkning på 10-12 och en kameranivå på 10-12. Justera fokus för varje prov.
- Samla in minst tre videor på 30 s vardera med ett konstant flöde.
- Utför analysen med tröskelvärdet för programvaruidentifiering inställt på fem.
OBS: Det kanske inte är möjligt att erhålla NTA-data för de senaste fraktionerna (>7) utan att offra betydande provvolym.
4. Kvalificering av Mtb-elbilar
- Visualisera den allmänna proteinprofilen för varje fraktion med hjälp av en silverfärgad proteingel.
OBS: Detaljerade procedurer för SDS-PAGE och silverfläck finns i referens15.- Tillsätt SDS-provbuffert till 10 μl av varje fraktion och 5 μg CFP, 100R och 100F. Koka i 5 min vid 100 °C och fyll sedan på en 4%-12% Bis-Tris Gel med en molekylviktstege för polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) (se materialtabell).
- Kör gelén med 1x 2-[N-morfolin]etansulfonsyra (MES) löpande buffert (se materialtabell) och en 200 V ström i 35 min.
- Ta bort gelén från kassetten och fortsätt med silverfärgning15.
- Utvärdera närvaron eller frånvaron av EV-markörer i varje fraktion med Western blot.
OBS: Detaljerade förfaranden för Western blotting finns i referens15.- Kör en SDS-PAGE-gel enligt beskrivningen i steg 4.1.1-4.1.2.
- Ta bort gelén från kassetten och överför de upplösta proteinerna till ett 0,2 μm nitrocellulosamembran (se materialtabell) genom att applicera en 50 V ström i minst 1 timme.
- Utför Western blot-analys för att utvärdera proteiner av intresse. Primära antikroppar mot LpqH, lipoarabinomannan (LAM) och GroES (se materialtabell) rekommenderas.
- Poolfraktioner baserat på förekomst eller frånvaro av markörer som är tillämpliga för nedströmsapplikationen.
- Bekräfta närvaron av intakta vesiklar genom transmissionselektronmikroskopi (TEM).
- Fixa 15 μl av vesikelprovet genom att tillsätta 15 μl paraformaldehyd av 4 % EM-kvalitet och förvara vid 4 °C över natten.
- Förbered ett 200 mesh formvar-kolbelagt koppar TEM-rutnät genom att rengöra ytan och göra ett hydrofilt substrat.
OBS: Plasmarengöring med 95% argon, 5% syre och 30% plasmaeffekt i 1 min rekommenderas. - Släpp 10 μL av det fasta provet på gallret och låt provet fästa i 10 minuter och torka sedan bort överskottsvätskan med filterpapper.
- Flyt gallret på en droppe ultrarent vatten i 30 s och torka sedan bort överflödig vätska.
- Flyt gallret på en d% EM-klass uranylacetat droppe i 2 min, sedan blotta överskottsvätskan.
- Låt gallret lufttorka helt.
- Bild med hjälp av en TEM (se materialtabell) vid 100 kV eller liknande.
OBS: Andra EV-kvantifierings- och karakteriseringsmetoder bör användas baserat på nedströmsapplikationer. Den minimala informationen för studier av extracellulära vesiklar18 bör konsulteras för riktlinjer för att säkerställa noggrannhet och reproducerbarhet för alla EV-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Odlingsfiltratprotein (CFP) från Mycobacterium tuberculosis (Mtb) koncentrerades, kvantifierades och sedan applicerades 3 mg material på en storleksuteslutningskromatografikolonn (SEC). Protein- och partikelkoncentrationerna räknades upp av BCA respektive NTA. Förväntade intervall för protein- och partikelåtervinning plus de exakta värden som erhållits för dessa resultat rapporteras i tabell 1. Värden som är mycket högre än dessa intervall kan tyda på problem med kontaminering eller kolumnintegritet. Värdena är betydligt lägre på problem i ultrafiltreringsstegen, och därför måste genomströmningen jämföras med start-CFP och 100R för att avgöra om en lyckad koncentration inträffade. En icke-specifik proteinsilverfläck visar att senare fraktioner innehåller mer protein och liknar 100R-materialet (figur 1).
