Summary
В этом протоколе новое шунтирование вены свиньи выполнялось через небольшой разрез в левой грудной стенке без искусственного кровообращения. Было проведено послеоперационное патологоанатомическое исследование, которое показало утолщение интимы.
Abstract
Болезнь венозного трансплантата (ВГД) является основной причиной неудачи аортокоронарного шунтирования (АКШ). Большие животные модели АКШ-ВГД необходимы для исследования механизмов заболевания и разработки терапевтических стратегий.
Для проведения операции мы входим в сердечную камеру через третье межреберье, аккуратно рассекаем внутреннюю молочную вену и погружаем ее в обычный физиологический раствор. Затем правая главная коронарная артерия лечится от ишемии. Сосуд-мишень разрезают, устанавливают шунтирующую пробку и анастомозируют дистальный конец вены трансплантата. Восходящая аорта частично блокируется, а проксимальный конец вены трансплантата после перфорации анастомозируется. Проводится проверка проходимости трансплантатной вены и перевязка проксимальной правой коронарной артерии.
Операция АКШ проводится у мини-свиней для забора левой внутренней молочной вены для использования в качестве сосудистого трансплантата. Сывороточные биохимические тесты используются для оценки физиологического состояния животных после операции. Ультразвуковое исследование показывает, что проксимальный, средний и дистальный конец сосуда трансплантата не закупорены. В хирургической модели турбулентный кровоток в трансплантате наблюдается при гистологическом исследовании после операции АКШ, а в трансплантате наблюдается стеноз венозного трансплантата, связанный с гиперплазией интимы. В исследовании представлены подробные хирургические процедуры для создания повторяемой модели VGD, индуцированной АКШ.
Introduction
Хотя смертность от ишемической болезни сердца значительно снизилась в последние годы, у половины взрослых среднего возраста в Соединенных Штатах ежегодно развиваются симптомы ишемической болезни сердца, а треть пожилых людей умирает от ишемической болезни сердца1. Аортокоронарное шунтирование (АКШ) является эффективным хирургическим методом для улучшения ишемии миокарда и, что более важно, незаменимым хирургическим методом для лечения многососудистой ишемической болезни сердца2. Однако со временем у сосудистых трансплантатов развивается воспаление, гиперплазия интимы и прогрессирующий атеросклероз, что, как известно, приводит к отторжению венозного трансплантата или заболеванию венозного трансплантата (VGD)3. У пациентов после АКШ, если возникает рестеноз, в некоторых случаях может быть заменен только больной кровеносный сосуд2. Пожилые пациенты и дополнительные сопутствующие заболевания затрудняют повторное аортокоронарное шунтирование. Отсрочка или контроль патологических проблем, связанных с пересаженными кровеносными сосудами, является неотложной проблемой, которую необходимо решить. Большие животные модели АКШ-ВГД необходимы для исследования механизмов заболевания и разработки терапевтических стратегий. Исследователи успешно установили модели VGD у мелких и крупных животных, таких как мыши4, крысы5, кролики6 и свиньи7. По сравнению с мелкими животными крупные животные, такие как свиньи, имеют анатомическое строение и физиологические характеристики, сходные с человеческими, и имеют более длительную продолжительность жизни 8,9. Таким образом, крупные животные больше подходят для изучения отдаленных патологических изменений при венозной трансплантатной болезни и для доклинических испытаний лекарств или устройств. Мы и наша сотрудничающая команда успешно применили хирургические методы для создания модели сердечной недостаточности свиней и описали сердечные патологические изменения в этой модели10.
Хирургия АКШ была стандартизирована в клинической практике, но когда она применяется к созданию моделей животных VGD, различия между видами, приобретение оборудования и средств для животных, хирургические операции на животных, а также кормление и уход за животными являются огромными проблемами для исследователей. Как и в клинической практике, подходы к хирургии АКШ, используемые для создания моделей VGD на животных, включают срединную стернотомию11 и левую боковую торакотомию12. Чаще используется срединная стернотомия13,14. Однако такой подход сопряжен с высокими рисками как для людей, так и для животных. В исследовании, опубликованном Thankam et al., две из шести свиней, использованных для моделирования, умерли во время операции15. Высокая модельная смертность увеличивает затраты на исследования и влияет на точность результатов. Ранее исследование показало, что разрез левой грудной стенки возможен, чтобы установить АКШ-индуцированную VGD усвиней 11. Здесь это исследование направлено на описание пошагового протокола для создания воспроизводимой операции для модели VGD, индуцированной АКШ, у мини-пигов, и для оценки фенотипа этой модели. Экспериментальный протокол был совместно разработан кардиохирургической и анестезиологической бригадами. Хирургический подход к левому третьему межреберью определяли по трупам других минипигов в лаборатории перед операцией, а метод анестезии проводили по методу, применяемому в центре16. Для оценки моделей животных были проведены биохимические анализы крови, ультразвуковое исследование и гистологическое исследование.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры ухода и использования лабораторных животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Гуандунского института мониторинга лабораторных животных. Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (8-е изд., 2011 г., Национальный исследовательский совет, США). Хирургическая процедура показана на рисунке 1.
