Summary
Denne protokol beskriver størrelsesekskluderende kromatografi, en letkøbt og reproducerbar teknik til berigelse af Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler fra kultursupernatanter.
Abstract
Den rolle, som ekstracellulære vesikler (EV'er) spiller i forbindelse med bakteriel infektion, er opstået som en ny vej til forståelse af mikrobiel fysiologi. Specifikt spiller Mycobacterium tuberculosis (Mtb) elbiler en rolle i værtspatogeninteraktionen og reaktionen på miljøstress. Mtb-elbiler er også meget antigene og viser potentiale som vaccinekomponenter. Den mest almindelige metode til rensning af Mtb-elbiler er densitetsgradient ultracentrifugering. Denne proces har flere begrænsninger, herunder lav gennemstrømning, lavt udbytte, afhængighed af dyrt udstyr, tekniske udfordringer, og det kan påvirke den resulterende forberedelse negativt. Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) er en blidere alternativ metode, der bekæmper mange af begrænsningerne ved ultracentrifugering. Denne protokol viser, at SEC er effektiv til Mtb EV-berigelse og producerer Mtb EV-præparater af høj kvalitet med øget udbytte på en hurtig og skalerbar måde. Derudover viser en sammenligning med densitetsgradient ultracentrifugering ved kvantificerings- og kvalifikationsprocedurer fordelene ved SEC. Mens evalueringen af EV-mængde (nanopartikelsporingsanalyse), fænotype (transmissionselektronmikroskopi) og indhold (Western blotting) er skræddersyet til Mtb-elbiler, kan den leverede arbejdsgang anvendes på andre mykobakterier.
Introduction
Ekstracellulær vesikel (EV) frigivelse af patogener kan være nøglen til at låse op for nye teknologier til bekæmpelse af infektionssygdomme1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) er et patogen med høj konsekvens, der inficerer ca. en tredjedel af verdens befolkning og kræver millioner af menneskers liv hvert år2. Ev-produktion af Mtb er veldokumenteret, men undvigende i biogenesen og forskellige roller (dvs. immunostimulerende, immunosuppressiv, jern- og næringsstofopsamling) af disse elbiler i forbindelse med infektion 3,4,5. Bestræbelser på at forstå sammensætningen af Mtb-elbiler afslørede 50-150 nm lipidmembran-lukkede kugler afledt af plasmamembranen indeholdende lipider og proteiner af immunologisk betydning 3,6. Undersøgelse af Mtb-elbilers rolle i bakteriel fysiologi har afsløret betydningen af bakteriel EV-modulering som reaktion på miljøbelastning for overlevelse5. Værtspatogen-interaktionsundersøgelser har været mere komplicerede at fortolke, men beviser tyder på, at Mtb-elbiler kan påvirke værtens immunrespons og potentielt kan tjene som en effektiv vaccinationskomponent 3,4,7.
De fleste undersøgelser af Mtb-elbiler hidtil har været afhængige af densitetsgradient ultracentrifugering til vesikelberigelse8. Dette har været effektivt for mindre undersøgelser; Denne teknik har dog flere tekniske og logistiske udfordringer. Alternative arbejdsgange kobler flertrinscentrifugering til fjernelse af hele celler og stort affald med et sidste ultracentrifugeringstrin til pellet-elbiler. Denne metode kan variere i effektivitet og resulterer ofte i lavt udbytte og co-oprensning af opløselige ikke-vesikelassocierede biomolekyler, samtidig med at den påvirker vesikelintegriteten9. Derudover er denne proces tidskrævende, manuelt intensiv og meget begrænset i gennemstrømning på grund af udstyrsbegrænsninger.