Western blotts av fraktionerna visar att lipoarabinomannan (LAM) finns över fraktionerna, med senare fraktioner som visar lägre intensitetsbanding (figur 2A, kompletterande figur 1). 19 kDa lipoproteinet LpqH, känt för att finnas i Mtb EV 3,19, berikas i de tidigaste fraktionerna från SEC (figur 2B, kompletterande figur 1). 10 kDa chaperoninproteinet GroES saknas i de tidigaste fraktionerna från SEC (figur 2C, kompletterande figur 1); detta resultat överensstämmer med tidigare publicerade studier om GroES som en förorening under Mtb EV-anrikning12 och fungerar som en negativ kontroll för Mtb EV-närvaro. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) bekräftar närvaron av slutna, membranbundna vesiklar (figur 3A). En jämförelse av Mtb-elbilar åtskilda av ultrafiltrering av densitetsgradient och denna SEC-metod rapporteras i tabell 2. SEC ger högre protein- och partikelåtervinning för tre tekniska replikat från samma CFP. Dessa resultat har varit konsekventa i flera partier av den gemensamma fiskeripolitiken (data visas inte). Båda metoderna resulterar i slutna, membranbundna vesiklar i det förväntade storleksintervallet, vilket visas av TEM (figur 3) och NTA (figur 4).
Sammantaget visar dessa data anrikning av Mtb-elbilar i de tidiga SEC-fraktionerna. De högsta NTA-värdena förekommer i fraktionerna 1-3, och proteininnehållet ökar när fraktionsnumret stiger, vilket indikerar separationen av lösliga proteiner från elbilarna (tabell 1). Eftersom fraktion 4 innehåller belägg för GroES (figur 2C, kompletterande figur 1) inkluderades inte denna fraktion i det sammanslagna materialet för TEM. Beroende på tillämpningen i senare led måste man överväga att inkludera eller utesluta specifika fraktioner för poolningsstrategin.
Figur 1: Silverfärg efter fraktion. En SDS-PAGE gel färgad med silver visar den totala proteinprofilen för varje fraktion. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC-fraktioner 1-11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Västra blottar efter fraktion. Western blots detekterar (A) LAM, (B) LpqH och (C) GroES, vilket visar proteinmarkörförändringar över fraktionerna. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC-fraktioner 1-11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Transmissionselektronmikroskopi (TEM) bilder (A) SEC fraktioner 1-3 poolade före fixering. (B) Ultracentrifugeringen av densitetsgradienten för Mtb-elbilar färgades negativt för TEM-avbildning. Skalstänger = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Fördelning av nanopartikelspårningsanalys (NTA). (B) Densitetsgradienten ultracentrifugering Mtb EL-apparater analyserades med nanopartikelspårningsanalys. Storleksfördelningen visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Bråk | Proteinåtervinningsområde (μg/μl) | Partikelåtervinningsområde (per μl) | Resultat Proteinåtervinning (μg /μL) | Resultat partikelåtervinning (per μl) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1E8 - 3E8 | 0.013 | 1.60E+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2E8 - 4E8 | 0.026 | 2.10E+08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2E7 - 6E7 | 0.024 | 5.20E+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7E6 - 2E7 | 0.032 | 1.30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1E6 - 5E6 | 0.053 | 4.20E+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1E6 - 5E6 | 0.099 | 5.20E+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1E6 - 3E6 | 0.234 | 2.70E+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1E6 - 4E6 | 0.398 | 4.20E+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1E6 - 3E6 | 0.543 | 4.10E+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1E6 - 3E6 | 0.661 | 1.70E+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1E6 - 3E6 | 0.736 | 1.40E+06 |
Tabell 1: Protein- och partikelåtervinning per fraktion. Förväntat protein- och partikelåtervinningsintervall per fraktion baserat på 3 mg utgångsmaterial. De exakta värdena för att erhålla materialet som används i denna studie ingår i de två kolumnerna längst till höger.
| Anrikningsmetod | Totalt återvunnet protein (μg) | Totalt antal partiklar som återvunnits |
| Ultracentrifugering av densitetsgradient | 3.14 | 1.82E+10 |
| 3.88 | 1.93E+10 | |
| 3.20 | 1.65E +10 | |
| Storlek uteslutning kromatografi F1-3 | 12.96 | 4.05E+10 |
| 14.14 | 4.15E+10 | |
| 14.74 | 4.35E+10 |
Tabell 2: Metodjämförelse av protein- och partikelåtervinning. Proteinutbyte mätt med BCA och totalt partikelantal mätt med NTA för Mtb elfordon med ursprung i 3 mg av samma 100R utgångsmaterial, berikat med hjälp av den refererade densitetsgradienten ultracentrifugeringsmetod8 eller denna SEC-metod (tre exemplar).
Kompletterande figur 1: Ursprungliga western blots (oklippta) från figur 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mycobacterium tuberculosis extracellulära vesiklar är mycket antigena reservoarer, som presenterar dem som en attraktiv väg för att utveckla diagnostiska verktyg och framtida vacciner 4,19,20. Historiskt sett har ultracentrifugering av densitetsgradient använts för att separera Mtb-elbilar från annat lösligt, utsöndrat material8. Även om denna process är effektiv är den också tidskrävande, tekniskt utmanande och kan påverka integriteten hos de resulterande EV-förberedelserna 9,10. Det presenterade protokollet erbjuder en alternativ metod för Mtb EV-preparat genom storleksuteslutningskromatografi (SEC).