1. Предоперационная подготовка животных
- Случайным образом разделите 10 3-месячных мини-поросят-самцов весом 30-35 кг на фиктивную группу (n = 5) и группу VGD (n = 5).
- Оцените предоперационное и послеоперационное состояние здоровья свиней, используя индекс массы тела (ИМТ). Рассчитайте ИМТ следующим образом:
ИМТ = масса тела (кг)/(длина тела [см] × длина тела [см])
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина тела измеряется от носа свиньи до основания хвоста. - Постите животных в течение 12 ч перед операцией, чтобы избежать аспирации после анестезии. Подготовьте анестезиологические приборы и хирургические инструменты, включая наркозный аппарат, газ, анестезирующие препараты, анестезиологический трубопровод, специальный ларингоскоп и хирургические инструменты, реберный фиксатор, швы, ретрактор щитовидной железы, хирургические щипцы и т. д. Стерилизуйте все инструменты, которые будут использоваться в операции.
2. Подготовка животных к операции
- Взвесьте животных и рассчитайте дозу анестетика. Внутримышечно вводят анестезирующую смесь, содержащую 2 мг/кг тилетамина и золазепама 1:1, 0,2 мг/кг диазепама и 0,02 мг/кг атропина17. Используйте фентанил (50 мг / кг) для интраоперационного обезболивания30.
- Убедитесь, что достигнута надлежащая плоскость анестезии, и вставьте постоянный венозный катетер (20G) в маргинальную ушную вену, чтобы установить доступ к уху. Переложите поросенка на операционный стол и поставьте ее в положение лежа на спине. Обездвижить конечности бинтами и приподнять голову стерильной драпировкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние анестезии контролировалось центральной фиксацией глазного яблока, миозом, потерей зрачкового рефлекса и потерей болевого рефлекса. Частота сердечных сокращений и артериальное давление поддерживались на более низком уровне, чем исходный уровень. Хирург должен контролировать ЧСС, АД и другие параметры при параличе и увеличивать дозу анестетика, если ЧСС увеличивается > 20% по сравнению с исходным уровнем. - Обнажают надгортанник и голосовую щель с помощью ветеринарного ларингоскопа. Выполните интубацию трахеи с помощью трубки 7,0-7,5Fr и подключите ее к дыхательному контуру анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат искусственной вентиляции легких используется для непрерывной вентиляции с положительным давлением с дыхательным объемом 280 мл, соотношением вдох/выдох 1:2, частотой дыхания 20 раз/мин и положительным давлением в конце выдоха (5 см H2O). - Внутривенно вводят векурония бромид (0,1 мг / кг) для расслабления мышц во время хирургических процедур и используют 2% изофлуран для поддержания анестезии при частоте дыхания 16-20 ударов в минуту и дыхательном объеме 10 мл / кг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Векуроний назначают для обеспечения адекватной глубины анестезии у парализованных животных, тем более что доза индукционного препарата и изофлурана находится на нижнем уровне рекомендуемой. - Используйте ветеринарную мазь на глазах свиньи, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Используйте электрические одеяла, чтобы поддерживать температуру тела свиньи на уровне 38 °C ± 5 °C.
- Используйте электрокардиограмму для контроля частоты сердечных сокращений, уровня кислорода в крови и температуры тела.
3. Хирургические процедуры
- Сбрейте левую грудную стенку и нанесите три чередующихся раунда 0,7% йода и 75% спирта, чтобы асептически подготовить операционную область до левого нижнечелюстного угла, вниз до пуповины, слева до задней подмышечной линии и справа до подмышечной впадины. Поместите стерильную хирургическую простыню вокруг операционной области.
- Сделайте электроножом поперечный разрез 7-10 см в третьем левом межреберье и послойно отделите подкожные ткани (рисунок 2А). Костными ножницами удаляют 5-6-сантиметровый сегмент третьего ребра и втягивающим устройством обнажают внутреннюю молочную вену после обнажения третьего реберно-стернального сустава (рис. 2Б).
- Найдите внутреннюю молочную вену вместе с левой внутренней грудной артерией на левой стороне грудины. Выполняют тупое рассечение внутренней молочной вены сосудистыми щипцами.
- Выполняют гемостаз путем электрокоагуляции ветвей левой внутренней молочной вены электрическим ножом. Если гемостаз неполный, используйте перевязку хлопчатобумажной нитью для гемостаза. Перевязывайте и отметьте два конца вены во время забора (рис. 2C).
- Приготовьте физиологический раствор гепарина, добавив 2 мл раствора гепарина натрия и 98 мл физиологического раствора. После удаления вены введите физиологический раствор гепарина в вену для предварительной обработки (рис. 2D). Затем поместите вену в физиологический раствор и сохраните ее для резервного копирования.