Den nuværende protokol beskriver en alternativ teknik til densitetsgradient ultracentrifugering: størrelsesekskluderingskromatografi (SEC). Denne metode er demonstreret for miljømykobakterier, og i det aktuelle arbejde er den ekstrapoleret til Mtb10. En kommercielt tilgængelig søjle- og automatisk brøkopsamler kan forbedre konsistensen i vesisk forberedelse og reducere behovet for specifikt, dyrt udstyr. Det er også muligt at fuldføre denne protokol på en brøkdel af tiden sammenlignet med densitetsgradient ultracentrifugering, hvilket øger gennemstrømningen. Denne teknik er mindre teknisk udfordrende, hvilket gør det lettere at mestre og kan øge reproducerbarheden mellem / intralaboratoriet. Endelig har SEC høj separationseffektivitet og er skånsom og bevarer vesiklernes integritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Colorado State University Institutional Biosafety Committee godkendte denne undersøgelse (19-046B). Dyrkning af Mycobacterium tuberculosis og høst af EV-rige kultur supernatants blev udført af uddannet personale i et højindeslutningslaboratorium. Materialerne blev flyttet ud af området med høj indeslutning, efter at en gyldig inaktiveringsmetode blev udført, bekræftet og godkendt af institutionelle biosikkerhedspolitikker. Hvis det ikke er muligt at kopiere protokollen, skal følgende procedurer udføres i et laboratorium med høj indeslutning, hvis valideret inaktivering eller steril filtreringsmetode ikke er mulig.
1. Fremstilling af rå Mtb EV-koncentrat
BEMÆRK: Detaljerede procedurer for dyrkning af Mtb og fremstilling af kulturfiltratprotein (CFP) findes i reference11,12. Det anbefales, at bakteriekulturmedier er fri for væksttilskud med EV-holdige eller proteinholdige komponenter, såsom Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC) og vaskemidler som Tween. Det anbefales også, at bakteriekulturens kvalitet og høstede CFP screenes for at sikre begrænset celledød og lysis13,14.
- Forbered et 100 kDa molekylvægtafskæringscentrifugalfilter (MWCO) (se materialetabel) ved at tilføje den fulde volumenkapacitet af fosfatbufferet saltvand (1x PBS). Centrifuger i 5 minutter ved 2.800 x g ved 4 °C.
BEMÆRK: Hvis der anvendes et filter uden dødt stopvolumen, skal det sikres, at prøvevolumenet ikke reduceres til under filterniveauet, hvilket resulterer i fuldstændig filtertørring under centrifugering. - Gennemstrømningen og eventuelle resterende PBS kasseres, inden prøvekammeret fyldes med Mtb CFP til sin maksimale kapacitet. Der centrifugeres ved 2.800 x g ved 4 °C, indtil volumenet er reduceret til ultrafiltreringsanordningens mindste volumen. Gentag om nødvendigt, og tilføj mere FFP til enheden, indtil hele prøven er reduceret tilstrækkeligt.
BEMÆRK: Behold en del af 100 kDa gennemstrømningsmaterialet (100F) til downstream-kvalifikation, hvis det ønskes. Opbevares ved 4 °C. - Tilsæt 1x PBS til filterenheden, der indeholder koncentratet, op til enhedens samlede kapacitet. Volumen reduceres som beskrevet i punkt 1.2. Gentag dette trin fem gange for at sikre fuldstændig vask og bufferudveksling.
- 100 kDa koncentreret CFP-retentat (100R) genvindes i henhold til specifikationerne for ultrafiltreringsudstyret (se Materialetabel). Når 100R er genvundet, skal du vaske filteret med et minimalt volumen på 1x PBS mindst tre gange og samle vasken med 100R for at maksimere genopretningen.
- Kvantiter 100R-materialet med et bicinchoninisk assay (BCA) efter producentens anvisninger (se materialetabel). For at udføre analysen skal der anvendes flere fortyndinger af prøverne 1:2, 1:5 og 1:10 i PBS. Prøven testes i tre eksemplarer.
BEMÆRK: Opbevar en del af 100R-materialet til downstream-kvalifikation, hvis det ønskes. Opbevares ved 4 °C.