Det finns flera kritiska punkter för framgång i denna metod. Den första Mtb CFP-beredningen kommer att påverka vesiklarnas kvalitet och utbyte efter SEC. Det rekommenderas att den gemensamma fiskeripolitiken skördas vid eller före tillväxtfasen i mitten av stocken för att begränsa nivån av cellulär lys vid skördetidpunkten. Sena log- och stationära tillväxtfaskulturer kan innehålla högre nivåer av celllys och kan resultera i identifiering av intracellulära proteiner och artefaktuella EV-liknande strukturer, spontant genererade från membranfragmenten i de lysade cellerna, som en betydande bidragsgivare till den insamlade CFP 12,13,14 . Detta bör utvärderas innan detta protokoll påbörjas eftersom membranblåsor från lyserade celler kommer att samrena med utsöndrade Mtb-elbilar och potentiella skeva nedströmsanalyser. Försiktighet måste vidtas under ultrafiltrering för att säkerställa att filtermembranet förblir intakt och vått. Skador på filtret kan orsaka att önskat material strömmar igenom. Att inkludera den ursprungliga gemensamma fiskeripolitiken, 100R och 100F på nedströms kvalitetsutvärderingar kommer att hjälpa till med utvärderingen av ultrafiltreringsintegriteten.
Korrekt installation och tvättning av SEC-kolonnen är nödvändig för EV-förberedelse av högsta kvalitet. Följ alltid användarmanualerna för installation och borttagning. Medan fraktioner samlas in, se till att AFC inte stöts eller flyttas eftersom detta kan avbryta processen och leda till överhoppade eller inkonsekventa fraktioner. De antikroppar som används för kvalificering kommer att bero på nedströms appliceringen av de berikade vesiklarna och bör innehålla en markör som förväntas finnas i Mtb-elbilar (LpqH) och en markör som finns i CFP men inte berikad i Mtb-elbilar (GroES). En begränsning för de metoder som presenteras här är potentiell variation i lämpliga proteinkontroller. Detta protokoll har utvecklats med hjälp av standardodlingsmetoder. Arbete som utförts med Mycobacterium avium föreslog att nivåer av chaperoniner som GroES förändras i CFP och ev baserat på det medium som används för tillväxt21. När mer information framkommer om mykobakteriell EV-sammansättning kan det vara nödvändigt att justera den specifika negativa kontrollmarkören.
Slutligen bör alla kvantifierings- och kvalificeringsförfaranden och ansökningar i senare led utföras snabbt. Om materiallagring krävs rekommenderas 4 °C vid frysning för att förhindra störningar i vesikelintegriteten under frys-tö-processen. Om frysning utförs, alikvotera materialet för att undvika upprepade frys-tina cykler. Berikade elbilar bör omvärderas både kvantitativt och kvalitativt om det går en betydande tid mellan den första utvärderingen och användningen.
Denna metod berikar effektivt Mtb elbilar, och det finns flexibilitet för anpassning till andra mykobakterier. När du anpassar denna procedur för andra organismer, se till att startkulturen har begränsad cellulär lys. Mängden material som laddas på kolonnen bör justeras, eftersom kinetiken för EV-frigöring kommer att variera. Överskrid inte en maximal proteinkoncentration på 7 g per 100 ml baserat på tillverkarens specifikationer. Det är också nödvändigt att utvärdera varje fraktion individuellt för förekomsten av EV-associerade markörer och föroreningar. Proteinkoncentration och NTA-data kan vara vilseledande vid metodoptimering: mycket låg proteinkoncentration betyder inte frånvaron av vesiklar i dessa fraktioner. Genom att ändra SEC-kolumner och bråkinsamlingsparametrar kan användaren dessutom skala protokollet baserat på indata- och nedströmsprogram. Begränsningar av denna metod inkluderar kostnaden för AFC och förbrukningsvaror, den utspädda produktionen och, som tidigare nämnts, utvecklingen och optimeringen av fraktionspoolningssystemet. Medan ultracentrifugering av densitetsgradient har sina fördelar och kanske mer tillämpligt för vissa experiment, är anrikning av Mtb-elbilar av SEC jämförbar i kvalitet och överlägsen i åtkomst och användarvänlighet, som presenteras här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill erkänna stöd från College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award och College Research Council Shared Research Program till NKG och finansiering av ATCC (utmärkelse # 2016-0550-0002) till KMD. Vi vill också tacka Anne Simpson för teknisk support och BEI Resources, NIAID, NIH för följande reagenser: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (producerad in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (producerad in vitro), NR-49223 och Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (producerad in vitro), NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization.
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al.
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