- Сделайте аналогичный разрез, как описано выше, и удалите внутреннюю молочную вену в бутафорской группе. Вскрывают перикард, затем закрывают грудную стенку в фиктивной группе. Используйте внутреннюю молочную вену фиктивной группы для патологического контроля без аортокоронарного шунтирования.
- Сделайте разрез ~ 7 см электрическим ножом на перикарде, чтобы обнажить ствол правой коронарной артерии. Подвешивают перикард и пришивают кожу с ипсилатеральной стороны хирургическими швами 1-0 (рис. 2Е). Отделите ствол правой коронарной артерии от окружающих тканей (рис. 2E).
- Обойдите блокирующую ленту под проксимальным концом изолированной правой коронарной артерии возле аорты с помощью проволочного крючка и обработайте миокард тремя циклами 2-минутной ишемии и 5-минутной реперфузией, затягивая и расслабляя блокирующую ленту (рис. 2F). Контролируйте электрическую активность сердца с помощью монитора электрокардиограммы во время предварительного кондиционирования ишемии / реперфузии (рис. 2G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда правая коронарная артерия заблокирована, электрокардиограмма показывает повышенную частоту сердечных сокращений и подъем сегмента ST. - Затяните бандаж, чтобы заблокировать правильный коронарный кровоток. Разрежьте эпикард, покрывающий кровеносные сосуды. Обнажите стенку коронарной артерии и разрежьте продольно кончиком хирургического лезвия о центр передней стенки кровеносных сосудов.
- После разрезания просвета увеличьте разрез ножницами и установите коронарный шунт. Вставьте один конец шунта с катушкой в дистальную коронарную артерию через разрыв. Шунтируйте кровь из коронарных артерий в полый коронарный шунт, чтобы обеспечить чистое операционное поле (рис. 2H).
- Выполните непрерывный шов между внутренней молочной веной и правым коронарным стволом с помощью полипропиленового шва 7-0 (рис. 2I). В середине восходящей аорты окклюзируют левую переднебоковую стенку восходящей аорты полуокклюзионным зажимом.
- Используйте хирургическое лезвие, чтобы сделать небольшой разрез в стенке аорты, где была разрезана адвентиция, вставьте головной конец скользящего стержня на головном конце пуансона в полость аорты через этот разрез, сузьте скользящий стержень наружу, а циркулярный нож над ним отрежет кусок артериальной стенки. Тканевый блок, вырезанный пуансоном, имеет диаметр около 3 мм (рис. 2J).
- Вытащите шунт. Выполните непрерывный шов между внутренней молочной веной и стенкой аорты полипропиленовым швом 6-0 (рис. 2K). Откройте полуокклюзионный зажим.
- Записывают шунтирование ствола правой коронарной артерии проксимальнее места анастомоза с помощью УЗИ. Контролируйте электрическую активность сердца с помощью электрокардиограммы (рис. 2L).
- Вставьте временную дренажную трубку (Fr: 16) в грудную полость, чтобы кровь и жидкости могли стекать. Сшейте разрез перикарда хлопчатобумажной нитью 1-0 и закройте грудную клетку слой за слоем (изнутри наружу: слой плевры, мышечный слой, слой подкожной клетчатки, слой кожи), помещая на каждый слой порошок пенициллина (около 0,5 г). Снимите дренажную трубку после зашивания разреза кожи с помощью хлопчатобумажной нити 1-0.
4. Послеоперационный уход
- Удаляют эндотрахеальную трубку после того, как животные вернутся к спонтанному дыханию. Анестезиолог должен оценить жизненно важные показатели животного (например, частоту дыхания, частоту сердечных сокращений, насыщение кислородом и т. д.) и удалить ЭКГ после того, как животные проснутся и вернутся к спонтанной активности. Отправьте животных обратно в комнату для кормления и поместите фиктивных животных в другой загон в комнате для разведения. Держите животных в тепле электрическим одеялом. Наблюдайте за животными каждый час после операции (не менее 4 раз).
- Кормите животное на следующий день после операции. Добавляйте аспирин (200 мг) 2 раза в день в течение 7 дней в корм для животных, чтобы предотвратить послеоперационный тромбоз и уменьшить боль в ране.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте кормления животных в день операции, чтобы предотвратить аспирацию. - Вводите животному внутримышечную инъекцию пенициллина 1 раз в день в течение 7 дней подряд, чтобы предотвратить послеоперационную инфекцию (14 000 единиц на кг).
5. Ультразвуковое исследование
- После операции АКШ используйте стерильный рукав ультразвукового зонда, чтобы обернуть высокочастотный линейный датчик. Поместите зонд на поверхность венозного трансплантата.
- Отобразите контур трансплантата в режиме двумерного ультразвука, затем перейдите в режим цветного допплера, чтобы обнаружить кровоток в трансплантате.