2. Størrelsesekskluderingskromatografi til berigelse af Mtb-elbiler fra den fælles fiskeripolitik
BEMÆRK: Følgende procedure er specifik for anvendelse af 3 mg 100R Mtb CFP med SEC-søjle og automatisk fraktionsopsamler (AFC, se Materialetabel). Den kan tilpasses til andre startkoncentrationer og kolonnetyper ved at følge producentens specifikationer. Derudover anbefales brugerne at læse og forstå brugervejledningen til automatisk brøkopsamler.
- Lad SEC-kolonnen afbalanceres til stuetemperatur.
- Tænd FOR AFC ved hjælp af afbryderen på bagsiden af tårnenheden, og juster indstillingerne for vejecellen, hvis det er nødvendigt, ved at trykke på SETUP på hovedmenuens berøringsskærm. Vejecellen må kun kalibreres ved første brug, efter hver softwareopdatering, og hvis der konstateres inkonsekvens i fraktionsindsamlingsvolumener.
- Juster karrusellen på skærmen OPSÆTNING ved at vælge KARRUSEL > KALIBRER. Indsæt karrusellen med de 13 små huller opad i AFC-tårnet , og juster karrusellen, så væskedysen er direkte over skyllepositionen ved at trykke på knapperne - og/eller + .
- Fjern hætterne fra den ekvilibrerede SEC-kolonne. Skub SEC-søjlen ind i den relevante søjlemontering, og installer den forsigtigt på AFC-tårnet. Sørg for, at RFID-mærket (radiofrekvensidentifikation) på søjlen vender mod AFC, og kontroller, at forbindelsen mellem søjlen og ventilen er sikker. Anbring affaldsudløbsslangen i en opsamlingsbeholder.
- Fra skærmen SETUP skal du vælge Collection Schedule og indstille antallet til 13 og størrelsen til 0,5 ml ved at trykke på knapperne - og/eller + . Lad indstillingen "Buffer Volume" være standard på 2,7 ml, og luk derefter vinduet "Collection Schedule" ved at trykke på X.
- Vælg START KOLLEKTION på startskærmen, og bekræft indsamlingsparametrene ved at vælge JA. Læg 13 mærkede 1,7 ml mikrocentrifugerør med lågene åbne og pegende mod karruselcentret.
- Fremskynd AFC ved at vælge OK, monter derefter søjlebeholderen, og gå videre igen ved at trykke på OK. Vælg muligheden for at tømme kolonnen ved at trykke på JA, og tilføj et kolonnevolumen på 0,2 μm filtreret PBS for at fjerne en eventuel lagerbuffer. Når skylningen er afsluttet, skal du rykke AFC'en frem ved at trykke på OK.
- Placer karruseldækslet over AFC, og tryk på OK. Der fremstilles et kolonnevolumen på 0,2 μm filtreret PBS. Brug en pipette til at fjerne overskydende buffer fra søjlen.
- Der medbringes 3 mg 100R prøve som kvantificeret i trin 1.5 til 500 μL med 1x PBS. 3 mg prøven tilsættes øverst i kolonnen. Advance AFC og lad prøven løbe ind i fritten. Når prøven er helt ind i kolonnen, tilsættes pbs,der er fremstillet i trin 2.6, til beholderen.
- Overvåg kørslen af AFC, mens den først opsamler tomrumsvolumenet og derefter de angivne fraktioner. Når kørslen er afsluttet, og karrusellen vender tilbage til affaldsposition, skal du fjerne dækslet og fjerne fraktionsrørene fra karrusellen. Fraktionerne opbevares ved 4 °C inden kvantificering (trin 3) og kvalificering (trin 4).
- Hvis kolonnen skal genbruges, skal du vælge muligheden for at rense kolonnen ved at trykke på JA; Ellers skal du trykke på NEJ. Følg instruktionerne på AFC.
BEMÆRK: Når kolonnen er vasket, og lagerbufferen er kørt igennem, kan den fjernes, lukkes og opbevares ved 4 °C.
3. Kvantificering af Mtb-elbilerne
- Proteinkoncentrationen for hver fraktion måles ved hjælp af BCA og mikro BCA12.
- For 0,5 ml fraktioner indsamlet fra 3 mg 100R Mtb CFP anvendes mikro-BCA med en 1:3 fortynding for fraktioner nummereret 1-7 af hver prøve i tre eksemplarer.
- For 0,5 ml fraktioner nummereret 5-13 anvendes BCA uden fortynding for hver prøve i tre eksemplarer.
BEMÆRK: Overlapning af assays for fraktioner 5-7 hjælper med at sikre, at alle fraktioner har et læsbart output.
- Kvantiter partikelkoncentrationen for hver fraktion ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (NTA).
- Prøverne fortyndes i 1 ml 1x PBS ved hjælp af følgende foreslåede startforhold; for fraktioner 1-3, brug 1:100, og brug derefter en 1:10 fortynding for de resterende fraktioner.
- Vortex de fortyndede opløsninger og træk derefter prøven i en 1 ml engangssprøjte. Indstil sprøjten i en automatisk sprøjtepumpe, hvis den er tilgængelig.
- Indstil sprøjtepumpen til 30 μL/min, og brug videooptagelsesindstillingerne med en skærmforstærkning på 10-12 og et kameraniveau på 10-12. Juster fokus for hvert eksempel.
- Saml mindst tre videoer ved hver 30 s ved hjælp af et konstant flow.
- Udfør analysen med softwaredetekteringstærsklen indstillet til fem.
BEMÆRK: Det er muligvis ikke muligt at få NTA-data for de seneste fraktioner (>7) uden at ofre signifikant prøvevolumen.
4. Kvalifikation af Mtb-elbiler
- Visualiser den generelle proteinprofil for hver fraktion ved hjælp af en sølvfarvet proteingel.
BEMÆRK: Detaljerede procedurer for SDS-PAGE og sølvplet findes i reference15.- Der tilsættes SDS-prøvebuffer til 10 μL af hver fraktion og 5 μg CFP, 100R og 100F. Kog i 5 minutter ved 100 °C, og læg derefter en 4%-12% Bis-Tris Gel med en molekylvægtstige til polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) (se materialetabel).
- Kør gelen ved hjælp af 1x 2-[N-morpholino]ethanesulfonsyre (MES) løbende buffer (se materialetabel) og en 200 V strøm i 35 min.
- Fjern gelen fra kassetten og fortsæt med sølvfarvning15.
- Evaluer tilstedeværelsen eller fraværet af EV-markører i hver brøkdel efter Western blot.
BEMÆRK: Detaljerede procedurer for Western blotting findes i reference15.- Der køres en SDS-PAGE gel som beskrevet i trin 4.1.1-4.1.2.
- Gelen fjernes fra kassetten, og de opløste proteiner overføres til en 0,2 μm nitrocellulosemembran (se materialetabel) ved at påføre en 50 V strøm i mindst 1 time.
- Udfør Western blot analyse for at evaluere proteiner af interesse. Primære antistoffer mod LpqH, lipoarabinomannan (LAM) og GroES (se materialetabel) anbefales.
- Poolfraktioner baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af markører, alt efter hvad der er relevant for downstream-applikationen.
- Bekræft tilstedeværelsen af intakte vesikler ved transmissionselektronmikroskopi (TEM).
- 15 μL vesikelprøven anbringes ved tilsætning af 15 μL paraformaldehyd af 4 % EM-kvalitet, og den opbevares ved 4 °C natten over.
- Forbered et 200 mesh formvar-carbonbelagt kobber TEM gitter ved at rense overfladen og lave et hydrofilt substrat.
BEMÆRK: Plasmarensning med 95% argon, 5% ilt og 30% plasmaeffekt i 1 min anbefales. - 10 μL af den faste prøve tabes på gitteret, og prøven klæbes i 10 minutter, hvorefter overskydende væske fjernes med filterpapir.
- Flyd gitteret på en dråbe ultrarent vand i 30 s, og tør derefter overskydende væske væk.