6. Забор ткани венозного трансплантата
- Соберите 10 мл образца крови из венозного контура ушной вены для биохимического тестирования. (Таблица 1). Центрифугируйте образец крови в концентрации 1000 x g в течение 5 минут и проведите биохимические тесты с помощью автоматического биохимического анализатора.
- Обезболивайте животное, как описано ранее. После подтверждения глубины анестезии вводят 10% хлорид калия 0,5 мл / кг массы тела из краевой вены уха или вены передних конечностей. Затем сделайте 10-сантиметровый срединный разрез грудины электрическим ножом, чтобы собрать трансплантат вены через 30 дней после операции. Зафиксируйте положение тела, как в шаге 2.2., а после стерилизации и размещения драпировки сделайте срединный разрез грудины, чтобы расколоть грудину. Во время разделения избегайте основных кровеносных сосудов и сердца и разделяйте пересаженные кровеносные сосуды слой за слоем.
- Быстро отрежьте крупные кровеносные сосуды, соединяющиеся с сердцем, поместите сердце и восходящую аорту на ледяную крошку и удалите сосудистый мостик трансплантата, соединенную аорту и правую коронарную артерию. Промойте все образцы физиологическим раствором при температуре 4 °C.
- Возьмите весь сосуд трансплантата размером около 3-4 см, разделите его на 4-5 равных частей и перенесите в пробирки для криоконсервации. Быстро поместите пробирки в жидкий азот для мгновенной заморозки и переместите в морозильную камеру со сверхнизкой температурой −80 °C для хранения.
- Для анализа промыть привой ледяным 0,9%-ным физиологическим раствором и зафиксировать в 4%-ном растворе параформальдегида. Выдерживают соотношение размера тканевого блока к фиксирующему раствору 1:10 и фиксируют ткань более 12 ч.
- Окрашивают срезы в 50 мл водного раствора гематоксилина в течение 3 мин. Разделите секции, промыв 50 мл 0,5% соляной кислоты этанола и 50 мл 0,2% аммиачной воды в течение 10 с каждая.
- Промыть проточной водой в течение 1 ч, а затем очистить в дистиллированной воде, замочив на 3 мин. Обезвоживание в 70% и 90% этаноле в течение 10 мин каждый. Поместить в 50 мл 0,5% спиртового раствора для окрашивания эозина на 2-3 мин.
- Обезвоживают окрашенные участки чистым этанолом в течение 10 мин, а затем замачивают в чистом ксилоле на 10 мин, чтобы сделать образцы прозрачными. Промокните прозрачные участки нейтральным клеем и накройте покровным стеклом. Наблюдайте патологические срезы под световым микроскопом при 40-кратном увеличении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ИМТ и сывороточные биохимические показатели
ИМТ между фиктивной и VGD группами достоверно не различался (фиктивный против VGD, 22,05 кг/см2 ± 0,46 кг/см2 против 21,14 кг/см2 ± 0,39 кг/см2, p = 0,46). Биохимические результаты сыворотки крови приведены в таблице 1. Статистически значимые различия между группами были обнаружены по четырем биохимическим показателям, включая аспартатаминотрансферазу (АСТ, фиктивная против ВГД, 25,25 МЕ/л ± 1,88 МЕ/л против 31,5 МЕ/л ± 2,58 МЕ/л), билирубин сыворотки (фиктивный по сравнению с ВГД, 2,5 мкмоль/л ± 0,47 мкмоль/л против 4,5 мкмоль/л ± 0,14 мкмоль/л), общий билирубин (фиктивный по сравнению с ВГД, 0,025 мкмоль/л ± 0,14 мкмоль/л против 0,92 мкмоль/л ± 0,33 мкмоль/л), и креатинин (фиктивный по сравнению с VGD, 92,75 мкмоль/л ± 4,15 мкмоль/л против 141,75 мкмоль/л ± 12,65 мкмоль/л).
Ультразвуковое исследование
Все животные в фиктивной (n = 5) и VGD группах (n = 5) выжили. Хирургические процедуры АКШ показаны на рисунке 1. Среднее время операции составляло 105 мин ± 25 мин (диапазон: 90-160 мин), а средний объем интраоперационного кровотечения составлял 85 мл ± 35 мл (диапазон: 50-200 мл). Влияние времени работы в основном заключается в переходе квалификации оператора от человека к свинье и не имеет особого значения. Средняя продолжительность от анастомоза после разреза до экстубации трахеи составила 17 мин ± 5 мин (диапазон: 15-30 мин). Ультразвуковое исследование показало, что кровоснабжение пересаженного сосуда имело частичную регургитацию по сравнению с нормальной коронарной артерией, а общее направление кровотока было в целом нормальным (рис. 3). Пневмоторакс, тампонада, инфекция или другие серьезные осложнения после операции не наблюдались. Не было обнаружено существенной разницы в весе или ИМТ между фиктивной группой и группой ВГД через 1 месяц после операции.