- Flyd gitteret på et d% EM-klasse uranylacetatfald i 2 minutter, og fjern derefter overskydende væske.
- Lad gitteret lufttørre helt.
- Billede ved hjælp af en TEM (se Materialetabel) ved 100 kV eller lignende.
BEMÆRK: Andre EV-kvantificerings- og karakteriseringsmetoder bør anvendes baseret på downstream-applikationer. Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles18 bør konsulteres for retningslinjer for at sikre strengheden og reproducerbarheden af alle EV-undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kulturfiltratprotein (CFP) fra Mycobacterium tuberculosis (Mtb) blev koncentreret, kvantificeret, og derefter blev 3 mg materiale påført en størrelsesekskluderende kromatografi (SEC) kolonne. Protein- og partikelkoncentrationerne blev opregnet med henholdsvis BCA og NTA. Forventede intervaller for protein- og partikelgenvinding plus de nøjagtige værdier opnået for disse resultater er rapporteret i tabel 1. Værdier, der er meget højere end disse intervaller, kan indikere problemer med forurening eller kolonneintegritet. Værdierne er væsentligt lavere og peger på problemer i ultrafiltreringstrinnene, og derfor skal gennemstrømningen sammenlignes med den fælles fiskeripolitik og 100R for at afgøre, om der er tale om en vellykket koncentration. En uspecifik proteinsølvplet viser, at senere fraktioner indeholder mere protein og ligner 100R-materialet (figur 1).
Western blots af fraktionerne viser, at lipoarabinomannan (LAM) er til stede på tværs af fraktionerne, med senere fraktioner, der viser lavere intensitetsbånd (figur 2A, supplerende figur 1). 19 kDa lipoprotein LpqH, der vides at være til stede i Mtb ELBILER 3,19, er beriget i de tidligste fraktioner fra SEC (figur 2B, supplerende figur 1). 10 kDa chaperoninproteinet GroES er fraværende i de tidligste fraktioner fra SEC (figur 2C, supplerende figur 1); dette fund stemmer overens med tidligere offentliggjorte undersøgelser vedrørende GroES som et forurenende stof under Mtb EV-berigelse12 og fungerer som en negativ kontrol for Mtb EV-tilstedeværelse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) bekræfter tilstedeværelsen af lukkede, membranbundne vesikler (figur 3A). En sammenligning af Mtb-elbiler adskilt af densitetsgradient ultrafiltrering og denne SEC-metode er rapporteret i tabel 2. SEC giver højere protein- og partikelgenvinding for tre tekniske replikater fra den samme CFP. Disse resultater har været konsistente på tværs af flere partier af den fælles fiskeripolitik (data ikke vist). Begge metoder resulterer i lukkede, membranbundne vesikler i det forventede størrelsesinterval, som det fremgår af TEM (figur 3) og NTA (figur 4).
Alt i alt viser disse data berigelse af Mtb-elbiler i de tidlige SEC-fraktioner. De højeste NTA-værdier forekommer i fraktionerne 1-3, og proteinindholdet stiger, når brøktallet stiger, hvilket indikerer adskillelsen af opløselige proteiner fra elbilerne (tabel 1). Da fraktion 4 indeholder dokumentation for GroES (figur 2C, supplerende figur 1), blev denne brøk ikke medtaget i det samlede materiale til TEM. Afhængigt af downstream-ansøgningen skal det overvejes at medtage eller udelukke specifikke fraktioner til poolingstrategien.