Ультразвуковое исследование проводили на проксимальном конце (рис. 3A, B), сосудистой полости (рис. 3C, D) и дистальном конце (рис. 3E, F) сосуда трансплантата. Ретроградный поток наблюдался на проксимальном и дистальном концах сосуда трансплантата; Однако экстравазации крови не наблюдалось.
Патологические изменения в венах
Каждый венозный трансплантат был равномерно разделен на три сегмента по длине, и один участок был выбран из каждого сегмента для оценки и классифицирован в соответствии с модифицированной классификацией Proudilit для стеноза коронарных артерий18. Усредненные значения из трех срезов были приняты в качестве результатов для степени окклюзии. Конкретная классификация была следующей: I степень = 0 баллов, нормальная без рестеноза; II степень = 1 балл, стеноз легкой степени <30%; III степень = 2 балла, стеноз от 30% до 50%; IV степень = 3 балла, тяжелый стеноз от 50% до 90%; V степень = 4 балла, субтотальная окклюзия >90%; и степень VI = 5 баллов, полная окклюзия, без притока крови к венозному трансплантату. Для оценки количественных результатов была принята модифицированная классификация стеноза коронарных артерий по методу Proudilit. Результат для фиктивной группы составил 0,00 ± 0,00, что указывает на отсутствие окклюзии сосудов, в то время как результат для группы АКШ составил 3,12 ± 1,22. Таким образом, разница между двумя группами была значимой (p < 0,05, табл. 2).
Под микроскопом, в фиктивной группе, интима оболочка, средняя оболочка и венозная стенка венозного трансплантата казались нормальными. В группе VGD интима и средняя оболочка венозных трансплантатов были значительно утолщены через 30 дней после операции АКШ. Интима туника была неоднозначно разграничена от медиа-туники. Эластичный слой среды оболочки исчез (рис. 4). Просвет венозного трансплантата был заполнен гиперпластическими тканями (рис. 4). Существенных изменений диаметра сосуда не наблюдалось.
Рисунок 1: Схема процедуры. (А-С) Перед операцией: взвесьте мини-пигов, проверьте работоспособность дефибриллятора и аппарата искусственной вентиляции легких и подсоедините вентиляционную трубку. (Д-Ж) Анестезия: Введите внутримышечную инъекцию анестезии минипигам, зафиксируйте минипигу на операционном столе, полностью обнажив дыхательные пути для интубации трахеи, подключите аппарат искусственной вентиляции легких и используйте ингаляционную анестезию для поддержания анестезии. (Г-И) Во время операции: Проведите предоперационную ультразвуковую оценку сердечной функции у минипигов и полное аортокоронарное шунтирование через разрез левой грудной стенки. (Ж-Л) После операции: Анастомозируйте раны и обратите внимание на послеоперационный уход и кормление мини-свиней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Хирургическая процедура. (A) Разрезать грудную стенку, (B) изолировать внутреннюю молочную вену, (C) удалить внутреннюю молочную вену, (D) выполнить предварительное кондиционирование гепарина, (E) приостановить перикард, (F) выполнить реперфузию ишемии миокарда, (G) контролировать изменения ЭКГ, (H) блокировать коронарный кровоток, (I) анастомозировать проксимальный конец сосуда трансплантата, (J ) место дистального коронарного анастомоза, (K) анастомозы дистальнее коронарных артерий, (L) полное аортокоронарное шунтирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Ультразвуковое исследование. После завершения аортокоронарного шунтирования проходимость кровотока пересаженного сосуда оценивается с помощью УЗИ. (А, С, Е) Изображения нормального коронарного кровотока. Непрерывные сигналы кровотока видны на (B) проксимальном, (D) среднем и (F) дистальном концах трансплантированных сосудов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистологический анализ . (A) Нормальный патологический срез внутренней вены молочной железы показал четкую сосудистую иерархию и отсутствие стеноза просвета. (В,В) Патология внутренней молочной вены через 30 дней после трансплантации коронарной артерии показала, что интима сосуда была утолщена в разной степени, а просвет явно сужен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Показатели | Фиктивная группа (n=5) | Группа трансплантатов (n=5) |
| АЛТ (МЕ/л) | 46 ±5.11 | 47.75±7.88 |
| АСТ (МЕ/л) | 25.25 ±1.88 | 31,5±2,58* |
| Общий белок (МЕ/л) | 63.12 ±.138 | 60.17±1.91 |
| Альбумин (МЕ/л) | 32.25 ±0.77 | 23.77±5.61 |
| Глобулин (г/л) | 30.87 ±.136 | 36.4±6.03 |
| Билирубин сыворотки (мкмоль/л) | 2,5 ±0,47 | 4,5±0,14* |
| Общий билирубин (мкмоль/л) | 0,025 ±0,14 | 0,92±0,33* |
| Щелочная фосфатаза (МЕ/л) | 103 ±19,3 | 104±16.04 |
| Глюкозамин (ммоль/л) | 4.44 ±0.36 | 5,96±0,42 |
| Азот мочевины (ммоль/л) | 2,46 ±0,17 | 2,89±0,65 |
| Креатинин сыворотки мкмоль/л | 92.75 ±4.15 | 141,75±12,65* |
| Общий холестерин (ммоль/л) | 2,37 ±0,12 | 2.16±0.06 |
| Триглицериды (ммоль/л) | 0,48 ±0,10 | 0,25±0,05 |
| Липопротеины высокой плотности, ммоль/л | 1,05 ±0,07 | 1.03±0.07 |
| Липопротеины очень низкой плотности (ммоль/л) | 1,43 ±0,06 | 1,29±0,04 |
| Лактатдегидрогеназа (ммоль/л) | 384,75 ±26,8 | 478.25±49.58* |
Таблица 1. Сывороточные биохимические показатели. Для анализа использовалось программное обеспечение статистического анализа. Данные были выражены как среднее ± стандартной погрешности (n = 5). Сравнения данных измерений анализировались с помощью t-критерия Стьюдента. Значение p менее 0,05 указывает на статистическую значимость. *p < 0,05, АКШ против фиктивного.