Figur 1: Sølvplet efter fraktion. En SDS-PAGE gel farvet med sølv demonstrerer den samlede proteinprofil for hver fraktion. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC fraktioner 1-11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Western blots efter brøk. Western blots detekterer (A) LAM, (B) LpqH og (C) GroES, der viser proteinmarkørændringer på tværs af fraktionerne. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC fraktioner 1-11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Transmission Electron Microscopy (TEM) billeder. (A) SEC fraktioner 1-3 samlet før fiksering. (B) Densitetsgradienten ultracentrifugering af Mtb-elbiler var negativt farvet til TEM-billeddannelse. Vægtstænger = 200 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Nanopartikel tracking analyse (NTA) fordeling. (A) SEC fraktioner 1-3. (B) Tæthedsgradient ultracentrifugering Mtb elbiler blev analyseret med nanopartikelsporingsanalyse. Størrelsesfordelingen vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Brøk | Protein Recovery Range (μg/μL) | Partikelgenvindingsområde (pr. μL) | Resultat Protein Recovery (μg/μL) | Resultat Partikel Recovery (pr. μL) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1E8 - 3E8 | 0.013 | 1.60E+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2E8 - 4E8 | 0.026 | 2.10E+08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2E7 - 6E7 | 0.024 | 5.20E+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7E6 - 2E7 | 0.032 | 1.30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1E6 - 5E6 | 0.053 | 4.20E+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1E6 - 5E6 | 0.099 | 5.20E+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1E6 - 3E6 | 0.234 | 2,70E+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1E6 - 4E6 | 0.398 | 4.20E+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1E6 - 3E6 | 0.543 | 4.10E+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1E6 - 3E6 | 0.661 | 1.70E+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1E6 - 3E6 | 0.736 | 1.40E+06 |
Tabel 1: Protein- og partikelgenvinding efter fraktion. Forventet protein- og partikelgenvindingsområde pr. fraktion baseret på 3 mg udgangsmateriale. De nøjagtige værdier for opnåelse af det materiale, der anvendes i denne undersøgelse, er inkluderet i de to højre kolonner.
| Berigelse metode | Samlet genvundet protein (μg) | Samlede genvundne partikler |
| Tæthedsgradient ultracentrifugering | 3.14 | 1,82E+10 |
| 3.88 | 1,93E+10 | |
| 3.20 | 1,65E+10 | |
| Størrelsesekskludering kromatografi F1-3 | 12.96 | 4.05E+10 |
| 14.14 | 4.15E+10 | |
| 14.74 | 4.35E+10 |
Tabel 2: Metodesammenligning af protein- og partikelgenvinding. Proteinudbytte målt med BCA og totalt partikelantal målt ved NTA for Mtb-elektriske køretøjer, der stammer fra 3 mg af det samme 100R-udgangsmateriale, beriget ved hjælp af den refererede densitetsgradient ultracentrifugeringsmetode8 eller denne SEC-metode (tredobling).
Supplerende figur 1: Originale Western blots (ubeskårne) fra figur 2. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler er meget antigene reservoirer, som præsenterer dem som en attraktiv vej til udvikling af diagnostiske værktøjer og fremtidige vacciner 4,19,20. Historisk set er densitetsgradient ultracentrifugering blevet brugt til at adskille Mtb-elbiler fra andet opløseligt, udskilt materiale8. Selvom denne proces er effektiv, er den også tidskrævende, teknisk udfordrende og kan påvirke integriteten af de resulterende EV-præparater 9,10. Den præsenterede protokol tilbyder en alternativ metode til Mtb EV-præparater gennem størrelsesekskluderingskromatografi (SEC).
Der er flere kritiske punkter for succes i denne metode. Den indledende mtb-FFP-forberedelse vil påvirke kvaliteten og udbyttet af vesikler efter SEC. Det anbefales, at den fælles fiskeripolitik høstes i eller før vækstfasen midt i logen for at begrænse niveauet af cellelysis på høsttidspunktet. Senlog- og stationære vækstfasekulturer kan indeholde højere niveauer af cellelysis og kan resultere i identifikation af intracellulære proteiner og artefaktuelle EV-lignende strukturer, spontant genereret fra membranfragmenterne af de lysede celler, som en væsentlig bidragyder til den indsamlede CFP 12,13,14 . Dette bør evalueres, inden denne protokol påbegyndes, da membranvesikler fra lysceller vil samrense med udskilte Mtb-elbiler og potentielle skæve downstream-analyser. Der skal udvises forsigtighed under ultrafiltrering for at sikre, at filtermembranen forbliver intakt og våd. Skader på filteret kan få det ønskede materiale til at strømme igennem. Medtagelse af den oprindelige fælles fiskeripolitik, 100R og 100F i forbindelse med kvalitetsevalueringer i efterfølgende led vil bidrage til evalueringen af ultrafiltreringsintegriteten.
Korrekt opsætning og vask af SEC-søjlen er nødvendig for EV-forberedelse af højeste kvalitet. Følg altid brugermanualerne for opsætning og fjernelse. Mens fraktioner indsamles, skal du sikre dig, at AFC ikke stødes eller flyttes, da dette kan afbryde processen og føre til sprunget eller inkonsekvente fraktioner. De antistoffer, der anvendes til kvalificering, vil afhænge af downstream-anvendelsen af de berigede vesikler og bør omfatte en markør, der forventes at være i Mtb-elbiler (LpqH), og en markør, der findes i CFP, men ikke beriget i Mtb-elbiler (GroES). En begrænsning for de metoder, der præsenteres her, er potentiel variation i passende proteinkontroller. Denne protokol er udviklet ved hjælp af standard dyrkningsmetoder. Arbejde udført med Mycobacterium avium antydede, at niveauer af chaperoniner som GroES ændres i CFP og elbiler baseret på det medium, der anvendes til vækst21. Efterhånden som der kommer flere oplysninger om mykobakteriel EV-sammensætning, kan det være nødvendigt at justere den specifikke negative kontrolmarkør.
Endelig bør alle kvantificerings- og kvalifikationsprocedurer og downstreamansøgninger gennemføres hurtigt. Hvis der er behov for materialeopbevaring, anbefales 4 °C frem for frysning for at forhindre forstyrrelser af vesikelintegriteten under fryse-optøningsprocessen. Hvis der udføres frysning, skal materialet aliquot for at undgå gentagne fryse-optøningscyklusser. Berigede elbiler bør revurderes både kvantitativt og kvalitativt, hvis der går lang tid mellem den indledende evaluering og anvendelse.
Denne metode beriger effektivt Mtb-elbiler, og der er fleksibilitet til tilpasning til andre mykobakterier. Når du tilpasser denne procedure til andre organismer, skal du sikre dig, at startkulturen har begrænset cellulær lysis. Mængden af materiale, der er indlæst på søjlen, skal justeres, da kinetikken ved EV-frigivelse vil variere. Overskrid ikke en maksimal proteinkoncentration på 7 g pr. 100 ml baseret på producentens specifikationer. Det er også nødvendigt at evaluere hver fraktion individuelt for tilstedeværelsen af EV-associerede markører og forurenende stoffer. Proteinkoncentration og NTA-data kan være vildledende i metodeoptimering: meget lav proteinkoncentration betyder ikke fravær af vesikler i disse fraktioner. Derudover giver ændring af SEC-kolonner og fraktionsindsamlingsparametre brugeren mulighed for at skalere protokollen baseret på input- og downstream-applikationer. Begrænsningerne ved denne metode omfatter omkostningerne ved AFC og forbrugsstoffer, den fortyndede produktion og som tidligere nævnt udviklingen og optimeringen af fraktionspuljeordningen. Mens tæthedsgradient ultracentrifugering har sine fordele og måske mere anvendelig til visse eksperimenter, er berigelse af Mtb-elbiler af SEC sammenlignelig i kvalitet og overlegen i adgang og brugervenlighed, som præsenteret her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende støtte fra College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award og College Research Council Shared Research Program til NKG og finansiering fra ATCC (pris nr. 2016-0550-0002) til KMD. Vi vil også gerne anerkende Anne Simpson for teknisk support og BEI Resources, NIAID, NIH for følgende reagenser: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produceret in vitro), NR-13792, Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produceret in vitro), NR-49223 og Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produceret in vitro), NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization.
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al.
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