| Классификация Proudilit | ||||||
| S. No образца | Оценка сразу после операции АКШ | Оценка через 30 дней после операции АКШ | ||||
| 1 | 0, 0, 0 | 2, 2, 2 | ||||
| 2 | 0, 0, 0 | 1, 2, 2 | ||||
| 3 | 0, 0, 0 | 2, 3, 2 | ||||
| 4 | 0, 0, 0 | 3, 2, 2 | ||||
| 5 | 0, 0, 0 | 2, 1, 2 | ||||
Таблица 2. Статистические результаты окклюзии трансплантата сразу после операции и через 30 дней после операции. Для степени окклюзии сосудов использовалась модифицированная классификационная шкала Proudilit: I степень = 0 баллов, норма без рестеноза; II степень = 1 балл, стеноз легкой степени <30%; III степень = 2 балла, стеноз от 30% до 50%; IV степень = 3 балла, тяжелый стеноз от 50% до 90%; V степень = 4 балла, субтотальная окклюзия >90%; и степень VI = 5 баллов, полная окклюзия, без притока крови к венозному трансплантату. Данные включают результаты пяти венозных трансплантатов, равномерно разделенных на три секции по длине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы подробно описали протокол отбора животных, подготовки инструментов, хирургических процедур и послеоперационной оценки при разработке модели VGD, индуцированной АКШ. Мы провели ультразвуковое исследование венозного трансплантата до и после операции АКШ и гистологическое исследование трансплантата через 30 дней после операции. Кровоток во внутренней молочной вене был нормальным до операции АКШ, в то время как ретроградный поток наблюдался в трансплантате внутренней молочной вены. По сравнению с фиктивной операционной группой, функция печени и почек животных в операционной группе была в определенной степени повреждена. Учитывая возникновение ишемической болезни сердца, ослабление сократимости миокарда приводило к недостаточной перфузии периферических тканей. Венозный трансплантат показал гиперплазию интимы и ремоделирование сосудов через 30 дней после операции АКШ (рис. 4). Фиброзные изменения вокруг кровеносных сосудов связаны с заживлением ран, пролиферация фибробластов происходит в начале заживления ран с 1-го по 3-й день 19, выработка активного коллагена и фибронектина I типа происходит с 4-го по 6-й день, а агрегация цитоплазматической α-SM актиновой фибриллы происходит с 7-го по 14-й день19. Стрессовые волокна подразумевают образование миофибробластов, что совпадает с сокращениемраны 20. Неясно, влияет ли периваскулярный фиброз на результаты хирургического вмешательства.
Здесь мы выбрали мини-пигов, чтобы создать модель заболевания венозного трансплантата. В то время как мелкие животные, такие как крысы, использовались для изучения патологических механизмов VGD21, свиньи похожи по размеру, анатомии и физиологии на человека и, следовательно, больше подходят для изучения патогенеза сердечных заболеваний человека или в качестве инструмента для разработки устройств22. Внутренние молочные вены также часто выбираются в качестве трансплантатов клинически. Клинические исследования, проведенные в двух независимых группах, показали, что внутренние трансплантаты вен имеют характеристику высокой частоты поражения венозного трансплантата, и такие же патологические изменения наблюдались в нашем исследовании (рис. 4)23,24. Как и в клинической практике, выбор соответствующего хирургического подхода в хирургии животных имеет решающее значение для успеха операции; здесь мы ссылались на левую торакотомию Хокума11. Мы обнаружили, что левая торакотомия могла четко обнажить операционное поле, анатомию вокруг разреза было легко идентифицировать, а количество кровотечений было низким. Кроме того, по сравнению со срединной торакотомией, латеральная торакотомия не требует распиливания грудины, поэтому хирургическое напряжение может быть уменьшено.
Анестезия имеет решающее значение для успеха хирургической модели. В этом исследовании протокол был изменен по сравнению с Kotani et al., при этом комбинация кетамина и диазепама использовалась в качестве индукции анестезии, а ингаляция изофлураном - в качестве поддерживающей анестезии25. Кроме того, исследовательская группа показала, что внутривенные препараты также подходят для поддерживающей анестезии26. Эндотрахеальная интубация у свиней может быть затруднена для хирургической бригады животных. По сравнению с дыхательными путями человека, анатомия трахеи свиней затрудняет воздействие голосовой щели27. Здесь, чтобы лучше обнажить голосовую щель, мы надавили на верхнюю челюсть свиньи, чтобы помочь обнажить голосовую щель свиньи (рис. 1D). С другой стороны, использование прямой ларингоскопии или волоконно-оптической бронхоскопии поможет визуализировать голосовую щель при эндотрахеальной интубации28.
Патологическое состояние венозной трансплантатной болезни в основном делится на три стадии: 1) острая стадия (в течение 1 месяца) тромбоза; 2) подострая стадия (1-12 месяцев) гиперплазии интимы; 3) поздняя стадия (более 12 месяцев) формирования атеросклероза, являющегося причиной стеноза и окклюзии трансплантата29. Большая часть изменений в острой фазе ВГД связана с операционными факторами, а атеросклероз, сформировавшийся в поздней стадии, необратим. Изучение подострого утолщения эндометрия очень важно для патогенеза, лечения и профилактики ВГД. Также важно, чтобы выбранные сосуды трансплантата отличались от вертикальных сосудов большой подкожной вены. Внутренняя молочная вена обычно выдерживает меньшее гидростатическое давление, и патологические изменения после трансплантации протекают быстрее, чем для большой подкожной вены. В нашей модели типичная гиперплазия интимы, закупоривающая просвет трансплантированного сосуда, наблюдалась при гистологическом исследовании через 30 дней после операции, и такие же патологические изменения наблюдались в других клинических исследованиях23,24. Результаты моделирования выделения внутренней молочной вены у минипигов стабильны по фенотипу, время моделирования короткое, а степень редукции патологических изменений ВГД высокая, что способствует развитию последующих исследований.
Модель также имеет некоторые ограничения. Некоторые тонкие операции в процессе моделирования крупных животных, интраоперационный мониторинг показателей жизнедеятельности животных и послеоперационная реанимация требуют определенного практического опыта, что требует профессиональных хирургов и анестезиологов для руководства обучением и значительного снижения случайной смертности животных. Хирургия крупных животных требует специальных экспериментальных площадок, профессионального персонала и достаточной финансовой поддержки, что может быть более тяжелым бременем для небольших институтов.
В заключение, под руководством профессионалов хорошо оборудованные лаборатории могут дополнительно изучить патологические изменения ВГД, установив эту мини-модель ВГД, которая имеет большое значение для лечения ВГД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Гуандунский институт мониторинга лабораторных животных за техническую поддержку, уход за животными и сбор образцов. Они также благодарят компанию Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd за техническую поддержку в ультразвуковом исследовании. Эта работа была поддержана Гуандунской научно-технической программой, Китай, и Проектом фундаментальных научных исследований центральных университетов Цзинаньского университета (2017A020215076, 2008A08003 и 21621409).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aortic Punch | Medtronic Inc. , America | 3.0mm, 3.5mm, 4.0mm | Used for proximal coronary bridge anastomosis |
| Automatic biochemical analyzer | IDEXX Laboratories, Inc. America | Catalyst One | |
| Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit | LANDANGER, France | ||
| Cardiogram monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd | MEC-1000 | |
| Coronary Shunt | AXIUS | OF-1500, OF-2500, OF-3000 | The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis. The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis. |
| Defibrillator | MEDIANA | Mediana D500 | |
| Diazepam | Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China | H37023039 | Narcotic inducer |
| Disposable manual electric knife | Covidien, America | E2516H | |
| Electric negative pressure suction machine | Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd | YX932D | |
| Esmolol | Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD | H20055990 | Emergency drugs |
| Ice machine | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Lidocaine | Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD | H51021662 | Emergency drugs |
| Luxtec headlight system | Luxtec, America | AX-1375-BIF | Used for lighting fine parts during operation |
| Medical operation magnifier (glasses) | Germany Lista co, LTD | SuperVu Galilean 3.5× | Used for fine site operation during operation |
| Multi-function high-frequency electrotome | Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd | GD350-B | |
| Nitrogen canister | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture) | Johnson & Johnson, America | 6-0, 7-0 | Used to suture blood vessels. |
| Nonabsorbable suture (cotton thread) | Covidien, America | 1-0 | Used for skin and muscle tissue tugging |
| Open heart surgery instrument kit | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD | ||
| Propofol injection | Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD | H19990282 | Anesthetic sedative |
| Refrigerator | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Respiratory anesthesia machine for animal | Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China | R620-S1 | |
| Semi-occlusion clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZL1701RB | Temporarily cut off the aortic flow |
| vecuronium bromide | Richter, Hungary | JX20090127 | Muscle relaxant |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips, Netherlands | CX50 | |
| Zoletil | Virbac, France | Zoletil 50 | Animal narcotic |
References
- Lloyd-Jones, D., et al. Executive summary: Heart disease and stroke statistics--2010 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 121 (7), 948-954 (2010).
- Taggart, D. P. Contemporary coronary artery bypass grafting. Frontiers of Medicine. 8, 395-398 (2014).
- Wolny, R., Mintz, G. S., Pregowski, J., Witkowski, A. Mechanisms, prevention and treatment of saphenous vein graft disease. The American Journal of Cardiology. 154, 41-47 (2021).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 30 (3), 451-463 (2006).
- Suggs, W. D., et al. Antisense oligonucleotides to c-fos and c-jun inhibit intimal thickening in a rat vein graft model. Surgery. 126 (2), 443-449 (1999).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: Adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), H240-H245 (2004).
- O'Brien, J. E., et al. Early injury to the media after saphenous vein grafting. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (5), 1273-1278 (1998).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. The American Journal of Pathology. 153 (4), 1301-1310 (1998).
- Klyachkin, M. L., et al. Postoperative reduction of high serum cholesterol concentrations and experimental vein bypass grafts. Effect on the development of intimal hyperplasia and abnormal vasomotor function. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 108 (3), 556-566 (1994).
- Tan, W., et al. A porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727 (2021).
- Hocum Stone,, L, L., et al. Magnetic resonance imaging assessment of cardiac function in a swine model of hibernating myocardium 3 months following bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (3), 582-590 (2017).
- Gedik, N., et al. Proteomics/phosphoproteomics of left ventricular biopsies from patients with surgical coronary revascularization and pigs with coronary occlusion/reperfusion: Remote ischemic preconditioning. Scientific Reports. 7 (1), 7629 (2017).
- Tsirikos Karapanos,, N,, et al. The impact of competitive flow on distal coronary flow and on graft flow during coronary artery bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 12 (6), 993-997 (2011).
- Meng, X., et al. Competitive flow arising from varying degrees of coronary artery stenosis affects the blood flow and the production of nitric oxide and endothelin in the internal mammary artery graft. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the. 43 (5), 1022-1027 (2013).
- Thankam, F. G., et al. Association of hypoxia and mitochondrial damage associated molecular patterns in the pathogenesis of vein graft failure: A pilot study. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. , 38-52 (2021).
- Li, X., et al. A surgical model of heart failure with preserved ejection fraction in Tibetan minipigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 180 (180), 63526 (2022).
- Rueda, A. lcalá, I,, et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology: Official Journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies (EUFOS): Affiliated with the German Society for Oto-Rhino-Laryngology - Head and Neck Surgery. 278 (8), 3081-3090 (2021).
- Proudfit, W. L.
- Clark, R. A. Regulation of fibroplasia in cutaneous wound repair. TheAmerican Journal of the Medical Sciences. 306 (1), 42-48 (1993).
- Darby, I., Skalli, O., Gabbiani, G. Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing. Laboratory Investigation. 63 (1), 21-29 (1990).
- Sterpetti, A. V., et al. Formation of myointimal hyperplasia and cytokine production in experimental vein grafts. Surgery. 123 (4), 461-469 (1998).
- Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 153 (153), (2019).
- Langille, B. L., O'Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231 (4736), 405-407 (1986).
- Zwolak, R. M., Adams, M. C., Clowes, A. W. Kinetics of vein graft hyperplasia: Association with tangential stress. Journal of Vascular Surgery. 5 (1), 126-136 (1987).
- Kotani, K., et al. A subacute hypoxic model using a pig. Surgery Today. 35 (11), 951-954 (2005).
- Liu, D., et al. Comparison of ketamine-pentobarbital anesthesia and fentanyl-pentobarbital anesthesia for open-heart surgery in minipigs. Lab Animal. 38 (7), 234-240 (2009).
- Geovanini, G. R., Pinna, F. R., Prado, F. A., Tamaki, W. T., Marques, E. Standardization of anesthesia in swine for experimental cardiovascular surgeries. Revista Brasileira de Anestesiologia. 58 (4), 363-370 (2008).
- Alhomary, M., Ramadan, E., Curran, E., Walsh, S. R. Videolaryngoscopy vs. fibreoptic bronchoscopy for awake tracheal intubation: A systematic review and meta-analysis. Anaesthesia. 73 (9), 1151-1161 (2018).
- Parang, P., Arora, R. Coronary vein graft disease: Pathogenesis and prevention. Canadian Journal of Cardiology. 25 (2), e57-e62 (2009).
- Egan, T. D., et al. Fentanyl pharmacokinetics in hemorrhagic shock: a porcine model. Anesthesiology. 91 (1), 156-166 (1999).
